El documento describe la estructura y función de los microorganismos. Explica los objetivos de conocer la relación entre la estructura y función de los microorganismos, y asimilar cómo la estructura de los procariotas los hace útiles en microbiología aplicada. También cubre las técnicas básicas de microscopía como la preparación de muestras y diferentes métodos de tinción para visualizar las características de los microorganismos.

1. Estructura y función de
los microorganismos
Objetivos
• Conocer
-La relación entre la estructura y función de los
microorganismos
• Asimilar
-La estructura de los procariotas los hace enormemente
interesantes en microbiología aplicada
• Capacidad
– Manejar las técnicas más frecuentes en un laboratorio de
Microbiología y aprenda a plantear experimentos sencillos
y a interpretar y discutir científicamente los resultados
1
– Manejar, ajustar y mantener los microscopios
–

2. Unidad 2. Estructura y función
de los microorganismos
Capítulo 2: El estudio de la estructura
microbiana: Microscopía y preparación del
especimen
2

3. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Las lentes y el desvío de la luz
• La luz es refractada (desviada)
cuando pasa de un medio a otro
• El índice de refracción
– Es una medida del grado en el que una
sustancia reduce la velocidad de la luz
• La dirección y la magnitud de la
desviación se determina por los
índices de refracción de los dos
medios que forman la interfase
3

4. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Lentes
• Una lente convexa enfocará
los rayos luminosos en un
punto concreto denominado
punto focal (F)
• La distancia entre el centro
de la lente y el punto focal
es la distancia focal (f)
• Los aumentos que
proporciona una lente están
relacionados con la
distancia focal
– A menores distancias
focales ⇒ más aumentos
4

5. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
El microscopio óptico
• Tipos
– Microscopio de campo claro
– Microscopio de campo oscuro
– Microscopio de contraste de fase
– Microscopio de fluorescencia
• Son microscopios compuestos
– La imagen se forma por la acción
de ≥2 lentes
5

6. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
El microscopio de campo claro
• Produce una imagen oscura sobre un fondo luminoso
• En general de 3 a 5 objetivos con lentes diferentes (si la
imagen permanece enfocada a medida que se cambian los
objetivos el microscopio se denomina parfocal)
• Aumento total (producto del aumento de las lentes del
ocular y el objetivo)
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7. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
•
Resolución de distinguirmicroscopioestán
Capacidad de una lente de separar o
un entre objetos pequeños que (d)
próximos
• La longitud de onda de la luz empleada es un factor fundamental en la resolución
(filtro azul en los microscopios del laboratorio)
A menor longitud de onda ⇒ mayor resolución
d= 0.5 λ/n sen θ n = índice de refracción
Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico
(n sen θ)
•Distancia de trabajo •Aceite de inmersión
— distancia entre la superficie frontal — aumenta el índice de refracción
Nagua= 1.33
Naceite: 1.45
7 θ =Apertura angular

8. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Microscopio de campo oscuro
• Produce una
imagen
iluminada del
objeto sobre un
fondo oscuro
• Se emplea para
observar
organismos
vivos en Treponema
preparaciones
sin teñir Condensador Abbé =
produce un cono hueco de
luz
Diafragma de campo oscuro
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9. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Microscopio de contraste de fases
• Aumenta el contraste entre las estructuras intracelulares
que tienen ligeras diferencias en el índice de refracción
• Excelente para observar células vivas sin teñir
9

10. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Microscopia de contraste de
interferancia diferencial o técnica
Nomarski
• Similar a la de contraste de fases
– Crea imágenes sobre la base de una detección de diferencias
en el índice de refracción y el espesor de la muestra
– Excelente para observar células vivas
• Emplea luz polarizada
– Esto mejora el contraste y da como resultado una imagen
tridimensional
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11. Brightfield microscopy image of cultured epithelial cells using a 20X objective
Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.
Differential Interference Contrast (DIC or Nomarski) image
of cultured epithelial cells using a 20X objective.
11

12. Fundamentos y tipos de microscopios ópticos
Microscopía de fluorescencia
• Expone un especimen a luz ultravioleta,
violeta o azul
• En general, el especimen se tiñe con
fluorocromos
• Se observa, en un fondo oscuro, una
imagen brillante del objeto como resultado
de la fluorescencia emitida por la muestra
Protozoo flagelado
Crithidia luciliae teñido Live/Dead stainig: Mezcla de
con anticuerpos Micrococcus luteus y Bacillus cereus
fluorescentes (verdes vivas, rojas muertas)
12

13. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Preparación y tinción de la
muestra
• Aumenta la resolución
• Acentúa las características
morfológicas
• Conserva la muestra
13

14. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Preparación (Fijación)
• Proceso mediante el cual se procesan y fijan en su posición las
estructuras internas y externas de la célua
• Además se mata al microorganismo y se fija firmemente al porta
objetos (microscope slide)
– Fijación por calor
• Preserva la morfología general pero no las estructuras
internas
– Fijación química
• Protege la subestructura fina y la morfología de los
microorganismos delicados de mayor tamaño
Ej.:
• aldehídicos (al formaldehído, el
paraformaldehído, el glutaraldehído, la
acroleína),
• el ácido ósmico
• el tetróxido de osmio
• los compuestos mercúricos y crómicos,
• los alcoholes, la acetona, el dietil-
pirocarbonato.
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15. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Colorantes y tinción simple
• Colorantes (dyes)
– Hacen más visibles las estructuras internas y
externas aumentando el contraste con el fondo
– Tienen dos características fundamentales
• Grupos cromóforos
– Grupos químicos con dobles enlaces
conjugados
– Dan al colorante su color
• Afinidad por los componentes celulares
– se unen mediante enlaces iónicos (los
más comunes) , covalentes o hidrófobos
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16. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tipos de tinción
• Tinción simple
– Se emplea un solo colorante.
Se dividen en dos clases
generales
– Colorantes básicos se
emplean frecuentemente
• Tienen cargas positivas
• Ej.: Cristal violeta, fucsina
básica, safranina, verde
malaquita Safranina
– Colorantes ácidos se
emplean menos
frecuentemente
• Tienen cargas negativas
• Ej.: Eosina, Fucsina ácida
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17. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tipos de tinción
• Tinción diferencial
– Se emplean dos o más colorantes
– Divide a las bacterias en grupos diferentes según
sus propiedades de tinción:
• Ej.: Tinción de Gram
• Ej.: Tinción ácido alcohol resistente
• Tinción de Gram
– Es la tinción diferencial más empleada
– Divide a las bacterias en grupos diferentes
según diferencias en la pared celular
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18. Gram positiva
Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Gram negativa
18

19. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tipos de tinción
• Tinción Ácido-alcohol resistente
(Acid-fast staining)
– Se tiñen calentando una mezcla de
fucsina básica y fenol (Método de Ziehl-
Neelsen)
– Tras la tinción no se decoloran fácilmente
debido al elevado contenido en lípidos de
las paredes de estas células
• En particular ácidos micólicos (lípidos
hidroxílicos de cadena ramificada)
Mycobacterium leprae
– Particularmente útil en la tinción Colorante de contraste: azul de metileno
de miembros del género
Mycobacterium
Ej., Mycobacterium tuberculosis –
causente de la tuberculosis
Ej., Mycobacterium leprae –
causante de la lepra
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20. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tinción de estructuras específicas
• Tinción negativa
– Se emplea frecuentemente
para visualizar las capsulas
difusas que rodean a algunas
bacterias
– Se mezclan las bacterias con
tinta china o colorante de
nigrosina y se extienden
sobre un porta
– Las capsulas se observan sin
color sobre un fondo oscuro
20
Cryptococcus neoformans – tinción
negativa con tinta china

21. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tinción de estructuras específicas
• Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton)
– Técnica de doble tinción
– Las esporas se tiñen primero calentando las
bacterias con verde malaquita
– Después de desteñir se contratiñe con safranina
quedando las células vegetativas y las endosporas
con colores diferentes
– Son difíciles de teñir por eso se observan también
en tinciones simples
• Tinción de flagelos Bacillus cereus
– Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente
colorante como para ser observados
– Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre
de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos
y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o
fucsina básica (Método de Gray)
21
Vibrio cholerae O1

22. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tinción de estructuras específicas
Sistemas de marcaje inmunocitoquímico
• Métodos directos
– el primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo
de marcador fluorocromo (pierde fluorescencia con el tiempo)
– Se pueden emplear varios anticuerpos diferentes Ej.: 3
• Métodos indirectos
– El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un
segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador
– El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso.
– Es más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se
pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la
señal.
– basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder
reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes
22

23. Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica
Tinción de estructuras específicas
Sistemas de marcaje inmunocitoquímico
• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente
– Un problema importante en el uso de anticuerpos (primarios o
secundarios) marcados
• las técnicas químicas de formación de enlace covalente entre el anticuerpo y el
marcador pueden destruir parcialmente la reactividad del anticuerpo.
– En el método de puente sencillos la primera capa está formada por el
anticuerpo primario (por ej. obtenido en conejo). La segunda capa por un
anti-anticuerpo, secundario (por ejemplo oveja anti conejo), la tercera por
un anticuerpo anti-peroxidasa (por ejemplo conejo anti peroxidasa)
producido en la misma especie que el primario y la cuarta por peroxidasa.
23

24. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
Microscopio electrónico
• Se emplean haces de
electrones para
producir un imagen
• La longitud de onda de
los haces de
electrones es mucho
menor que la de la luz,
dando lugar a un gran
aumento de la 0,2 µm
resolución
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25. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
Microscopio electrónico de
transmisión
• Los electrones se dispersan
cuando atraviesan una
sección fina de la muestra
• Los electrones transmitidos
(aquellos que no se
dispersan) se emplean para
producir una imagen
• Las regiones más densas de
la muestra dispersan más
electrones y aparecen más
oscuras
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26. Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos
Microscopio electrónico de
barrido a partir
• Crea la imagen
de los electrones
reflejados en la
superficie de la muestra
• Produce imágenes en
3D de las
características
superficiales de la
muestra
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27. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
Preparación de la muestra
• Los procedimientos son similares a los empleados en
microscopía óptica
• Para la microscopía electrónica de transmisión las
muestras deben ser cortadas muy finas (de 1-2 µm a 60
nm) con un ultramicrotomo
• También pueden
fracturarse en frio
(criofractura) con una
cuchilla quedando
expuesta la membrana
interna
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28. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
Preparación de la muestra
• La muestra se fija químicamente (Ej.:
Glutaraldehido) y se tiñe con materiales
electrodensos (Uranilo, platino y plomo)
• También puede emplearse inmunodetección
si se marcan los anticuerpos con oro
coloidal (esferas de 2-3 nm adsorbidas a los
anticuerpos)
28

29. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
0,5 µm 0,5 µm
Ochoa de Alda et al. 2004 Immunolocalization of NblA, a protein involved in phycobilisome turnover,
29
during heterocyst differentiation in cyanobacteria.

30. Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica
Otros métodos de preparación
• Sombreado
– Recubrimiento de la
muestra con una capa
fina de un metal
pesado
– La muestra se recubre
desde un lado de
forma que unas áreas
se cubren más que
otras
– La zona cubierta, más
electrodensa se ve
clara y la zona menos
cubierta más oscura
30

31. Nuevas técnicas de microscopía
Nuevas técnicas de microscoía
Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)
• Se emplean haces de luz
láser para iluminar la
muestra
• Un ordenador recoge y
agrupa las imágenes de
cada punto para generar
una imagen tridimensional
• Permite controlar la
profundidad del campo que
se observa eliminando o
reduciendo la información
fuera del plano
• Permite recolectar
secciones ópticas seriadas
de especímenes gruesos
31

32. Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía confocal de barrido
por láser (MCBL)
Cultured epithelial cells
triple stained for the
nucleus (blue),
microtubules (green),
and actin (red). Images
were acquired with a
20X objective (left) and
a 100X objective (right).
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33. Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
– Tiene una enorme resolución
– Permite observar incluso átomos
• Microscopio de efecto tunel
(Scanning tunneling microscope, STM)
– Permite ver átomos (sustancias
conductoras) en la superficie de un sólido Los electrones que rodean los átomos de l
– Un punta muy fina (terminada en un solo superficie se proyectan desde el borde de l
átomo) se aproxima a la muestra superficie a una corta distancia
– Una corriente constante (tunneling
current) se aplica entre la sonda y la
muestra
– Para mantener la corriente constante a
medida que se desplaza la sonda, ésta
debe moverse alejándose y acercándose a
la muestra
– Las variaciones de corriente son
detectados y empleadas para crear una
imagen
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34. Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
• Microscopio de fuerza atómica
(Atomic force microscope, AFM)
– Similar a la microscopia de efecto túnel
pero para materiales no conductores ya
que no aplica un voltaje
– Un punta muy fina se mueve sobre la
superficie de la muestra a una distancia
constante
– A medida que la sonda se mueve a lo largo
de la superficie de la muestra los
electrones de la sonda de metal son
repelidos por las nubes electrónicas de los
átomos de la misma. La altura de la sonda
se ajusta de modo automático para
mantener constante la fuerza recibida.
– Los movimientos ascendentes y
descendentes de la sonda son detectados
y empleados para crear una imagen
– Se emplea para muestras poco
conductoras
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35. Nuevas técnicas de microscopía
Microscopía con sonda de Barrido
2 nm
Imagen AFM del virus
del mosaico de nabo
amarillo en el que se
observa la estrutura
Características de la cápsula
superficiales de una
espora de Bacillus
atrophaeus (a) Espora Imagen STM del ADN
hidratada (b), Detalle de
ésta mostrando
estructuras de cilindros
ordenados que se
pliegan tras hidratarse
(c). Imagenes AFM
a–e) Imagenes AFM de la compactación
progresiva del ADN de levadura por el efecto de
35
la proteína AbF2.