Coloraciones: Giemsa, Gram, Grocott, P.A.S, Ziehl-Neelsen

1. Universidad de Carabobo
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Ciencias Biomédicas y Tecnológicas
T.S.U Citotecnología
Bachiller:
Marielena Rodríguez O.
C.I.: 24.327.272

2. COLORACION GIEMSA
IMAGEN: http://www.portalveterinaria.com/apuntes/art627_img3.gif

3. FUNDAMENTO
La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen
de frotis sanguíneos,cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este
método tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas
dentro de las células huéspedes. La coloración de giemsa se emplea también para
teñir frotis de sangre en el examen para protozoos
Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del
citoplasma de la célula huésped. La técnica de Giemsa está formada por varios
colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte
básico y la eosina como tinte ácido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de
metileno es un colorante metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de
púrpura y no de azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar
idealmente según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Giemsa

4. REACTIVO: GIEMSA
PROCEDIMIENTO:
Desparafinar e hidratar.
Aplicar solución de trabajo de Giemsa durante 10
minutos.
Deshidratar con alcohol absoluto, 3 cambios.
Aclarar con xilol, 3 cambios.
RESULTADOS:
 Citoplasma: Rosa
 Núcleos: Azul
 Eritrocitos: Rosa - Naranja
 Gránulos De Las Células Cebadas: Púrpura
 Bacterias: Azul
 Parásitos: Azul
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IMAGEN: 1. http://zl.elsevier.es/imatges/297/297v45n04/grande/297v45n04-90164750fig6.jpg
2. http://2.bp.blogspot.com/-Eln1JGEklnI/UKFwjixY-
cI/AAAAAAAABp0/TWA0wKAzZms/s640/sangre+y+setas+012.JPG
2

5. Imagen:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/8f/Gram_stain_01.jpg
COLORACIÓN DE GRAM

6. FUNDAMENTO
De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de
bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica
en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen
una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen
una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción
con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al
colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y
las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con un colorante
de contraste (safranina) para que puedan observarse.
COLORACION DE GRAM
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html

7. OBJETIVOS
• Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos
• Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias (importancia
del objetivo de inmersión)
• Conocer y manejar las unidades de medida de las células y establecer
comparaciones entre tamaños de procariotas y de eucariotas
• Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html

8. MATERIALES
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.
Palillos
Microscopios
Aceite de inmersión
Soporte de Tinciones
Goteros
Pinzas
Agua destilada
Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol 95%
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html

9. PROCEDIMIENTO
PASOS PARA LAS MUESTRAS :
1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una pequeña cantidad
de yogur con ayuda de un palillo higiénico. Haz lo mismo con la muestra de sarro dental
extraído de la boca de alguien.2. Prepara una fina extensión (frotis), en otros portas,
dejándolos secar.3. Fija este frotis dándole varios pases a los portas sobre la llama del
mechero, con la muestra hacia arriba.
TINCIÓN:
1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirará el colorante
mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para non
desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y después se
realizará otro lavado suave. Todas las células se teñirán de violeta.
2. Se retirará el colorante con etanol, goteándolo por el portaobjetos, hasta que las gotas
que salen no tengan casi color. Las células Gram- pierden el colorante violeta y
quedarán incoloras. Las Gram + seguirían violeta.
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html

10. 3. Añade una gota de agua a la preparación y cubre las preparaciones 2 min. con
safranina (colorante de contraste). Finalmente, lava el colorante con agua. Este
colorante sólo entrará en las bacterias Gram –, que quedarán rojas y las Gram +
seguirán violetas.
Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsérvalas con microscopio utilizando el
objetivo de inmersión (Observar (100×) Lugol). En esta tinción diferencial las bacterias
Gram – aparecen ROJAS y las Gram + VIOLETA.
Tinción negativa
1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto, colocar una
gota de muestra.
2. 2. Realizar frotis.
3. 3. Dejar secar.
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html

11. RESULTADO:
Gram –: ROJAS
Gram +: VIOLETA.
Bibliografía: http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html
Imagen: 1. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/79/Gram_Stain_Anthrax.jpg
2. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/e/e8/Escherichia_coli_Gram.jpg
2
1

12. Imagen: http://www.inclinica.org/img/caso9_3.jpg
COLORACION DE GROCOTT

13. La plata metanamina de Grocott es un método de tinción especial más empleado
para hongos. La reacción tintorial está basada en que, en presencia de ácido peryódico,
los polisacáridos de la pared celular de los hongos son oxidados a aldehídos; éstos, a su
vez, reducen el complejo nitrato-plata metanamina produciendo una coloración de café a
negra, debido al depósito de plata reducida en los lugares de localización de los
aldehídos.
También se utiliza para la identificación de la melanina.
OBJETIVO:
Demostrar Hongos.
FIJADOR:
Formol al 10%
COLORACION DE GROCOTT
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Plata_metanamina_de_Gomori

14. REACTIVOS
Solución de ácido bórico (solución A):
3,09 g de ácido bórico.
250 cc de agua destilada
Solución de tetraborato sódico
(solución B):
4,77 g de tetraborato sódico.
250 cc de agua destilada.
Solución buffer borato (comprobar que
el pH sea 8.2)
13 cc de solución A.
7 cc de solución B.
Solución de plata metanamina
42,5 cc de metanamina
(hexametilentetranamina) 3%.
2,5 cc de nitrato de plata 5%.
12 cc de buffer borato (pH 8.2).
PROCEDIMIENTO
Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de
instrumentos metálicos, ya que la plata
precipitaría sobre ellos.
Desparafinar e hidratar.
Añadir ácido peryódico 0,5%, 12 minutos.
Lavar con agua destilada.
Sumergir los cortes en la solución
de plata metanamina, 1 hora mínimo a 60 ºC; a
partir de este tiempo comprobar regularmente
al microscopio.
Lavar con agua destilada.
Añadir cloruro de oro 1 minuto.
Lavar con agua destilada.
Añadir tiosulfato sódico 3%, 1-2 minutos.
Lavar con agua corriente.
Tinción de contraste (rojo
nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto.
Deshidratar, aclarar, montar.
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Plata_metanamina_de_Gomori

15. RESULTADOS
Reticulina, Membranas Basales, Hongos, Mucinas, Glucógeno: Negro.
Fondo: Según Tinción De Contraste.
Nucleos: Marrón Oscuro A Negro
Imagen: http://www.marcosgodoy.com/foro/wp-content/uploads/2012/03/hepatitis-granulomatous-
i.jpg

16. Imagen: http://www.actasdermo.org/es/lepra-puesta-al-dia-definicion/articulo/90220985/?pubmed=true
COLORACION DE FITE-FARACO

17. OBJETIVO:
Demostración de BAAR.
FIJADOR:
Formol al 10%.
REACTIVOS:
Agua 50ml.
Fenol (fundido, a baño maría) 2.5ml.
Alcohol ABS 5ml.
Fucsia Acida0.5gr.
Acido Sulfúrico al 5%
Acido Sulfúrico 5ml.
Agua…95ml.
Verde Brillante al 1%
Verde Brillante 1gr.
Agua 100ml.
Solución Xilol-Aceite de Oliva
Xilol 50ml.
Aceite de Oliva 50ml.
TÉCNICA DE FITE FARACO.
PROCEDIMIENTO:
 Xilol-Aceite de Oliva a 60*C 30min.
 Lavar en Agua Jabonosa.
 Lavar en Agua.
 Carbol-Fucsina…20min.
 Lavar en Agua.
 Decolorar con Acido Sulfúrico (por
goteo).
 Lavar en Agua.
 Verde Brillante 1min.
 Secar al Aire.
 Aclarar y Montar.
Bibliografía: http://es.scribd.com/doc/40784447/Tecnicas-histoquimicas

18. RESULTADOS:
BAAR: Rojo Brillante.
Resto del Tejido: Verde.
Bibliografía: http://es.scribd.com/doc/40784447/Tecnicas-histoquimicas
Imagen: http://www.jlponline.org/articles/2011/3/2/images/JLabPhysicians_2011_3_2_110_86844_f4.jpg

19. COLORACION DE P.A.S
IMAGEN: http://www.kidneypathology.com/Imagenes/Histologia/Histo_Tubulos_4.jpg

20. FUNDAMENTO
La tinción de PAS (Periodic Acid-Schiff) es una de las tinciones más comúnmente
utilizada en histología y se utiliza para evidenciar la presencia de grupos aldehídos
formados por oxidación previa de los hidratos de
carbono.
El fundamento de la reacción consiste en oxidar los tejidos mediante el ácido peryodico
para incrementar el número de grupos carbonilos (aldehídos o cetonas) presentes en
ellos. Posteriormente, se trata la muestra con el reactivo de Schiff que reacciona con dos
grupos aldehídicos contiguos dando lugar a una coloración rojo-púrpura característica.
El Kit de PAS se compone de todos los reactivos que intervienen en esta tinción.
Bilbligrafía: http://www.panreac.es/pdf/pdf01/Tincion-de-PAS.pdf

21. REACTIVOS DEL KIT
Kit de PAS DC (*)
Xileno mezcla de isómeros DC (*)
Etabol 96% DC (*)
Etanol Absoluto DC (*)
Eukitt ®, medio de montaje DC
Componentes del Kit
 Reactivo A Ácido peryódico
Reactivo B Reactivo de Schiff
Reactivo C Potasio meta-Bisulfito solución
Reactivo D Solución fijadora
Reactivo E Hematoxilina de Mayer
REACTIVOS
Solución de Acido Peryodico al 5%.
Acido Peryodico… 0.5gr.
Agua… 100ml.
Solución de Acido Clorhídrico 1N.
Acido Clorhídrico…83.5ml.
Agua…916.5ml.
Reactivo de Schiff de Coleman.
Fucsina Básica…1gr.
Agua-Caliente a 60C…200ml.
Llevarlo a Punto de Ebullición.
Dejarlo enfriar y luego agregar
Metabisulfito de Potasio…2gr.
Acido Clorhídrico 1N…10ml.
Dejarlo aclarar durante 24Hrs y luego
agregar: Carbón Activado…0.5gr.
Bibliografía: http://es.scribd.com/doc/40784447/Tecnicas-histoquimicas
http://www.panreac.es/pdf/pdf01/Tincion-de-PAS.pdf

22. PROCEDIMIENTO:
Desparafinar é hidratar.
 Acido Peryodico 5min.
 Lavar en Agua.
 Reactivo de Schiff 40min.
 Lavar en Agua Caliente 10min.
 Hematoxilina 3-8min.
 Lavar en Agua.
 Deshidratar, Aclarar y Montar.
Bibliografía: http://es.scribd.com/doc/40784447/Tecnicas-histoquimicas

23. Bibliografía: http://www.panreac.es/pdf/pdf01/Tincion-de-PAS.pdf
PROCEDIMIENTO 2
1. Una vez los cortes hayan sido desparafinados y rehidratados, enjuagar con agua destilada
2. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo A. Dejar reaccionar durante 10 minutos.
3. Lavar con agua destilada.
4. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo B. Dejar reaccionar durante 20 minutos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo C. Dejar reaccionar durante 2 minutos.
7. Escurrir el portaobjetos.
8. Sin lavar, depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo D. Dejar reaccionar durante 2
minutos.
9. Lavar con agua destilada.
10. Depositar sobre el corte 10 gotas de Reactivo E. Dejar reaccionar durante 3 minutos.
11. Hacer virar en agua corriente durante 5 minutos.
12. Deshidratar utilizando la serie creciente de alcoholes.
13. Aclarar con Xileno.
14. Montar con medio de montaje.
15. Observar al microscopio.

24. Bibliografía: http://www.panreac.es/pdf/pdf01/Tincion-de-PAS.pdf
Imagen: 1. http://raulcalasanz.files.wordpress.com/2010/10/lma.jpg
2. http://www.conganat.org/7congreso/imagenes_trabajos/204-PL%20PAS.jpg
RESULTADOS:
Núcleo : VIOLETA-NEGRO
Polisacáridos Simples (Glucógeno), Mucopolisacáridos Neutros,
Mucoproteínas, Membrana Basal, Glucolípidos : ROJO-PÚRPURA
1 2

25. Imagen: http://www.tubesalud.com/wp-content/plugins/WPRobot/images/297f4_pruebas-
tuberculosis-bacteria.jpg
COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

26. COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de tinción diferencial rápida y económica,
usada para la identificación de microorganismos patógenos, como M. tuberculosis o el género
Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros.
Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo,
y Friedrich Neelsen, un patólogo.
FUNDAMENTO
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos que les confieren la
propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos.
Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus
propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de lo ácidos
grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Las bacterias que resisten la
decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de contraste.
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

27. TÉCNICA
Los reactivos necesarios para su realización
son los siguientes:
ácido periódico 58% carbol fucsina de Ziehl
culina (fucsina fenicada). Preparar mezclando
en el orden dado:
0,5 g fucsina básica
50 cc agua destilada
5 cc etanol absoluto
28,5 g cristales de fenol derretidos
hematoxilina
alcohol ácido 1%:
alcohol de 35º
ácido clorhídrico
PROCEDIMIENTO
El procedimiento es el siguiente:
desparafinar e hidratar los cortes
ácido periódico 5%, 10 min
lavar con agua destilada
fucsina fenicada, 15 min
decolorar en alcohol ácido al 50%
lavar con agua destilada
hematoxilina, 10 min
azulidificar con, por ejemplo, carbonato
de litio
deshidratar, aclarar y montar
preparaciones
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

28. VARIANTE CLÁSICA O "EN CALIENTE“
Éstas variantes son para preparaciones citológicas.
Hacer un frotis de la muestra.
La fijación al calor asegurará de que el frotis quede adherido al portaobjetos. Un frotis
muy delgado puede darle resultados falsamente negativos y un frotis muy grueso
puede desprenderse del portaobjetos durante la tinción.
Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de tinción con los
extendidos hacia arriba. Nunca tiña más de 12 portaobjetos a la vez.
 Dejar el frotis sobre el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada.
Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante 5 minutos. Mantenga
el calor durante este período.
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

29. Calentar con un mechero hasta la emisión de vapores (3-5 minutos).
Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada penetre y tiña la pared
celular de la bacteria. No deje que hierva o se seque el colorante.
Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua corriente fría hasta que
toda la tinción libre quede lavada. Lave suavemente de manera que el extendido no se
barra del portaobjetos. Retire el exceso de agua.
Decolorar con alcohol-ácido.
Cubra cada portaobjetos con la solución decolorante, tal como alcohol ácido y
manténgalo sobre el portaobjetos durante 7 minutos. Si no se decolora
suficientemente, el contenido del esputo que no son bacilos TBC puede permanecer
teñido. Enjuague con agua una vez más los portaobjetos y quite el exceso de agua. Si
los portaobjetos aún están rosa, aplique una cantidad adicional de la solución
decolorante de 1 a 3 minutos.
Aplicar azul de metileno (1 minuto).
Enjuagar con agua
Observación
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

30. EN "FRÍO" (TINCIÓN DE KINYOUN)
Hacer un frotis.
Dejarlo en el puente de tinción.
Aplicar fucsina-fenicada (solución con fenol y
mayor concentración de fucsina).
Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
Decolorar con alcohol ácido.
Lavar con agua del grifo.
Contrastar con azul de metileno
RESULTADOS
BAAR: ROJO.
Núcleos: AZUL
SEMIAMARILLO.
Bibliografía: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen
Imagen:
http://www.biopack.com.ar/Catalogo_OnLine_FichaTecnica.asp?Cat_codProductoGeneral=2000151500

31. GRACIAS…
Tanta prisa tenemos por hacer, escribir y dejar oír nuestra voz en
el silencio de la eternidad, que olvidamos lo único realmente
importante: vivir
- Robert Louis Stevenson