Este documento presenta un protocolo para la extracción de ADN a partir de sangre total utilizando el método de salting-out. El procedimiento implica la lisis de glóbulos rojos y células mediante buffers específicos, precipitación de proteínas y posterior precipitación del ADN con isopropanol, el cual es lavado con etanol al 70% y resuspendido en buffer TE para su almacenamiento.

1. TEMA:
EXTRACCION DELADN EN SANGRE
INTEGRANTES:
JOEL FREIRE
STEEVEN BOSQUEZ
RONALD PIGUAVE
LUIS ROJAS
BYRON CARVAJAL
DOCENTE:
Ing. ORLY CEVALLOS
ASIGNATURA:
BIOLOGIA MOLECULAR
CURSO:
CUARTO “A”
AÑO LECTIVO:
2017-2018

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Las características de un organismo están especificadas en su información genética, la cual
está representada como una secuencia de ácidos nucleicos, donde la suma total de esta
secuencia es lo que conforma su genoma.
Quizás de los procedimientos en biología molecular, el más básico es la purificación de
ácidos nucleicos, en la forma de ADN o ARN. Por lo tanto se requieren métodos seguros
para la separación de estos componentes de las células. Para lograr esto, se utilizan
diversos métodos de extracción dependiendo del tipo de tejido a emplear, fresco, seco o
congelado.
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INTRODUCCION

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El primer paso en cualquier protocolo de separación es el rompimiento del
material inicial, ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El
método utilizado para romper la célula debe ser tan leve como sea posible
con el fin de causar el menor daño posible al ADN. La lisis celular se puede
hacer por acción mecánica, pulverizando el tejido con hielo seco o nitrógeno
líquido, también se puede utilizar la degradación enzimática de la pared
celular (si está presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares.
Seguido al rompimiento celular la mayoría de métodos involucran una
desproteinización, lo cual se lleva a cabo con un solvente orgánico, seguido
de una precipitación con isopropanol o etanol y posterior solubilización con
agua o tampón.

4. • Técnica de tipo inorgánica
• Utiliza reactivos bajos en toxicidad
• Permite visualizar la malla del ADN.
Desventajas: Requiere una mayor
cantidad de muestra.
METODO DE SALTING-OUT

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Materiales y Equipos
 Tubos vacutainer con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para obtención de
sangre total (5 ml por mesa)
 Tubos Falcon de 15 mL y Eppendorf estériles de 1.5 mL
 Micro pipetas
 Puntas estériles
 Vortex
 Centrifuga con rotor para tubos de 15 mL y Micro centrifuga para viales de 1.5 mL
 Guantes
 Agua desionizada estéril
 Baño de agua a 37º C
 Isopropanol
 Etanol 70%
 Cloruro de amonio
 Bicarbonato de potasio
 EDTA
 SDS
 Acetato de amonio

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PREPARACION DE REACTIVOS
Se utiliza el protocolo Salting out preparando los siguientes reactivos:
·Buffer de lisis de glóbulos rojos (100 mL):
0.83 g de Cloruro de Amonio
0.1 g de Bicarbonato de Potasio
0.2 mL de EDTA 0.5 M pH 8.0
80 mL de agua destilada estéril
Mezclar en un Erlenmeyer con magneto hasta homogenización
completa.
Completar a 100 ml con agua destilada estéril.
Autoclavar.
Almacenar a 4ºC.

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· Buffer de lisis celular (100 ml):
5 ml de EDTA 0.5 M pH 8.0
20 ml de SDS 10%
60 ml de agua destilada estéril
Mezclar cuidadosamente (evitando la formación de espuma) en un erlenmeyer
hasta homogenización completa.
Completar a 100 ml en una probeta con agua destilada estéril.
No Autoclavar.
Almacenar a temperatura ambiente
PREPARACION DE REACTIVOS

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PREPARACION DE REACTIVOS
• Solución precipitante de proteínas (50 ml):
38,54 g de Acetato de Amonio
10 ml de agua destilada estéril
Mezclar en un Erlenmeyer usando magneto hasta completa homogenización.
Puede requerir calentamiento ligero.
Completar a 50 ml con agua destilada estéril.
Autoclavar
Almacenar a 4ºC.

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· Solución de rehidratación 10 ml :
TE Preparar :
 TRIS 1 M pH 8.0 100ml PM 121.1g
 EDTA 0.5 M pH 8.0 100ml
Y a partir de estos hacer la mezcla TE y dilución correspondientes
(Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM)
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PREPARACION DE REACTIVOS

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1. En un tubo de 15 mL, medir 8 mL de Buffer de lisis de glóbulos
rojos y sobre este adicionar con una pipeta de Pasteur 2 mL de
sangre total. Con la misma pipeta mezclar muy bien y con mucha
suavidad hasta lograr una completa homogenización.
PROCEDIMIENTO

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2. Por inversión agitar muy suavemente durante 7 minutos a
temperatura ambiente.
3. Centrifugar a 3000 R.P.M. durante 8 minutos.
PROCEDIMIENTO

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4. Descartar el sobrenadante y conservar el pellet.
5. Mezclar con una pipeta Pasteur muy suavemente el pellet en el
líquido residual.
PROCEDIMIENTO

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6. Adicionar 2.5 ml de Buffer de lisis celular y mezclar varias veces,
hasta homogenizar. Dejar al menos 20 minutos a temperatura
ambiente. (En este paso se puede suspender el procedimiento,
incluso hasta el día siguiente, dejando los tubos a 4ºC).
PROCEDIMIENTO

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7. Adicionar 800 μl de solución precipitante de proteínas. Mezclar
fuerte, hasta observar grumos de las proteínas precipitadas.
8. Centrifugar a 4000 R.P.M. durante 10 minutos.
PROCEDIMIENTO

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9. Verter todo el sobrenadante sobre un tubo de 15 mL que contenga
2,4 Ml de isopropanol frío (alcohol isopropílico), dejar en reposo al
menos unos 5 minutos.
10. Mezclar cuidadosamente por inversión hasta precipitar el ADN.
PROCEDIMIENTO

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11. Envolver el ADN en una pipeta y pasarlo rápidamente por etanol
al 70% frío, dejar secar a temperatura ambiente y resuspender
finalmente en buffer TE (Tris-HCL 10 mM EDTA 1mM) de 50-500
μl, dependiendo de la cantidad de ADN recuperado. Nota: El ADN
se puede recuperar tomándolo con pipeta Pasteur y centrifugando a
10.000 rpm por 5 min y lavar con 200 μl etanol al 70%.
PROCEDIMIENTO

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