Explicación de diferentes técnicas de coloración bacteriana

1.  Colorantes y
coloraciones
 Altagracia Jiménez Díaz

2. QUE SON LOS COLORANTES ?
SON SUSTANCIAS CAPACES DE
TRANSMITIR SU COLOR A OTRAS.

3. 02/09/15
3 Los colorantes
 Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que
la célula haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante por sí mismo.
 Esta sustancia se denomina mordiente; un mordiente
habitual es el ácido tánico, el lugol.
 El mordiente se combina con un constituyente celular
y lo altera de tal modo que ahora sí podrá reaccionar
con el colorante.

4. Colorantes y coloraciones

5. Clasificación Segun Estructura
Quimica

6. Colorantes Básicos
 Azul de metileno, azul de
quinoleína
 Verde malaquita
 Safranina
 Cristal violeta
Colorantes Ácidos
 Eosina
 Fucsina ácida
 Rosa de Bengala

7. Coloraciones
SON INTERCAMBIOS
IONICOS ENTRE EL COLORANTE Y
LA BACTERIA

9. Coloración
 Coloración positiva: se tiñe lo que queremos observar
 Coloración negativa es cuando no se tiñe lo que
queremos observar
 Coloración simple ; se adiciona un solo colorante
 Coloración compuesta si utiliza mas de un colorante
 Propiedad tintorial; es el comportamiento diferente de
las bacterias frente a una misma técnica de coloración
 Coloración diferencial: se agrega mas de un colorante
en diferentes etapas y las estructuras teñidas son
diferenciadas por el color y por la forma

10. Pasos previos a toda coloración
 Hacer Frotis dejar Secar y Fijar
Frotis
Secar
Fijar

11. 02/09/15
11 Coloración de Gram
Ideada en 1884 por Hans Christian Joachim Gram (1853-1938), un médico danés con estudios en
bacteriología y farmacología.
 La coloración de Gram. tiene interés taxonómico ya
que divide las bacterias en dos grandes grupos,
bacterias Gram positivas que se tiñen de morado y
bacterias gram negativas que se tiñen de rojo
 La coloración de Gram es positiva compuesta y
diferencial.

12. 02/09/15
12 Tinción Bacteriológica de Gram.

El equipo para realizar la tinción de
Gram. consta de:
Colorantes
 Cristal Violeta, Safranina.
 Mordiente : Yodo-Lugol

Decolorante: Alcohol-Cetona.
Bandeja de tinción.
Asa bacteriológica o hisopo.
Frasco lavador.
Muestra bacteriana sólida
(agar), líquida (caldo) o espécimen
clínico.

13. La coloración de Gram
se fundamenta en la
diferencias físico química
de la pared Celular

14. 02/09/15
14
Pared celular de las bacterias Gram positivas:
 El peptidoglicano se dispone en varias
capas lo que le otorga grosor a la
pared.
 Atraviesan el peptidoglicano
polisacáridos ácidos, denominados
ácidos teicoicos.
 Los ácidos teicoicos son de dos
clases: poliglicerol fosfato y poliribitol
fosfato.
 Las funciones primarias de estos
polímeros son la estabilización del
peptidoglicano y la captura de Mg++.

15. 02/09/15
15 Pared celular en bacterias Gram negativas
 El LPS es una molécula que contiene tres regiones diferentes: el
lípido A, el core y el antígeno O.
 El LPS constituye una endotoxina, que se libera cuando la
bacteria se divide o muere.
 Es un potente estimulador de los macrófagos, lo que causa la
activa liberación de citoquinas, responsables de las
manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias Gram
negativas y que varían desde una fiebre hasta el shock séptico.
 En esta membrana externa se encuentran las porinas.

16. 02/09/15
16
 Entre la membrana externa y la membrana celular se
crea un compartimiento virtual, llamado espacio
periplásmico.
 El espacio periplásmico es una matriz que incluye al
peptidoglicano, enzimas, proteínas captadoras de
nutrientes y sustancias de secreción.
 La membrana externa contiene numerosas proteínas,
siendo las porinas las más abundantes.
 Se denominan así, porque forman poros que
comunican el exterior con el espacio periplásmico.

17. 02/09/15
17 Pared celular en bacterias Gram negativas

18. 02/09/15
18
Pared celular en bacterias Gram negativas
 Su pared celular es más delgada, pero más compleja que la de los
Gram positivas.
 El peptidoglicano se dispone en una sola capa, pero por fuera de ella
se encuentra una segunda membrana denominada membrana
externa.
 La membrana externa es una membrana asimétrica, porque si bien la
monocapa interna está formada por fosfolípidos, la monocapa exterior
está formada por un tipo especial de lípido, denominado
lipopolisacárido (LPS).

19. Coloración de Gram
 Es positiva compuesta y diferencial
 Paso 1- Cubrir la preparación con cristal violeta por 1 minuto y lavar con
agua.
 Paso 2- Cubrir la preparación con Yodo-Lugol por 1 minuto y lavar con
agua.
 Paso 3- Cubrir la preparación con Alcohol-cetona durante algunos 15 seg
y lavar con agua.
 Paso 4- Cubrir la preparación con Safranina por 1 minuto y la lavar con
agua.
Secar y observar

20. Colorantes de Gram: Cristal violeta y safranina
Reactivos: Yodo-Lugol
Solvente: Alcohol- cetona
Resultados
Gram+ : color Morado
Gram- : color rojo

21. Coloración de Gram

22. 02/09/15
22 Coloración de Gram. Paso 1.-
 Paso 1.- Cubrir la
preparación con Cristal
Violeta por 60 seg.
 y lavar suavemente con
agua.

23. 02/09/15Altagracia Jimenez Diaz MA
23 Coloración de Gram.
 Paso 2.- Cubrir la
preparación con Yodo-
Lugol por 60 seg y lavar
suavemente con agua.

24. 02/09/15Altagracia Jimenez Diaz MA
24 Coloración de Gram.
 Paso 3.- Cubrir la
preparación con Alcohol-
Cetona durante algunos
segundos (5-10) y lavar
suavemente con agua.

25. 02/09/15Altagracia Jimenez Diaz MA
25 Coloración de Gram.
 Paso 4.- Cubrir la
preparación con Safranina
por 60 seg y lavar
suavemente con agua.
 Secar y Observar con lente
de 100x (inmersión).

26. 02/09/15
26
Resultados de la coloración de Gram.
Bacterias teñidas de morado: Gram positivas
Teñidas de rojo: Gram negativas
Podemos observarle la forma, la disposición y la propiedad
tintorial.

27. Al observar al microscopio la
coloración de Gram
 Reportamos
 La forma
 La disposición
 La capacidad
tintorial
 Se requiere de un
microscopio
 Usamos lente de 100
X con aceite de
inmersión

28. 02/09/15
28 Coloración de Ziehl Neelsen
 La coloración de Ziehl Neelsen al igual que la de Gram es
positiva, compuesta y diferencial.
 Colorantes y Reactivos: fucsina básica fenicada - solución de
alcohol-ácido (3% de HCl en etanol de 95°) - azul de metileno
Esta tinción permite diferenciar a los microorganismos que son
ácido alcohol resistentes, de color rojocolor rojo, de los que no lo son, dede
color azulcolor azul. Se utiliza en la identificación de mycobacterias.

29. 02/09/15
29
 Es una coloración específica para colorear bacterias cuyas
paredes celulares contienen largas cadenas de ácidos
grasos.
 Por su alto contenido de acido micolico (cera no
saponificable) tienen la capacidad de unir el colorante
fucsina a su pared de manera que hacen a la célula
resistente a la decoloración con alcohol ácido.
 Son bacilos ácido-alcohol resistente (BAAR), las
mycobacterias, y las nocardias.

30. 02/09/15
30
Coloración de Ziehl Neelsen
 REALIZACIÓN
 Preparar un frotis bacteriano.
 Se deja secar al aire y se fija al calor.
 Cubrir la preparación con carbofucsina.
 Calentar la preparación con una lámpara de alcohol durante 5 min. No debe hervir.
 Si se evapora, se añade más carbofucsina para que no se seque en ningún momento.
 Lavar con agua el resto de colorante.
 Decolorar con la mezcla alcohol-ácido por tres minutos
 Lavar con agua .
 Teñir con azul de metileno 1 min.
 Lavar con agua el resto de colorante.
 Secar la preparación.
 Examinar al microscopio.

31. Resultados de la coloración de
Ziehl Neelsen
02/09/15Altagracia Jimenez Diaz MA
31

32. Tinción de ziehl neelsen
Que es la tinción de Ziehl Neelsen?
 Técnica de tinción utilizada para identificar microorganismos
patógenos. Del genero Mycobacteriun especies tuberculosis y
leparae.
Las cuales poseen abundantes ácidos micolicos y cera no
saponificable
Se fundamenta en la propiedad que poseen algunas células
bacterianas de resistir a la decoloración con un alcohol- básico.

33. procedimiento

34. Tinción de ZIEHL NEELSEN
 .  BAANR
Fuscina
fenicada
Decolora
ción con
alcohol
acido
Azul de
metileno
BAAR

36.  Tinción de la capsula bacteriana.
 Funciones de la capsula bacteriana.

37. 02/09/15
37 Coloración de Cápsula
 La tinta china o la nigrosina dan un fondo oscuro
sobre el cual la cápsula de terminados
microorganismos como el Cryptococcus neoformans
se observará como un halo claro alrededor del
microorganismo.

38. 02/09/15
38 Coloración de Cápsula
 Método con tinta china (Método de Gin)
 Técnica
 Colocar unas gota de la sol. De dextrosa en un tubo.
 Tomar una pequeña cantidad del material bacteriológico del cultivo y
mezclar con las gotas de dextrosa.
 Colocar una gota de tinta china en un porta objetos y añadir una gota
de la mezclar anterior y con el extremo de un portaobjetos , hacer un
frotis delgado y secar al aire, fijar con alcohol metílico por un minuto.
 Teñir por 2 minutos con Cristal violeta o safranina
 Lavar con abundante agua, secar y observar al microscopio.

39. 02/09/15
39 Coloración de Cápsula
Resultado
las capsulas se observan transparentes sobre
fondo negro

41. Gracias por su atención