Técnica de laboratorio

1. MÉTODO DE BIURET PARA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS
Muestra
Proteínas en homogenato: 0,1 g de hígado + 1 ml de PBS o del buffer que corresponda.
Centrifugado a 10.000 rpm por 10 min a 4 ºC.
Realizar dilución ½.
Proteínas en suero: dilución 1/10
Proteínas totales de hígado: emplear el pellet remanente de la extracción de lípidos y preparar dilución 1/10.
Materiales
-Tubos de hemólisis.
-Matraces
-Micropipetas.
-Papel aluminio.
-Hielo.
Reactivos
- Buffer PBS pH 7,4: K3PO4 30 mM KCl 120 mM
KH2PO4 0,326 g
K2HPO4 0,627 g
KCl 1,789 g
Llevar a 200 ml pH 7,4.
Ajustamos el pH con solución de KOH.
- Testigo de albúmina 10 mg/ml. Preparar 5 ml, con agua fría para evitar espuma. Albumin from bovine serum (BSA o
Fraction V): SIGMA A 4503.
10mg _____________1ml
50mg = x___________5ml
- Reactivo de Biuret
1,5 g SO4Cu x 5 H2O.
6 g tartrato de Na y K (cristalino).
300 ml NaOH 10% (30,3 g de NaOH).
Llevar 1 L con H2O.
Procedimiento
Tubo (ml) T1 T2 T3 T4 T5 Muestra Blanco
Testigo 0,05 0,1 0,15 0,20 0,25 - -
Muestra (en dilución
apropiada)
- - - - - 0,25 -
AD o buffer 0,2 0,15 0,1 0,05 - - 0,25
Rvo Biuret 1 1 1 1 1 1 1
Cant. Prot. (mg) 0,5 1 1,5 2 2,5 ? 0
Concentración
(mg/ml)
2 4 6 8 10 ? 0
Volumen final 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25
Incubar 30 min.
Leer absorbancia a 550 nm.
Cálculo
Abs.M x factor x inv dilM= concentración de proteínas (mg/ml)
0,250 ml (vol muestra)

2. Factor= [Σcontenido de proteínas (mg)T] /n
[ΣAbsT]
Resultados: mg/ml; mg proteínas/g tejido