1. Área de Biotecnología de la
Reproducción Animal
Facultad de Veterinaria
2011
Área Biotecnología de la Reproducción – Departamento de Reproducción Animal
2.
3.
4. 1989: primeros terneros nacidos por FIV en
Latinoamérica… (amplia difusión)
7. Día Etapas
Semana Preparación del laboratorio Desinfección de superficies;
previa al esterilización de materiales; preparación
trabajo de soluciones stock
0 Colecta de ovarios Transporte en solución salina a 37ºC
Aspiración de los COC (Complejos Medio de aspiración: Solución m-PBS
ovocito cúmulus) (Buffer Fosfato Salino modificado: D-PBS
(+) + SFb + Atb)
Recuperación y clasificación de los Bajo lupa estereoscópica
COC
Maduración In Vitro Medio de maduración: TCM-199 + SFb +
LFb + Atb
1 Capacitación del semen y dilución Medio BO de capacitación y lavado de
semen; medio BO de dilución de semen
(ajuste a concentración deseada)
Fecundación In Vitro Gotas en placas de Petri pequeñas
Desarrollo In Vitro Medio de desarrollo: CR1aa
3 Clivaje Evaluación de división celular a las 48 hs
4 - 10 Evaluación de desarrollo y cambio Cada 48 horas
de medio
8. De animales muertos: material de matadero o
hembras recién muertas
Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm
de diámetro)
Desmenuzamiento del ovario (slicing)
De hembras vivas
OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía
Aspiración con aguja y endoscopía
Laparotomía (usada sólo en casos especiales)
17. Calidad Características a evaluar
A Bueno Completamente rodeado por más de 3 capas de
células del cúmulus y citoplasma homogéneo
B Regular Rodeado parcialmente por células del cúmulus
C Malo Desnudo y citoplasma irregular
D Degenerado Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña)
(Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)
18.
19. Medio de maduración: M-TCM-199
(TCM-199 de maduración)
Consiste en:
TCM-199 (solución stock)
Penicilina – Estretomicina
SFb (suero fetal bovino)
LFb (licor folicular bovino)
LFb: se obtiene de folículos preovulatorios, de más de 8 mm de diámetro, y se
transfiere a tubos de centrifuga. Se centrifuga a 800 G (2.500 rpm) durante 30
minutos. Se decanta. El liquido sobrenadante se inactiva en baño Maria a 56 ºC
durante 30 minutos; se fracciona en tubos pequeños o crioviales y se almacena
congelado.
20. m-PBS m-PBS M-TCM-199 M-TCM-199
GOTAS DE
MADURACIÓN
M-TCM-199
CUBIERTAS CON
ACEITE
MINERAL
22 hs
cultivo
Caja de Petri numerada con gotas de maduración,
cubiertas con aceite mineral (3 gotas de 100 µ)
21.
22. Preparación citoplasmática
Preparación nuclear
Retoma la meiosis. Desde Profase I (estado de
latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la
Metafase II.
Formación del primer cuerpo polar
Expansión de las células del cúmulus
23. Ovocito Primario Profase de la Meiosis I
(pausa = dictioteno)
Maduración citoplasmática y nuclear
Ovocito Secundario Metafase de la Meiosis II
Fertilización
Completa la Meiosis
24. Ovocitos inmaduros
•OVOCITOS MADUROS
•Expansión de células del
cúmulus
• 1º cuerpo polar
• Metafase II
25.
26. La capacitación permite:
Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus
oviductal
Penetrar el cúmulus
Prepararse para la reacción acrosómica
Bioquímica de la capacitación:
Aumento del pH
Aumento de la permeabilidad al calcio
Fusión de membranas
Interacciones con glucosaminoglicanos
Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos
30. COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant):
Solución A
NaCl 2,1546 g Solución B
KCl 0,0987 g NaHCO3 1,2937 g
Na2PO42H2O 0,0420 g Rojo Fenol 20 µl
MgCl26H2O 0,03485 g Agua ultrapura hasta 100 ml
CaCl22H2O 0,1085 g
Rojo Fenol (0,5%) 50 µl La solución B se burbujea con CO2
Agua ultrapura hasta 500 ml
COMPOSICIÓN DEL MEDIO BO:
Solución A 76 ml
Piruvato de Sodio 0,01375 g
Penicilina 10.000 UI
Estreptomicina 10 mg
Solución B 24 ml
31. Lavado de semen
BO + Cafeína + Heparina
Lavado de ovocitos
BO + BSA (albúmina de suero bovino) (10 mg/ml)
Dilución de semen
BO + BSA (20 mg/ml)
32. Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC)
Descongelación de la pajuela de semen:
10 seg. a temp. ambiente
30 seg. a baño María (35 ºC)
Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina-
para evaluación)
Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5
min.
Aspirar sobrenadante
Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
Centrifugar a 500, 5 min.
Aspirar sobrenadante
Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen
Vol i x [ i ] = Vol f
[f]
33. PREPARACIÓN DEL SEMEN
Remover la capa superior Agregar 6 ml de BO de
lavado de semen y re-
centrifugar a 500 G, 5 min.
6 ml sol BO
de lavado
de semen
Luego de 2 lavados
Semen retirar sobrenadante
(0,5 ml) y dejar pellet
Capa espermática
Cámara de Neubauer (calcular concentración)
34. DILUCIÓN DE SEMEN Y
PREPARACIÓN DE GOTAS DE INSEMINACIÓN
Gotas de inseminación
100 µl de espermios en BO
cubiertas con aceite mineral
Agregar BO
de dilución
de semen
(Vol.
calculado)
FECUNDACIÓN
Vol i x [ i ] = Vol f
[f] Incubación 5 h
38. TCM 199 + 5 % SFb + ANTIBIÓTICOS
cultivo
Lavado
Lavado
Al medio de cultivo
BO (TCM-199) cubierto
por aceite mineral
TCM-199
TCM-199
39.
40. 1 célula 2 células 4 células
16 células
día 0-1 día 2 día 2-3 1 célula día 4-5
día 0-1
8 células 16 células Mórula temprana Mórula
2 células compacta
día 2-4 día 4-5 día 5-6
día 2 día 6-7
Mórula compacta Blastocisto temprano Blastocisto Blastocisto
4 células temprano
día 6-7 día 7 día 7-8
día 2-3 día 7
8 células Blastocisto
Blastocisto Blastocisto Blastocisto
día 2-4 día 7-8
expandido eclosionando eclosionado
día 8-9 día 9 día 10