Manual microbiología UAM

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA
manual de prácticas
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
María de los Angeles Aquiahuatl Ramos
María de Lourdes Pérez Chabela
Casa abierta al tiempo
UNIDAD IZTAPALAPA
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

Rector General
Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Solís Rosales
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA - Iztapalapa
Rector
Dr. José Lema Labadie
Secretario
Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
División de Ciencias Biológicas y de la Salud
Director
Dr. J. Gerardo Saucedo Castañeda
Secretario Académico
M. en C. Arturo L. Preciado López
Departamento de Biotecnología
jefe del Departamento
Dr. J. Mariano García Garibay
ISBN 970-31-0141-0
Primera Edición: 2004
Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa
Av. San Rafael Atlixco No. 186 Col. Vicentina.
Del. Iztapalapa, C.P. 09340 México, D.F.
Impreso y hecho en México

. ><,• - ? . ' - ' " - '-',
w
de losAngelesAquiahuatlRamos
María deLourdesPérez Chabela
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL

Agradecemos al Director de la División de Ciencias Biológicas y de la
Salud Dr. Gerardo Saucedo Castañeda por todo el apoyo para la publica-
ción de este manual de prácticas del laboratorio de ,¡ —*: :: ^
GENERAL
Al Sr. Jorge Lodigliani por su apoyo en el procesado de las fotografías.
Al Dr. Alfonso Totosaus y al Sr. Wilfrido Rodríguez por su ayuda en el
diseño de las figuras.
A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enri-
quecieron este trabajo.

índice
7
9
12
14
15
15
16
20
22
22
23
24
28
30
31
31
32
36
38
38
39
40
46
48
49
49
49
54
56
57
57
PRESENTACIÓN
RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIANTE
PRÁCTICA # 1
Preparación y esterilización de materiales y medios de cultivo
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
Esterilización demateriales y medios de cultivo
Preparación de las cajas de Petri ytubos con medios de cultivo
Prueba de esterilidad de materiales
PRÁCTICA # 2
Preparación, fijación y coloración simple defrotis
Preparación de frotis
Fijación del frotis
Tinción simple
Observación al microscopio
PRÁCTICA #3
Tinción diferencial deGram y tinciones selectivas
Tinción diferencial de Gram
Tinción selectiva de endosporas
Tinción negativa para observación de cápsulas
Observaciones al microscopio
PRÁCTICA # 4
Métodos de cultivo yaislamiento de bacterias
Técnica de estría cruzada
Siembra en tubos con caldo yagar nutritivo
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
Condiciones de incubación
PRÁCTICA # 5
Métodos de cultivo ydescripción morfológica de hongos
Siembra de hongos
Descripción macroscópica de levaduras ymohos
Descripción microscópica de levaduras
Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
PRÁCTICA # 6
Pruebas de diferenciación bioquímica
Técnica de Inoculación en cajas de Petri
Técnicas de Inoculación en tubos
Evaluación de actividades metabólicas
o
•o
o
n
t
A
ao•o
manual de prácticas del ?>l~ ' T" ;Ir fX {,f * 4#%„* } ':"'-, ;': ; f *í ," *' " J-' <-'" ^o < ,

(O
a
64
66
67
68
74
76
77
82
84
84
90
92
92
97
101
PRÁCTICA # 7
Métodos de cuantificación de microorganismos
Técnica turbidimétrica
Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
Técnica de dilución y siembra en placa
PRÁCTICA # 8
Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
Efecto de la Temperatura
Efecto del pH
PRÁCTICA # 9
Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano
Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
Efecto de la desecación
PRÁCTICA # 10
Curva de crecimiento bacteriano
Inoculación e incubación del cultivo
Tratamiento de las muestras
BIBLIOGRAFÍA GENERAL
Anexo 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105 Anexo 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
115 Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS

LaMicrobiología, es una ciencia relativamente reciente con respecto aotras ramas de
la Biología. El estudio de los microorganismos se inició a partir de que Antonie van
Leeuwenhoek en 1670 inventó el microscopio, yque a partir de los estudios de Luis
Pasteur en 1876, se logró el mayor desarrollo y reconocimiento de los microorganismos
como actores de una gran diversidad de procesos.
Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en-
fermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desdela
antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan ycerveza, entre
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves-
tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental yfarmacéutica.
El objetivo general del curso práctico de Microbiología General es que el alumno se
inicie en el conocimiento de la biología básica de los microorganismos, en sus
características morfológicas, nutricionales decrecimiento, control y que ad-
quiera las habilidades necesarias para su manipulación en ellaboratorio.
Este manual está dirigido aestudiantes que iniciarán su experiencia en el manejo de
los microorganismos, por loque consideramos de gran importancia incluiral
principio del mismo una serie de recomendaciones relacionadas con las reglas
generales del laboratorio y los principales procedimientos que el estudiante
deberá aprender, para que manipule en forma adecuada alos microorganismos
y garantizar tanto su seguridad como la de sus compañeros.
Este manual contiene 10 prácticas, diseñadas para que elestudiante se familiarice
gradualmente con los procedimientos de cultivo y observación de bacteriasy
hongos. El orden de presentación, corresponde al programa del curso teórico
trimestral de Microbiología General, que forma parte del plan de estudio de las
carreras de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial im-
partidas en la UAM-Iztapalapa.
En cada práctica se presentan los Objetivos yuna breve Introducción para facilitarla
comprensión delos mismos, después se indican los Materiales necesarios y
Procedimientos arealizarse en forma de instrucciones numeradas que se com-
plementan con figuras y esquemas.
Posteriormente, en cada práctica se proponen formas de presentación de los resulta-
dos en cuadros, para que el alumno recopile sus observaciones. También seinclu-
yen preguntas en forma de cuestionarios que el estudiante debeiá resolver con-
sultando los materiales bibliográficos sugeridos al final de este manual.
También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparación
de soluciones ycolorantes (anexo 1) yde medios de cultivo (anexo 2), necesa-
rios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) de
fotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicasde
diferenciación microbiana.
o
•o
i
IIo
•o
manual de prácticas del

Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu-
ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
Dra. Ma. de LosAngelesAqulahuatl
Dra. Ma. de Lourdes PérezChabela
i
a
o

RECOMENDACIONES PARA EL ESTUDIA!*
Reglas de laboratorio
1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata delaboratorio bien abotonada, que deberá quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
2. No deberá sacar del laboratorio ningún equipo, medios ocultivos microbianos.
3. Evitar laacumulación sobre lamesa de trabajo de objetos no relacionados con lapráctica delaboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.
4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento obebida dentro del laboratorio.
5. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos otocarse la cara con las manos oalgún otro objeto. Se deberá lavar
meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6. Por seguridad nodebeiá pipetear oralmente ningún tipo decultivos microbianos, esta actividad deberá
realizarse con pipetas accionadas deforma mecánica o automática, tratando deevitar la formación de
aerosoles.
7. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención ypongan en riesgo la seguridad en el trabajo
que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
1. Antes ydespués de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con eldesinfec-
tante que se leproporcionará para este fin.
2. Cuando se utilice elmechero, este deberá colocarse alejado del microscopio yotros equipos así como de
sus cuadernos oprendas de vestir.
3. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-
nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará
el profesor.
4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, potenciómetros, etc.) yreportar al maestro cualquier irregularidad en elfuncionamiento.
5. En caso deproducirse unincendio o una herida personal, elalumno deberá notificarlo deinmediato al
profesor. En elcaso de derrame de cultivos orotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservarla
calma yademás de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
a. Colocar toallas de papel sobre elmaterial derramado para evitar su dispersión
b. Poner abundante solución desinfectante sobre las toallas
manual de prácticas del LABORATORIO PE NIICROBlOLOGt**
a
•o

c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la
eliminación de materiales contaminados.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio
1. Bata de laboratorio limpia y con botones
2. El protocolo de la práctica y bitácora de laboratorio
3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas.
iDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

o
o
o
Preparación y esterilización de materiales
y medios de cultivo

Objetivos introducción
Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam-
generales de las técnicas de estéril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
zación de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
dios de cultivo de uso común en Mi- hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físi-
crobiología. Observará el efecto de co y químico. o
trol de la contaminación microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y este-
en el laboratorio. rilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es
un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
La esterilización con calor seco y húmedo son los procedimientos de
mayor utilización en Microbiología. El calor seco desnaturaliza las
enzimas y destruye a los microorganismos por oxidación, por ejem-
plo al ponerlos directamente a la flama de un mechero o en horno
a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican principal-
mente en la esterilización de asas de inoculación y todo tipo de
material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cul-
tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más
recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a
presión para alcanzar temperaturas de 121°C. El material se deja a
esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc-
ción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resis-
tentes al calor.
Cuando se requiere esterilizar diferentes materiales sensibles al calor como
las soluciones de vitaminas, aminoácidos, etc. se esterilizan por
filtración en membranas estériles de 0,2 mieras de diámetro y para
el caso de materiales plásticos es recomendable el uso de gases
como oxido de etileno o con radiaciones gamma. Las superficies
generalmente se desinfectan con radiaciones U.V. o compuestos
químicos en forma líquida como: los fenoles, compuestos
cuaternarios de amonio (alquildimetil bencilamonio), formaldehído,
alcoholes, halógenos y detergentes.
Cada uno de estos procedimientos tienen ventajas y desventajas de uso,
los sistemas de filtración son muy eficientes y rápidos para la este-
rilización pero sólo se aplican en pequeños volúmenes. Los fenoles
y compuestos cuaternarios de amonio son muy efectivos para la
desinfección de superficies pero son muy corrosivos. Los
detergentes y los alcoholes tienen actividad limitada contra espo-
ras bacterianas y algunos virus por lo que sólo son desinfectantes.
1 3
m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l - * . . ' . ; . , ' - . * . , : ; . . . ? . ::* ' , < ; >•<*., -r-r.r- - "* • '

(O
a 1 potenciómetro
1 horno de calor seco
Materiales
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapón de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapón de baquelita
9 cajas de Petri de vidrio
3 pipetas de 1 o 2 mL
3 pipetas de 10mL
1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 mL
1 parrilla de calentamiento con agitación
1 autoclave
1 mechero Fisher
1incubadora a 35°C
1hisopo estéril, algodón y gasa
papel manila o estraza para envolver
Caldo nutritivo (Anexo 2.1)
Medio de agar nutritivo (Anexo 2.2)
Medio de agar papa dextrosa PDA (Anexo 2. 6)
Medio mínimo de sales (Anexo 2.3 )
Soluciones amortiguadoras pH 4 y 7
Procedimiento
El profesor explicará los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología, enfatizando en la
desinfección de áreas así como en la preparación y esterilización de los medios de cultivo y materiales necesarios
para el trabajo cotidiano con microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudian-
te aprenda a envolver los materiales, así como su manejo en condiciones asépticas.
Preparación del material de vidrio y medios de cultivo
1. Lavar perfectamente las cajas de Petri y pipetas con escobillón y detergente. Enjuagar con abundante agua
corriente.
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-
res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún
otro medio.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocará un capuchón de papel.
4. Preparar 20 mL de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y ajustar el pH a 6.5-7.0 en un
potenciómetro, agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solución de HCI 0.1 M o solución de NaOH
0.1 M, en caso de que el pH sea más alcalino o ácido respectivamente. Vaciar 5 mL en cuatro tubos de cultivo
con tapón de baquelita que deberán cerrar sin llegar al tope.
14

Ia
o
•o
5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar lamezcla en una parrilla con agitación constante hasta
ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) yvaciar enseguida 5mL de medio en tres tubos
con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente lapipeta para evitar que se solidifique elagar. El resto se
esteriliza en elautoclave.
6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar
el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación ycalentar hasta ebullición durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se
taparán con tapón de algodón ygasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
Esterilización de materiales y medios de cultivo
1. Las cajas de Petri ypipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2horas. Después de sacarlas,
dejarlas enfriar yabrir los paquetes únicamente en área aséptica.
2. Los medios de cultivo se esterilizarán en autoclave de acuerdo alas siguientes instrucciones:
a. Revisar que el nivel de agua coincida con la marca en el tubo indicador. En caso necesario añadir agua
destilada.
b. Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto. Acomodar los medios y materia-
les en la canasta del autoclave ycolocarla dentro.
c. Cerrar la puerta, apretar las manijas de dos en dos en posición encontrada y esperar aque salga el vapor
de agua por el orificio de purgado. Después cerrar este orificio con la válvula de seguridad.
d. Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar los 121°C o15 Ibs de presión revisando continuamentela
escala del manómetro. Una vez alcanzada esta temperatura deberá bajarse elnivel de calentamiento mo-
viendo la perilla de control al nivel medio obajo.
e. Mantener el equipo en estas condiciones durante 15 minutos
f. Apagar la autoclave y dejar que baje la presión al valor de "0".Quitar la válvula de seguridad y con la ayuda
de guantes de asbesto o una jerga húmeda abrir cuidadosamente lapuerta, de adelante hacia atrás para
evitar quemaduras por la salida del vapor.
Preparación de las cajas de Petri ytubos con medios de cultivo
1. Lostubos con medios de cultivo con agar, se deberán colocar en una superficie inclinada de tal forma que el
medio se solidifique auna distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo.
2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen auna temperatura
aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
sentir un calor excesivo.
3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDAy 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) yposteriormente envolver las cajas cuidado-
samente con papel estraza oacomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.
5. Guardarlas en refrigeración hasta 24 horas antes de utilizarlas.
115
manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L

Prueba de esterilidad de materiales
1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación
ajustada a 30 °C durante 24-48 horas.
2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez,
nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación
de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.
3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto
en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire".
(0
CQ
0
4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en
área aséptica".
5. La tercer caja se conservará sin abrir y se etiqueta como "control".
Resultados
A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo
(AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.
B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el
manejo de los materiales.

Cuadro1
Descripción morfológica de microorganismos en cajas de Petri con diferentes medios de cultivo.
MEDIO
DE CULTIVO
AGAR
NUTRITIVO
MÍNIMO
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Abierta al aire Abierta en área
aséptica
Control
a
t
A
a
«
1)
Cuestionario
¿Cuáles son los métodos deesterilización más utilizados enMicrobiología? ¿En que tipo dematerialesse
aplica cada uno?
2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos deesterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómose
relacionan estos procedimientos con lapasteurización?
17

•
o
o
Preparación, fijación y
coloración simple de frotis

Objetivos
Que el alumno aprenda las técnicas
de preparación defrotis, defijación
y coloración más utilizadas eneles-
tudio microscópico de cultivos
bacterianos, obtenidos de medios
sólidos ylíquidos. Que identifique las
principales formas bacterianas yla
importancia de las tinciones simples
en lacaracterización morfológicade
estos microorganismos.
Introducción
Debido al pequeño tamaño de la mayoría de losmicroorganismos, se
requiere deunmicroscopio óptico, yasea decampo claro o decampo
oscuro para hacer ladescripción morfológica de éstos. El microscopiode
uso más común es elde campo claro, en elque laobservación de células
vivas es limitada debido aque las células son incoloras ypermiten elpaso
de una gran cantidad deluz.
Laobservación de frotis teñidos es más recomendable. Elfrotis se prepara
haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfi-
cie transparente, en la cuál sefijan y tiñen losmicroorganismos.
De acuerdo al número de soluciones colorantes ya los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:
simple, diferencial, negativa yselectiva.
Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar resi-
duos del medio, que al quemarse darán interferencias en las obser-
vaciones ylos de colonias de medios sólidos se fijan generalmente
con calor. Después de lafijación, los frotis son teñidos con diferen-
tes colorantes sintéticos derivados de anilina.
Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car-
gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:
Cloruro de Azul de metileno Azul de metileno* +
(Cromoforo)
ci-
Si elcromoforo es un ion positivo elcolorante es de tipo básico, pero sila
carga es negativa será de tipo ácido. La mayoría de las bacterias son
teñidas por colorantes básicos, que permean la pared celular y se
adhieren por enlaces iónicos débiles a moléculas con cargas nega-
tivas de lacélula bacteriana. La tinción delas bacterias con azulde
metileno, esunejemplo detinción simple que facilita laobserva-
ción deforma, tamaño y arreglo delas células.
o
•o
o
Ia
o
•o
21

Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asade siembra
5 Portaobjetos
Piceta conagua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2)
Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7)
Fenol al 2%(Anexo 1.9)(0
CQ Aceite de inmersión
o
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcussp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de
cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, loscuales fijará yteñirá conazul de metileno.
El profesor explicará losprincipios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación.
Preparación de frotis
1. Lavar perfectamente losportaobjetos, secarlos conpapel y etiquetarlos (Figura 1).
2. Prender el mechero y esterilizar el asaen laflama del mechero hasta quese ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después
acercar al mechero eltubo de cultivo, quitarle eltapón yflamear rápidamente la boca del mismo. Introducir
el asaen el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar lamuestra enel centro delportaobjetos, extenderla suavemente en
un área circular de 2 cm. dediámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir losprocedimientos 3 y 4 por2-3veces más.
5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la quese mezcla unapequeña muestra delcultivo quesetoma siguiendo lasindicacionesdel
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
Fijación del frotis
1. Fijar los frotis decultivos líquidos con dos gotas demetanol oetanol absoluto ydejar secar alaire (hacer esto
en zonas alejadas al mechero).
22

2. Los frotis decultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto sepasaiá elfrotis rápida-
mente 2-3 veces enel interior delaparte amarilla delaflama del mechero.
3. Palpar laparte inferior del portaobjetos con eldorso de lamano izquierda para enfriar ycomprobar que no
hubo sobrecalentamiento.
Tinción simple
1. Cubrir elfrotis con 2 gotas deazul demetileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso decolorante con lavado suave alagua corriente o con laayuda dela piceta con agua
destilada.
3. Dejar secaral aire
Marcar el área por debajo del portaobjeto
CULTIVO SÓLIDO CULTIVO LIQUIDO
|
ia
o
•o
Coloque 1o 2 gotas deagua Colocar 1o 2 asadas demediode
cultivo con asa estéril
Con asa estéril tomar una
muestra delacolonia y
mezclarla con el agua
Distribuir en lazona marcada
Dejar secar al aire Dejar secar al aire. Repetirlos
procedimientos anteriores dos veces
Pasar rápidamente sobre la
flama del mechero
Fijar con 2 gotas dealcohol, y
dejar secar al aire
Figura 1.Preparación yfijación de frotis bacterianos a partir de cultivos sólidos y líquidos

Observación al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota
de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
B. Comparar sus observaciones con las reportadas en la literatura.
24

Cuadro 2
Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos
Cultivo: Líquido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.)
Agolpamiento de las células
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamaño:
Cultivo: Sólido
Aumento total:
Forma: (cocos, bacilos, etc.
Agrupamiento de las células
(solos, pares, cadenas, etc.)
Tamaño:
Escherichla coll Streptococcus sp.
0)
(0
t(0
a
Cuestionario
1. Investigue cuáles son las estruauras celulares omoléculas responsables de la tinción simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.
2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol yno con calor? ¿Por qué se deben
poner varias veces muestras del cultivo líquido ysólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis?
25

3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de
inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?
4. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple?
a
o
5. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de frotis?
6. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a
- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
CRC Press, 1989.
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

z
' - s
Í ' , -'-
0
Tinción diferencial de Gram y
tinciones selectivas

Objetivos
Que elestudiante clasifique algunas
especies bacterianas en Gram positi-
vas oGram negativas de acuerdo a la
tinción de Gram. Que observe estruc-
turas bacterianas especiales, como las
endosporas ycápsulas con tinciones
selectivas. Que comprenda laimpor-
tancia que tienen estastinciones para
la caracterización e identificaciónde
las bacterias.
introducción
Latinción propuesta por elmédico danés Christian Gram en1884, es una
de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifi-
ca loscultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y
Gram negativas. El método se fundamenta en elhecho de que el coloran-
te primario (cristal violeta) tiñe porigual a todas lasbacterias, pero la
combinación con elcolorante es más permanente en los gram positivos.
Para establecer ladiferenciación enestos dos grupos, se aplica un disol-
vente del colorante primario que no tiene efecto sobre elgrupo de
microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de
aquellos que noson capaces deretenerlo, quedando por lotanto
completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy di-
fícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante
llamado secundario, como lasafranina. Este colorante nomodifica
el color de los microorganismos que habían retenido el color prima-
rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados.
Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios enla
composición química y estructura de las paredes celulares, que faci-
litan laretención o eliminación del colorante primario después del
proceso de decoloración.
Otras tinciones que permiten obtener mayor información son lanegativa
y la selectiva. La tinción negativa facilita lasobservaciones de la
morfología ytamaño delas bacterias sin alteración por efectodel
calor así como deestructuras especiales, como lacápsula de algu-
nas especies bacterianas. La cápsula también llamada glicocálixes
una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o
polipéptidos, que confiere protección alas bacterias contra la dese-
cación y la fagocitosis.
La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla
de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar enel
microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que apa-
recen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un
fondo obscuro.
Lastinciones selectivas permiten observar estructuras especializadas como
las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en lasque su
presencia, forma y localización son importantes criterios de clasifi-
cación taxonómica.
Además, debido a laresistencia al calor de las endosporas ya que algunas
especies son microorganismos patógenos degran toxicidad, su de-
tección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés.
manual de prácticas del arabio m:

Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta conagua destilada
Cristal violeta (Anexo 1.3)
Safranina (Anexo 1.8)
Lugol (Anexo 1.5)
Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6)
en Verde de malaquita (Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% (Anexo 1.9)
Aceite de inmersión
Microscopio compuesto de campo claro
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcussp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción
de Gram.
También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción
negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.
Tinción diferencial de Gram
a) Cubrir el frotis con2 gotas de cristal violeta durante 30 segundos a 1 minuto
b) Lavar cuidadosamente el frotis conagua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con2 gotas de lugol por 30 segundos.
d) Lavar cuidadosamente el frotis conagua.
e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluyamás
tintura.
f) Inmediatamente lavar conagua.
g) Aplicar 2 gotas de safranina durante 30segundos.
h) Lavar nuevamente conagua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con unatoalla de papel y dejar
secar al aire.
iDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

Tinción selectiva de endosporas
a) Colocar un pequeño trozo depapel filtro sobre elfrotis deBacillus subtilk (Figura2).
b) Agregar verde demalaquita sobre elpapel filtro de tal manera que cubra toda lapreparación.
c) Colocar el portaobjetos sobre un vaso deprecipitados con agua en ebullición.
d) Dejar durante 5minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) yeliminar
el colorante con agua destilada.
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
f) Lavar nuevamente y dejar secar alaire.
t
a
"O
(a) (b)
(e)
Figura 2.Tinción selectiva de endosporas bacterianas
Tinción negativa para observación decápsulas
a) Colocar una pequeña gota detinta china en el extremo de unportaobjetos; colocar junto una gotadel
cultivo líquido deKlebsiella sp. (Figura 3). Sise trata deun cultivo sólido, hacer una suspensión del micro-
organismo enuna gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china.
b) Distribuir la mezcla a loancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular enángulo de
45° sobre lamuestra.
I
31

10
a
o
c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
d) Dejar secar al aire.
(a)
(d)
Figura 3.Técnica de tinción negativa
Observaciones al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de
aceite de inmersión sobre la preparación.
3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con las reportadas en la literatura.
32

Cuadro 3
Descripción microscópica de cultivos baaerianos
Descripción del cultivo: (líquido
o sólido, edad del cultivo, etc.)
Aumento total:
•o
I
o
cu
t
ti
a
•o
Forma: cocos, bacilos
Agolpamiento de las células
Tamaño:
Reacción de Gram
TINCIÓN DE ENDOSPORAS
Aumento total:
Badllus subtills Streptococcus sp
Forma: cocos, bacilos
Agrupamiento de las células
Tamaño:
TINCIÓN DE CÁPSULA
Aumento total:
Klebsiellasp. Streptococcus sp
Cuestionario
1. Explique enforma completa lateoría que explica latinción deGram. Investigue otros dos ejemplos de
tinción diferencial.
33

2. ¿Cuáles son las fuentes de error más comunes en la tinción de Gram?
3. ¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma impor-
tancia que para las bacterias? ¿Por qué?
4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificul-
tades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?
5. Explique el fundamento de la tinción negativa realizada en la práctica.¿Qué tipo de información se obtiene?
Investigue otra técnica de tinción selectiva que permita observar estas estructuras bacterianas.
• Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a
Company, Inc. EEUUA.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
• Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,
USA. CRC Press, 1989.
j
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.

^ í - w'íV
^
Métodos de cultivo y
aislamiento de bacterias

Objetivos Introducción
Que elalumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios decultivo delaboratorio
tes técnicas deaislamiento enme- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación ydeterminar sus
dios de cultivo sólido para laobten- actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de
ción decultivos puros debacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables
Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer,
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos para el cultivo dedife- Generalmente lasbacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos
rentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conserva-
ción, así como para estudiar sus características de crecimiento. Esim-
portante recordar que lainoculación de los microorganismos en los
medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cerca
del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan
la presencia de microorganismos indeseables ocontaminantes.
Lastécnicas de aislamiento, permiten la obtención de microorganismosa
partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las
que hay una gran diversidad microbiana, así como para comprobar
la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros están forma-
dos por un solo tipo de microorganismo; yson indispensables para
conocer las características morfológicas, propiedades de tinción,
actividad bioquímica, patogeniddad, sensibilidad a antibióticos e
identificación de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por métodos de
dilución, en medios sólidos por estría en placa o en medios líqui-
dos. En el primer caso se considera que cada célula bacteriana que
se separa daiá origen auna población que formará una colonia ca-
racterística, visible asimple vista.
La limitación principal de estas técnicas de dilución, es que no es práctica
para el aislamiento apartir de mezclas donde el microorganismo de
interés se encuentra en pequeñas cantidades, donde solamente se
obtendrán las bacterias dominantes.
Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja densidad, se aplican mé-
todos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que con-
tienen nutrientes especiales, antibióticos, altas concentraciones de
sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el
crecimiento del microorganismo de interés yse conocen como se-
lectivos ode enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar alos medios de cultivo otros componen-
tes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. para distinguir espe-
cies bacterianas diferentes por la forma enque metabolizanlos
sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia omodifi-
cación del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como
medios diferenciales y son de gran utilidad para la caracterización e
identificación de especies bacterianas.
•o
i
i
8.
•o
manual de prácticas del LABORATORIO ÍJ£ MICROBIOLOGÍA GENERAL
_tDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estéril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
tú 1 Asa de inoculación
0
1 Parrilla de agitación
1 Autoclave
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtilis, Escherichia colí, Staphylococcusaureus, Pseudomonas
fluorescens, Klebslellasp. y Streptococcus sp.
También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada.
Técnica de estría cruzada
a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa
previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la siembra en el último cuadrante, no se
deberá flamear el asa de siembra y se hará una estría más abierta (simple).
Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
1. Sembrar un cultivo puro diferente en cada uno de los dos tubos con caldo Nutritivo y en tubos con agar
nutritivo inclinado.
2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
.

•o
o
Icu
a
0)
Figura 4. Aislamiento de bacterias por estría cruzada en placa
(a)
(b)
Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados ypor picadura
(b) en tubos solidificados en forma recta.
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMBAgar, otra con Agar 110yuna de MM. Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estría simple.
2. Enotra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra
problema.
39

Condiciones de incubación
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada,
seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5.
ce
0
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
40

Cuadro 4
Morfología colonial decultivos bacterianos
Aislamiento por Estría
cruzada
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Borde-.
Superficie:
Aspecto:
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Siembra en medios
selectivos ydiferenciales:
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
Escherichla coli
MEDKDEMB
Streptococcus sp
MEDÍ
(íj
0110
MUESTRA PROBLEMA
MEDIO fMÍNIMO
o
(0
a
•o
Nota: La descripción colonial puede hacerse considerando los siguientes criterios
Forma: circular, irregular, filamentosa o rizoide
Borde: entero, lobulado, aserrado
Superficie: lisa orugosa
Aspecto de la colonia: húmeda, seca, butirosa
Elevación: convexa, plana, hundida
Luz transmitida: translúcida, opaca
Luz reflejada: brillante, mate
Consistencia: dura, blanda, mucoide
41

Cuadro 5
Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados de
Agar Nutritivo
w y w w
Crecimiento: arborescente,
filiforme, rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tubo de
Caldo Nutritivo
Crecimiento: superficie
como película, como sedi-
mento, turbidez en todo
el tubo
Color:
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
r~
Crecimiento: en forma de
película superficial, a lo
largo de la picadura,
solo en el fondo
Color:
i-DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

Cuestionario
1. ¿Que es el agar yde donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona alos microorganismos?
2. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110yMM? ¿Cuáles son los componentes opropiedades
responsables de su función como medios selectivos o diferencíales?
O
|
o
II
3. ¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-
cias que se leagregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?
4. ¿Cuál es lainformación que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado en forma recta?
manual de prácticas del LABORATORIO PE MlCRClBiCiLClGJA GEliERAL
_kDERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com

• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
• Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
• Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).

Métodos de cultivo y
descripción morfológica de hongos

5
(0
£
a
o
"O
Objetivos introducción
Que el alumno aprenda las técnicas Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bac-
de cultivo y manipulación de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmó-
tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos.
te conozca las principales caracterís-
ticas morfológicas (macroscópica y Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos
microscópicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son
absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-
lulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos
dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos
formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta-
les como la temperatura.
Las levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribui-
das en la naturaleza; frecuentemente se encuentran formando una
cubierta polvosa fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reprodu-
cen asexualmente por gemación, un proceso por el cuál brota una
protuberancia o yema de la célula madre que posteriormente se
separa como célula individual.
Elcuerpo o estructura vegetativa característica de los hongos filamentosos
(mohos) se denomina talo, generalmente constituido de hifas
ramificadas que forman el micelio. Las hifas de algunos hongos
presentan tabiques transversales o septos, aunque en el caso de los
Zygomycetes las hifas no presentan estos septos y se les conoce
como hifas cenocíticas.
El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual, por
fragmentación de hifas vegetativas o por la producción de abun-
dantes esporas en conidióforos y esporangióforos formados en hifas
aéreas llamadas hifas reproductivas. Sin embargo, la descripción
de las estructuras de reproducción sexual es el principal criterio de
clasificación, por el que pueden ser ubicados en tres subdivisiones
o phylum: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota.
Se estima que puede haber 1.5 millones de especies de hongos, de las
cuáles se han descrito más de 250 000 y de éstas solo se conocen
150 especies patógenas para el hombre y otras tantas para plantas y
animales. Es de gran importancia conocerlos, por los beneficios
que proporcionan al hombre, ya que como se mencionó la mayoría
son saprobios (utilizan materia orgánica muerta), por lo que tienen
una gran capacidad de reciclar materiales orgánicos de diferentes
tipos, de tal forma que se pueden utilizar como agentes de
biodegradación de compuestos recalcitrantes en procesos de
biorremediación.
47

Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
m 1 Probeta de 100 mL
0
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de disección
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio óptico de campo claro
Aceite de inmersión
Autoclave
Incubadora a 30 °C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger,PenicHHum chrysogenum, Rhizopus
oliQosporus, Trlchodermaviridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la
realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDAy de la misma manera inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3. Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula-
ción de bacterias.
4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 °C durante 3-5 días.
48

Descripción macroscópica de levaduras y mohos
1. Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de lascolonias de Saccharomyces cerevisiae.
2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
Descripción microscópica de levaduras
t
1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teñirlo con azul de metileno.
2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo de 40X y 100X.
Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor
posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
Resultados
A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la Figura 6.
C. Investigar en la literatura como se clasifican los hongos estudiados en la práctica.
i•o
4 9
m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l : -. ,-*: v :
i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ? --,v.::'-í"<t f *

(O
m
o
conidias
conidióforo
Aspergillus niger
conidióforos
conidias O
•
10
Penicillium roqueforti
conidióforos
10 im
conidias
10 ^m 10 im
Aspergillus flavus
esporangióforo
100
porangiosporas
25 Jim
Rhizopus oligosporus
® Saccharomyces cerevisiae
conidias
conidióforos
10 ¿un
Trichoderma viride
10
conidias
OOOOooo
oooooo
OOOOOO
Penicillium chrysogenum
Figura 6. Descripción microscópica de estructuras de reproducción asexual de algunas especies de hongos.

Cuadro 6
Descripción morfológica de hongos
liliillilltllillliilllliiilliilliii
Descripción macroscópica
en PDA
•o
o
i;olor ytamaño:
Aspecto:
Textura:
Descripción microscópica:
Aumento total:
Micelio con osin septos
Tamaño:
Estructuras dereproducción
Tamaño:
Clasificación (phylum):
Descripción macroscópica
en medio Czapek-Dox:
Color ytamaño:
Aspecto:
Textura:
Descripción microscópica:
Aumento total:
Micelio con o sin septos
Tcmaño:
Estructura de reproducción
Tamaño:
Tipo de esporas
Tamaño:
51

Cuestionario
1. ¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos?
2. Elaborar un cuadro comparativo de caraaerísticas morfológicas, nutridonales y sensibilidad a antibióticos de
hongos y baaerias. Mencione lasdiferencias que hay entre lasesporas de hongos y las endosporas baaerianas.
3. Mencione los criterios de clasificación de hongos filamentosos y levaduras.
4. Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de
utilización benéfica.
• Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.
• Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económi-
ca, UNAM. México.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
52

¿fe*
Pruebas de diferenciación bioquímica

Objetivos
Que elalumno realice algunas prue-
bas bioquímicas en medios de cultivo
con sustratos específicos que permiti-
rándemostrar actividades metabólicas
de bacterias ylevaduras. Que el estu-
diante comprenda laimportanciadelas
pruebas bioquímicas para la caracteri-
zación e identificación deestos
microorganismos.
introducción
El metabolismo, es toda laserie dereacciones que ocurren en los
seres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de ener-
gía como son: la descomposición demoléculas orgánicas en los
quimiótrofos (catabolismo) o lacaptación de luz para elcaso de los
fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes
escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, son
catalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la
célula porlo que seconocen como endoenzimas, hay también
exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célu-
la para catalizar reacciones fuera de ésta.
En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los
microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo,con
sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de car-
bono yde otros nutrientes escenciales para su crecimiento.
La mayoría de microorganismos, utilizan la glucosa como fuente de car-
bono y energía. Al entrar a lacélula, laglucosa será oxidada en
forma incompleta (fermentación) ocompleta (respiración) depen-
diendo de la presencia de oxígeno y de las capacidades enzimáticas
de los microorganismos.
En la fermentación, los microorganismos obtienen 1-2 ATP/mol de gluco-
say liberan ácidos orgánicos u otras pequeñas moléculas orgánicas
como productos metabólicos; mientras que las bacterias ylevadu-
rasde catabolismo respiratorio obtienen mayor cantidad (36-38ATP/
mol de glucosa), CO2y agua.Algunas especies microbianas pueden
ser de tipo respiratorio o fermentativo de acuerdo a las condiciones
de oxigenación.
Se han propuesto numerosas pruebas bioquímicas en medios de cultivo
con indicadores de pH, para detectar la producción de ácido oálca-
li; con inhibidores selectivos como bilis, cianuro, colorantes,
sulfuros, etc., que facilitan la determinación de diferentes activida-
desmetabólicas como son:lacapacidad parafermentar carbohidratos
(glucosa, lactosa, sacarosa), catabolizar aminoácidos yurea, la pro-
ducción de enzimas específicas de tipo endo o exo como oxidasas,
reductasas, amilasas, lipasas, etc.
Como se ha observado en las prácticas anteriores, algunas bacteriasy
levaduras tienen características coloniales ymicroscópicas muy si-
milares, lo que no permite decidir si dos cultivos bacterianos ode
levaduras morfológicamente similares pertenecen a una misma
especie. Con algunas pruebas bioquímicas es posible su diferen-
ciación eincluso su identificación, cuando el número de pruebas
es suficientemente amplio.
t
(0
a
•o
55

Materiales
1 Gradilla
1 Probeta de 100 mL.
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
3 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Mechero
1 Asa de siembra
2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 )
2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de
fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo
0
de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol
(Anexo 2.9 ).
2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
(Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro)
solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)
2 tubos con 7 mLmedio de citrato de Simmons solidificados
en forma inclinada (Anexo 2.10 )
2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)
2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma
recta (Anexo 2.15 )
2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en
forma recta (Anexo 2.17 ).
Peróxido de hidrógeno 30 %
ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1).
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonasfluorescens, Klebslella
sp. y Saccharomycescerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.
Técnica de Inoculación en cajas de Petri
1. Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón.
2. En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes.
3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular.
4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas.
56

Técnicas de inoculación en tubos
1. Lostubos de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, caldo urea y leche tornasolada se inocularán
mezclando una asada de cada uno de los microorganismos.
2. Lostubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo
(Figura 5).
3. Los tubos con gelatina nutritiva yagar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta)
4. Incubar los tubos a35°C durante 24-48 horas.
Evaluación de actividades metabólicas
1. Determinar la actividad de amiiasas en las cajas de agar almidón por el crecimiento yaparición de zonas
claras alrededor de las colonias. Si no es posible observarlas a simple vista, agregar unas gotas de lugol a las
cajas yobservar la aparición de zonas claras sobre elmedio que se coloreará de azul como indicativo de
prueba (+). Comparar los resultados con la zona de la caja que se dejó sin inocular.
2. En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar-
almidón yagregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al30%. Observar la formación de burbujas que
significan una prueba de catalasa (+).
3. Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen los
mismos medios de cultivo pero sin inocular
4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio yagregar unas gotas de solución de TCA
(ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras onubosidad en elmedio.
5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones alas 24
y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de
gas en la campana de Durham
Resultados
A. Reportar los resultados en elCuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un
poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) onegativa(-)
B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
práctica
C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas
D. De acuerdo asus observaciones proponga el nombre de la especie que corresponde asu microorganismo
problema.
57
M
MI

Cuadro 7
Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica
MEDIO DECULTIVO
Agar Almidón
Escherichla cotí Saccharomyces
cerevislae
CULTIVO PROBLEMA
Crecimiento:
Color del medio con el
ugol:
Hidrólisis de almidón:
Prueba de catalasa:
Aparición de burbujas al
agregar peróxido de
hidrógeno:
Reacción de catalasa:
Gelatina Nutritiva:
Crecimiento:
Licuefacción del medio:
Formación de nubosidad
al agregar TCA al 5%:
Hidrólisis de gelatina:
Agar Nutritivo Blando: r
Crecimiento: superficial,
en la parte media,
en el fondo:
Crecimiento en la picadura
Movilidad:
58

Caldo rojo de fenol r r r r
1011011Gluc Lac Sac Man
r r
Gluc Lac Sac Man
r r r
9
TI
|
a
Gluc Lac Sac Man
Crecimiento:
Color del medio:
Ácido:
Gas:
Leche tornasolada
(Litmus Milk)
ÁddO:
Álcali:
Sin cambio:
Reducción:
Peptonización:
Coagulación:
Gas:
Caldo Urea
Crecimiento:
Color:
Hidrólisis de urea:
59

€
«i
í
í
m
o
Medio TSI
Crecimiento:
Cambio de color:
Producción de H2s:
Producción de gas:
Fermentación del azúcar:
Medio de citrato de
Simmons
r
Crecimiento:
Cambio de color:
Utilización de citrato:
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de
respiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente?
¿Porque?

2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en lapráctica. ¿Cuál es lareacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimasy
cuáles son endoenzimas?
!
0)
t
ti
a
o>
•o
3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y48 horas? ¿Qué resul-
tados se observarían enlos tubos en elcaso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la
glucosa?
4. ¿Explique por qué se busca lapresencia de precipitados de sulfuros en elfondo del tubo de TSI y no enla
superficie?
manual de prácticas del LABORATORIO PE f¥li€il€>B¡€IL0CI¡Á GENERAL

• McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
• Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
• Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).

Métodos de cuantificación
de microorganismos

a
•o
introducción
objetivos
Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa)
Que el alumno conozca algunas de de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e
las técnicas de cuantificación direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de
ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.
más utilizadas. Que compare lasven-
tajas y desventajas de cada una en Ladeterminación de peso seco es un método de cuantificación muy utili-
función de la información que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-
tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración,
recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa
y errores en la cuantificación.
El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y
económico, aun que no se pueden distinguir las células viables y no
viables.Sepuede calcular el número de microorganismos en unamues-
tra a partir del volumen de la cámaray de las diluciones de la muestra
que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1-
5/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeñovolumen
de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3
).
Entre los método indirectos, uno de los más utilizados es la medición de
laturbidez de los cultivos en un espectrofotómetro, que es relativa-
mente rápida y que se basa en la capacidad de las células
microbianas de dispersar la luz que incide sobre éstas. Como el
tamaño de las células en una población es casi constante, el grado
de dispersión es proporcional a la concentración de células pre-
sentes pero no se puede diferenciar la turbidez dada por células
viables o no viables.
Laforma de cuantificar células viables más utilizada en Microbiología, es
la de hacer diluciones y cuenta en placa con medios de cultivo es-
pecíficos para la población de interés. Esta técnica se basa en la
suposición de que cada bacteria incluida en un medio de agar o en
su superficie se multiplicará y producirá una colonia visible, en con-
secuencia el número de colonias que se observarán a simple vista
será igual al número de bacterias viables o unidades formadoras de
colonias (UFO inoculadas en el agar multiplicadas por la dilución.
Estatécnica aplicada en muestras complejas, dará una estimación aproxi-
mada del número total de microorganismos, dependiendo del me-
dio de cultivo utilizado, ya que no hay un medio y condiciones de
incubación que favorezcan el crecimiento de todos los
microorganismos. También pueden presentarse problemas relacio-
nados con falta de homogeneidad de las diluciones y en la inocula-
ción de las muestras, por lo que se pueden obtener bajos valores si
es que las células no se separan bien y valores elevados si la toma
de las muestras se hacen del fondo del tubo donde se han concen-
trado por gravedad los microorganismos.
65

Materiales
6 cajas de Petri con agar nutritivo (Anexo 2.2 )
10 Pipetas de 1-2 ml_ estériles
10 Tubos con 9 mL de ssi (solución salina isotónica= 0.89%
NaCI)
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de ssi
Vasos de precipitados
1 espectrofotómetro
w 1 cámara de Neubauer
g I pipeta Pasteur
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
1 Varilla de vidrio doblada en L
1 Microscopio compuesto
Safranina (Anexo 1.8)
Procedimiento
El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiaey Escherichla colL
Elalumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número de
células totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadoras
de colonias (UFO por dilución y siembra en placa.
Técnica turbidimétrica
1. Encender el aparato y dejar que el instrumento se caliente por 15 minutos.
2. Ajustar el aparato a la longitud de onda (520 nm)
3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de
transmitancia.
5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y
medir el valor de %T.
6. Calcule la absorbancia de la fórmula A= -log (%T/100)
7. En caso de disponer de un aparato digital ajustar la mediciones a absorbancia (D.O.).
66

o
I
8.
4)
Técnica de cuenta directa en
cámara de Neubauer
1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-
das (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mL
de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista.
3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta
Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar
que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la
población microbiana.
4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.
5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado.
6. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a
contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de
los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las
posibilidades de contar la misma célula dos veces.
7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso de
contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:
a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104
para reportar el
número de células por mL.
b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células.
Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104
para reportar el número de células por mL.
c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de
los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104
para reportar el número de células por mL.
67
m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l ' '- -.*;.:* "<< rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: *C--'. - '*:. -•'•«' :' **< .

(O
CQ
ü
8. El factor de104
por el cuál sedebe multiplicar el número decélulas por cuadro grande (C1) esporque este
cuadrado contiene un volumen de0.1 mm 3
(mide 1mm por lado y lacámara tiene una profundidad de 0.1
mm).
# células/cuadro C1 (25cuadros C2) = # células/ 0.1 mm3
X 104
= # células/mL
9. En elcaso deque el# de células sea muy grande, lasuspensión deberá diluirse yse hará lacorrección como
sigue:
# células/mL en la muestra diluida X (factor de dilución) = # células/ mLen la suspensión original.
1 mm—
1 mm 1 mm
::::::::i:E2
1mnri
0.2 mrri
Cuadro 1(10X)
Cuadro 2 (40X)
Figura 7. Cuenta en cámara de Neubauer
Técnica de dilución ysiembra en placa
1. Hacer diluciones decimales del cultivo de 105
hasta 10"9
en condiciones estériles (Figura 8). Secolocarán en
cajas dePetri con agar nutritivo por duplicado 0.1 mL de las últimas tres diluciones.
2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"
previamente esterilizada a laflama del mechero y enfriada.
3. Dejar absorber el líquido durante 10minutos
4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días para
hongos filamentosos.
5. Hacer la cuenta delas colonias delasplacas, seleccionando la dilución donde el número decolonias sea
entre 30y 300.
68

6. Silainoculación fue por duplicado otriplicado, secalcula elnúmero promedio decolonias por dilución y
este número se multiplicará por elinverso de ladilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-
ner lanúmero total deunidades formadoras de colonias (UFC)/mL en lamuestra original.
1 mL
Cultivo bacteriano
1 mL
1 mL 1mL 1mL 1 mL
10-3
io-4
io-5
io-6
io-7
O.lmL X O . l m L
0)
£
(6
a
•o
Figura 8. Técnica de dilución ycuenta en placa
Resultados
A. Reportar los resultados de cuantificación delos cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálcu-
los hechos para cada metodología.
B. Recopilar sus resultados en elCuadro 8incluyendo los de los otros equipos, indicando lamuestra analizada
por cada equipo. Discutir encada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas delasmetodologíasde
cuantificación.
69

Cuadro 8
Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas
(0
a
o
MICROORGANISMO
Escherichia colí
Saccharomyces
cerevisiae
Turbidez (D.O.) Cuenta en cámara de Neubauer
(# células totales/mL)
Cuenta viable en placa
(# UFC/mL)
Cuestionario
1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para la
cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno?
2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células.
70

3. Mencione dos aplicaciones concretas en lasque se utilicen cada una de lastécnicas de cuantificación
realizadas.
1
(0
£
ti
a
•o
4. Algunos autores sugieren lamedición de actividad biológica yla determinación de constituyentes celulares
para lacuantificación de poblaciones microbianas. Comente sus ventajas ydesventajas.
71

cú
ü
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a
Company, Inc. USA.
• Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.
Prentice Hall. España.
• Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
72

I " O»
ai*
Efeao del pH y la temperatura en
el crecimiento microbiano

Objetivos
Que elestudiante conozca elefecto
del pHylatemperatura comoparáme-
tros de control del crecimiento micro-
biano. Que elalumno comprendala
importancia deestos factores físico-
químicos en la selección depobla-
ciones microbianas en los diferentes
ambientes en que seencuentran y
los mecanismos deadaptación ani-
vel celular y metabólicos que han
desarrollado.
introducción
Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente,ya
que éste ejerce una influencia profunda ensudesarrollo al igual que
sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi-
ficar en tres grupos:
a).- Físicos.-temperatura, presiones externas, humedad.
b).- Químicos.- pH,disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc-
tos tóxicos.
c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies
coexistentes.
Algunos microorganismos están especialmente adaptados a loshabitat
extremos, donde otros nopueden sobrevivir y que incluso tienen
propiedades fisiológicas que restringen sucrecimiento atales si-
tios. Enotros habitat menos rigurosos, las fuentes de nutrimentosy
las interacciones entre poblaciones adquieren mayor importancia
en laselección delas poblaciones que se encontrarán.
Los factores ambientales que se controlan en condiciones de laboratorio
con mayor frecuencia, además de los nutrimentales son los
fisicoquímicos como: latemperatura ypH.
Todos los organismos tienen una temperatura óptima de crecimiento que
los caracteriza; en la cual muestran las tasas más elevadas de creci-
miento. También hay límites de temperatura, latemperatura míni-
ma enlasque son metabólicamente inactivos y una temperatura
arriba de lacuál elcrecimiento ya noesposible llamada tempera-
tura máxima.
De acuerdo asutemperatura óptima de crecimiento, los microorganismos
se dividen en psicrófilos (<0°C-20°C), mesófilos (20-40°C), termófilos
(40-80°C) e hipertermófilos (80-110°C). La mayoría de hiper-
termófilos son arqueas como Methanococcus¡Qneus. Las diferen-
cias entre la temperatura óptima de crecimiento ylos intervalos de
temperatura entre los cuales es posible elcrecimiento de bacterias
y arqueas determinan la separación espacial en la naturalezade
estos dominios de microorganismos.
La concentración deiones hidrógeno del medio afecta directamente a
los microorganismos y enzimas, e influye también en ladisocia-
ción ysolubilidad de moléculas que requieren. Sin embargo, algu-
nos microorganismos se han adaptado adiferentes condiciones de
acidez o alcalinidad, como Sulfolobusy Thiobacillus que crecen a
pH tan ácido como 1-2 oxidando minerales de sulfuro para produ-
cir ácido sulfúrico y son llamado acidófilos.
0)
(6
t
ti
a0)
"O
75

Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don-
de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum,Bacillusy algunas
bacterias entéricas y cianobacterias. Engeneral los hongos son mástolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 Cajas dePetri con medio dePapa Dextrosa Agar (Anexo
2.6) ajustado a pH 7.0
fió 2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-
0
do a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-
do a pH 9.0
22Tubos con 7mLde caldo microinoculación (Bioxon) ajus-
tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4Tubos con 7 mLde caldo microinoculación ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
9.0 sin amortiguador
7.0 con amortiguador (Anexos 1.1,2.19)
5.0 con amortiguador
9.0 con amortiguador
1 Asa de inoculación
3 pipetas de 1.0 mL. estériles
1 mechero Fisher
Espectrofotómetro
Microscopio estereoscópico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli,Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará.
Efecto de la Temperatura
1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas de
hongos en cada sección.
2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscópicas.
76

Manual microbiología UAM

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (17)

Destacado

Destacado (12)

Similar a Manual microbiología UAM

Similar a Manual microbiología UAM (20)

Último

Último (20)

Manual microbiología UAM