...

1. BIOLOGÍA MOLECULAR
TESILLA
PAPEL DE UNA POSIBLE ENDORIBONUCLEASA E EN LA DEGRADACIÓN DEL
ARNm DE LA GIRASA EN Mycobacterium smegmatis
ALBA E. RICARDO PÁEZ
UNIVERSIDAD DE CHILE

2. PAPEL DE UNA POSIBLE ENDORIBONUCLEASA E EN LA DEGRADACIÓN DEL GEN DE LA
GIRASA EN Mycobacterium smegmatis
INTRODUCCIÓN
La expresión de genes se determina por una combinación de factores los cuales regulan la eficiencia
de transcripción, estabilidad del ARNm y traducción de los mismos. Los procesos de transcripción y
traducción en microorganismos han sido largamente estudiados, el interés en la estabilidad del
ARNm es mas reciente.
En comparación a los eucariotes los ARNm de los procariotes exhiben in vivo una inestabilidad con
un promedio de vida media de pocos minutos.
La estabilidad de un ARNm es proporcional a su vida media y hace parte de las estrategias
bacterianas para responder a cambios ambientales (Rauhut y Klug, 1999).
La degradación del ARNm regula la expresión genética por dos vías, primero la maquinaria celular
de degradación del ARN remueve cada mensajero rápida o tardíamente de la circulación celular,
esto por las estructuras estabilizantes o desestabilizantes del ARN. Segundo, la degradación del
ARNm se regula por señales medio ambientales, así se proveen herramientas para adaptar la
traducción celular a los nuevos requerimientos de la bacteria (Rauhut y Klug, 1999).
En Escherichia coli, el decaimiento del ARNm está determinado por una combinación de factores cis
y trans. Los factores trans involucran un gran número de ribonucleasas, éstas incluyen tanto exo
como endoribonucleasas (Zuo and Deutschen, 2001),(Condon and Putzer, 2002), (Grunber-Manago
Marianne,1999).
El decaimiento de muchos ARNm se inicia mediante un clivaje endonucleolítico por la ARNasa E
(Rauhut and Klug, 1999), (Kushner, 2002), (Jiang y col.,2002). A este corte le sigue una degradación
exonucleolítica del nuevo extremo 3’, dos enzimas, Polinucleótido fosforilasa y Ribonucleasa II están
involucradas en este proceso (Grunber-Manago Marianne,1999). Finalmente otras enzimas llamadas
oligoribonucleasas completan la degradación del ARNm (Ghosh and Deutscher,1999).
Los elementos cis en el ARNm se agrupan en dos clases, estabilizadores y desestabilizadores. Los
elementos desestabilizadores consiste en secuencias y estructuras los cuales proveen sitios de
unión para nucleasas y así mismo inician el proceso de degradación. Por el contrario los elementos
estabilizadores impiden la degradación del ARNm al bloquear el acceso o acción de diferentes
nucleasas. Estructuras secundarias, cerca o al extremo 3’ del mensajero, bloquean la acción
procesiva de exonucleasas. A su vez las estructuras secundarias al extremo 5’ del ARNm parecen
estabilizar el mensajero quizás al prevenir la interacción de la endoribonucleasa E con el mensajero
(Rauhut and Klug, 1999). También una fuerte secuencia Shine-Dalgarno cerca al extremo 5’ del
mensajero, recluta ribosomas y estabiliza el mensajero al bloquear el acceso de nucleasas al ARN
desnudo.
La vida media del ARNm se determina por la combinación de todos esos factores, en la mayoría de
los casos el paso crucial parece ser la remoción de esos elementos y estructuras por endonucleasas
(con frecuencia RNAsa E).

3. En Escherichia coli la vida media del ARNm total es de 2.4 minutos a 37 0C (Unniraman y col.2002),
esto puede ser el reflejo del rápido crecimiento en E. coli.
Se puede esperar que organismos con lento crecimiento puedan tener mensajeros mas estables y
diferente regulación de degradación.
La degradación de ARNm hasta ahora ha sido poco estudiada y mas aún en bacterias de
crecimiento lento como M. smegmatis.
En este microorganismo se analizó la estabilidad del ARNm de girasa y se identificó una estructura
secundaria cerca del 5’, la cual protege al mensajero de la degradación (Unniraman y col., 2002).
Además se observó mayor estabilidad del mensajero en condiciones de deprivación de nutrientes.
Igualmente se reportó menor estabilidad del ARNm de girasa y un ΔG mas positivo en mutaciones al
extremo 5’, la regeneración de la estructura a la condición silvestre favorecía la estabilidad.
El lazo estructurado hacia el 5’ en los genes puf BA en Rhodobacter capsulatus es importante. El puf
BA es un dicistrón interno que vé aumentada su vida media a 33 minutos porque quedan expuestas
estructuras en forma de lazo a su extremo 5’ cuando sufre un clivaje por una endoribonucleasa tipo
E (Grunberg-Manago,1999).
En E. coli el 5’ no traducible del gen OmpA actúa como estabilizador en la regulación de crecimiento
por OmpA (Grunber-Manago,1999).
La endoribonucleasa E es la enzima clave en la iniciación de la degradación de ARNm. Esta enzima
es codificada por el gen esencial rne, la enzima posee 1061 aminoácidos (Grunber-Manago,1999).
El gen rne autorregula su propia síntesis al reprimir la concentración del trascrito a través del
incremento en la velocidad de decaimiento (Diwa y col., 2000). La masa molecular de la proteína
codificada es 118 kDa, el N-terminal contiene el centro catalítico, el C-terminal es poco conservado y
está involucrado en las interacciones proteína-proteína, también posee un dominio central de unión a
ARN (Rauhut y Klug,1999).
Es importante anotar que el clivaje por endoribonucleasa E ocurre preferencialmente en regiones
ricas en A/U (Rauhut y Klub, 1999),(Diwa y Belasco,2002).
Un gen homólogo al codificante para la endoribonucleasa E se encuentra en Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae (Condon y Putzer,2002), aunque el genoma de M. smegmatis
no ha sido secuenciado, este gen parece estar conservado en los genomas micobacteriales. Así, la
endoribonucleasa E representa quizás un mecanismo conservado evolutivamente en la degradación
de ARNm (Unniraman y col., 2002).
Descrito un factor cis importante en en la estabilización del ARNm del gen de la girasa en M.
smegmatis no se han descrito factores trans involucrados en la degradación de este gen.
En este trabajo se pretende abordar el mecanismo de decaimiento del ARNm de la girasa en M.
smegmatis, por el producto de un posible gen homólogo a la endoribonucleasa E, presente en los
genomas micobacteriales hasta ahora secuenciados. La importancia radica en conocer lo que
sucede con el ARNm mensajero en bacterias de lento crecimiento, especialmente patógenos como
M. tuberculosis.

4. HIPÓTESIS
La endoribonucleasa E es conservada en el género Mycobacterium y tiene un rol principal en la
degradación del ARNm de girasa el cual posee una estructura en su extremo 5’ que le imprime
estabilidad.
OBJETIVO GENERAL
Determinar un posible rol de una endoribonucleasa tipo E en la degradación del ARNm de girasa en
Mycobacterium smegmatis.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
*Generar trascritos de girasa fusionados a un gen reportero con secuencias blanco susceptibles de
ser clivadas por una endoribonucleasa E.
*Comparar la expresión del gen luciferasa de los diferentes ARNm de girasa generados en los
ensayos.
*Verificar si se encuentra el gen homólogo y la proteína de la endoribonucleasa E en M. smegmatis.
MATERIALES Y METODOS
*Generar trascritos de girasa fusionados a un gen reportero con secuencias blanco susceptibles de
ser clivadas por una endoribonucleasa E.
El constructo pMN197B conteniendo (Unniraman y col.,2002) el fragmento que incluye parte del gyrB
y aproximadamente 1.5 Kb de la región rio arriba del gen, fue usado como templado para insertar
mediante PCR regiones cortas de 7 nucleótidos ricas en A/U (a 20 nt y 40 nt de la estructura de lazo
5’).
El vector lanzadera de E. coli-Mycobacterium pSD7 (Unniraman y col,2002) fue el receptor del gyrB
modificado con regiones ricas en A/U y del gen de luciferasa proveniente del pYUB180 (Jacobs y
col.,1993). El gen luciferasa se clonó río abajo del gen gyrB. Con este constructo se transformó M.
smegmatis mc2 por electroporación (Jacobs y col.,1993). Los clones positivos se seleccionaron en
un medio LB –kanamicina.
Como controles se usaron cepas de M. smegmatis sin el plásmido pSD7 , con el plásmido pSD7
llevando el gen de luciferasa pero sin el gen gyrB, con el plásmido pSD7 llevando el gen gyrB sin
regiones ricas en A/U, pero fusionado con el gen luciferasa.
*Comparar la expresión del gen luciferasa de los diferentes ARNm de girasa generados en los
ensayos.

5. Las cepas a evaluar serán crecidas bajo las condiciones reportadas por Unniraman y col. La
expresión de luciferasa será determinada según lo reportado por Jacobs y col.
*Verificar si se encuentra el gen homólogo y la proteína de la endoribonucleasa E en M. smegmatis.
Para encontrar el gen homólogo a la endoribonucleasa E en M. smegmatis se diseñaran partidores
teniendo en cuenta la secuencia reportada del gen en la base de datos. Se aislará el DNA total
según lo reportado por Unniraman y colaboradores. Se usará un kit de QIAGEN para la reacción de
PCR. El producto de PCR se analizará en gel de agarosa al 0.8%.
A partir del extracto celular de un cultivo de M. smegmatis se realizará un “Western” usando
anticuerpo monoclonal de endoribonucleasa E y se seguirá el protocolo descrito en el Current
Protocol.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de los experimentos realizados se espera encontrar en M. smegmatis un producto de un gen
homólogo a la endoribonucleasa E presente en M. tuberculosis en el producto de PCR
En los constructos llevando el gen gyrB-luciferasa con secuencias blancos al corte endonucleolítico
se espera encontrar una actividad luciferasa menor que para los constructos sin secuencias blanco.
Estas secuencias aumentarían la velocidad de decaimiento del RNAm de gyrB por la susceptibilidad
a un pronto ataque exonucleolítico dado los fragmentos que se generan. Ahora este ensayo
preliminar podría verse enmascarado si hay otra endoribonucleasa con cortes inespecíficos y que
solo esté presente en esta bacteria.
El estudio de la estabilidad del ARNm de la girasa en M. smegmatis ofrece una ventaja particular por
ser un gen esencial en todas las eubacterias. También la expresión de muchos genes virulentos
depende de la topología del DNA en muchas bacterias patogénicas, si comprendemos la expresión y
la regulación de este gen en un organismo modelo de M. tuberculosis, podría ayudar a descifrar el
proceso de infección. De manera interesante en el gen de la girasa de M. tuberculosis y no de M.
smegmatis se encontraron promotores débiles además del promotor principal (Unniraman y col.,
2002) y se postula secuencias de promotores consenso para dos factores sigma. Este análisis se
hace mas complejo, porque nos preguntaríamos si algún factor sigma de los trece reportados en
Mycobacterium tuberculosis estaría involucrado en expresar genes mas estables dadas las
condiciones de estrés presentadas por ejemplo en estado de dormancia o latencia del bacilo. Así
estarían involucrados otros factores en la estabilidad de mensajeros en genes micobacteriales,
además de la estrategia de la célula de usar ARNm mas estables para reducir su carga
transcripcional.
En otros microorganismos se ha visto un aumento o decaimiento en la estabilidad de ciertos genes
dependiente de condiciones ambientales. En Rhodobacter capsulatus la velocidad de decaimiento
del ARNm de puf se aumenta en presencia de oxígeno. Este mensajero policistrónico codifica varios
componentes proteicos del complejo fotosintético y esto es óptimamente expresado solo bajo
condiciones de baja tensión de oxígeno (Rauhut y Klug,1999). La estabilidad del mensajero de thrS
en Bacillus subtilis se incrementa bajo condiciones de deprivación de nutrientes (Condon C.,2003).

6. Con este trabajo se pretendió dar una aproximación de un factor trans relevante en la degradación
de ARNm de girasa, como es la endoribonucleasa E y que estaría jugando un rol importante en su
estabilidad.
BIBLIOGRAFÍA
Condon Ciaran. (2003). RNA Processing and Degradation in Bacillus subtilis. Microbiology and
Molecular Biology Reviews. Vol. 67, No. 2, p. 157-174.
Condon Ciaran and Putzer Harald. (2002). The phylogenetic distribution of bacterial ribonucleases.
Nucleic Acids Research. Vol. 30, No. 24, p. 5339-5346
Diwa Alexis, Bricker Angela , Jain Chaitanya and Belasco Joel. (2000). A evolutionarily conserved
RNA stem-loop functions as a sensor that directs feedback regulation of Rnase E gene expression.
Genes & Development. Vol. 14:1249-1260.
.Diwa Alexis A. and Joel G. Belasco. (2002). Critical features of a conserved RNA Stem-loop
Important for Feedback Regulation of RNase E synthesis. The Journal of Biological Chemistry. Vol.
277, No. 23. p. 20415-20422.
Ghosh Sandip and Deutscher Murray P. (1999). Oligoribonuclease is an essential component of the
mRNA decay pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 96, p. 4372-4377.
Grunber-Manago Marianne. (1999). Messenger RNA stability and its role in control of gene
expression in bacteria and phages. Annu. Rev. Genet. Vol. 33:193-227.
Jacobs W., Barletta R., Udani R., Chan John, Kalkut G., Sosne G., Kieser T., Sarkis G., Hatfull G.
and Bloon B. (1993). Rapid Assessment of Drug Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by
Means of Luciferase Report Phages. Science. Vol. 260. p. 819-821.
Jiang Xunquing, Diwa Alexis and Belasco Joel. (2000). Regions of RNase E important for 5’enddependent RNA cleavaje and Autoreguladed Synthesis. Journal of Bacteriology. Vol. 182, No. 9, p.
2468-2475.
Kushner Sydney R. (2002).mRNA decay in Escherichia coli comes of age. Journal of Bacteriology.
Vol. 184, No. 17, p. 4658-4665.
Unniraman Shyam, Chatterji Monalisa and Nagaraja Valakunja. (2002). A hairpin near the 5’
stabilizes the DNA gyrase mRNA in Mycobacterium smegmatis. Nucleic Acids Research. Vol. 30,
No.34, p. 5376-5381.

7. Unniraman Shyam, Chatterji Monalisa and Nagaraja Valakunja. (2002). DNA gyrase genes in
Mycobacterium tuberculosis: a single operon driven by Multiple Promotors. Journal of Bacteriology.
Vol. 184, No. 9, p. 5449-5456.
Rauhut Reinhard and Klug Gabriele. (1999). mRNA degradation in bacteria. FEMS Microbiology
Reviews. 23 p. 353-370.
Zuo Yuhong and Deutscher P. (2001). Exoribonuclease superfamilies: structural analysis and
phylogenetic distribution. Nucleic Acids Research. Vol. 29, No. 5, p. 1017-1026.