Introducción al microscopio para alumnos de Anatomía Patológica y Citodiagnóstico

1. PROCESAMIENTO
CITOLÓGICO Y TISULAR
Introducción al microscopio

2. El microscopio óptico:
fundamentos y tipos
• Del griego mikrós (pequeño) y skopéin (observar).
• Permite ver objetos por debajo del límite de resolución del ojo
humano (alrededor de 100 a 200 μm (0,1 a 0,2 mm).
• En la mayoría de los casos la observación microscópica se realiza
sobre células muertas procesadas para eliminar el agua, preservar
lo mejor posible su estructura, dar contraste a sus distintos
componentes y obtener una sección lo suficientemente delgada
para que la luz o los electrones la atraviesen. En determinadas
circunstancias, sin embargo, también pueden observarse células
vivas.
• Las células eucariotas tienen un tamaño que oscila entre 10 y 30
μm de diámetro, mientras que las procariotas y los componentes
celulares son aún menores.
• Su visualización sólo es posible utilizando diferentes tipos de
microscopios que, por efecto de sus lentes combinadas, poseen
mayor límite de resolución (hasta 0,2 μm en el MO o unos pocos
nm en el caso del MET – microscopio electrónico de transmisión -).

3. Microscopio simple (lupa o
microscopio estereoscópico)
• Consta de una sola lente o sistema de
lentes convergentes biconvenxas (parte
óptica) sostenidas por un soporte con
tornillos de enfoque (parte mecánica).
• La distancia focal varía entre 5 y 10 cm.
• Proporciona una imagen virtual, derecha,
aumentada entre 2 y 20-30 veces.
• Los estereomicroscopios modernos
cuentan con mayor distancia útil de trabajo,
tienen sistemas de iluminación
direccionable, de luz polarizada, de campo
oscuro y es posible adaptar cámara
fotográfica y vídeo.
• Las lupas se utilizan como auxiliares en la
observación o disección de piezas
anatómicas pequeñas.

4. Microscopio óptico compuesto
(convencional)
• También llamado microscopio de campo claro o fotónico, ya que se
utiliza un haz de luz común (luz blanca) que atraviesa la muestra e
ilumina el campo de observación.
• La muestra debe ser lo suficientemente fina como para que la luz
pueda atravesarla.
• Los detalles se visualizan debido a las diferencias de absorción de
la luz en las distintas partes del material biológico.
• Este microscopio se suele utilizar para observar preparaciones
histológicas coloreadas.
• Se obtiene una imagen fina, virtual, invertida y aumentada de los
objetos observados.
• El MO cuenta con tres sistemas de lentes:
– El condensador, que enfoca los rayos de luz sobre la muestra;
– Los objetivos, que magnifican la imagen;
– Y los oculares, que agregan una mayor magnificación y permiten la
visualización directa del preparado.

5. MO. Parte mecánica
• Pie. Debe ser sólido y amplio.
• Columna. Sostiene el tubo y la platina.
• Tubo. Lleva los oculares y objetivos.
Puede ser monocular, binocular o
trinocular. Los objetivos están enroscados
en un sistema de revólver que permite
colocar uno u otro en el eje óptico.
• Platina. Superficie horizontal donde se
coloca el preparado sujeto con pinzas.
Generalmente permite el desplazamiento
del preparado a derecha e izquierda o de
atrás a delante. Un orificio en la parte
central de la platina permite el paso de la
luz que atraviesa la muestra.
• Los tornillos de enfoque. Permiten
regular la distancia entre el preparado y
los objetivos con el fin de obtener una
imagen nítida de la muestra.
Generalmente hay un tornillo
macrométrico y uno micrométrico.
• Debajo de la platina hay soportes para el
condensador, el diafragma y los filtros.

6. MO. Parte óptica
• Objetivos. En el revólver de un MO hay generalmente objetivos de
diferentes aumentos: uno llamado lupa, o de campo (3,5x, 4x ó 5x); otro de
10x y/o de 25x, uno de 40 ó 45x; y, con frecuencia, uno de inmersión de
100x. El objetivo de inmersión se utiliza frecuentemente para exámenes
citológicos.
• Oculares. Son las lentes que recogen la imagen dada por el objetivo.
Tienen grabado el aumento que proporcionan. El aumento final se calcula
multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular.
• Condensador. Concentra los rayos luminosos y los proyecta sobre el
preparado a través del orificio de la platina. Para observaciones con
objetivos de gran aumento se requiere que el condensador esté cerca de la
platina; por el contrario, para trabajar con bajo aumento conviene bajar el
condensador para obtener una iluminación más pareja en todo el campo
observado.
• Diafragma del condensador. Gradúa la cantidad de rayos luminosos que
llegan al objeto. Para preparaciones sin teñir o con poco contraste es
conveniente cerrar el paso de la luz un poco más de lo habitual para
aumentar el contraste.
• Sistema de iluminación. Consta de luz, espejo, filtros y diafragma.
• Filtros. Se colocan en aros portafiltros situados debajo del condensador.

7. Microscopios especiales
• Microscopio de campo oscuro. Generalmente utilizado para observación de células vivas y
móviles, como bacterias y espermatozoides.
• Microscopio de contraste de fases. Permite observar células y tejidos sin colorear y es
especialmente útil para la observación de células vivas.
• Microscopio de interferencia. Es una modificación del anterior y es muy utilizado en
cultivos celulares.
• Microscopio de polarización. Usa luz polarizada (luz que vibra en un solo plano). Permite
estudiar tejidos duros (hueso, diente), estructuras que tengan simetría lineal (tejido
muscular), y la presencia o deposición de colágeno.
• Microscopio invertido. Tiene el revólver portaobjetivos situado debajo de la platina y el
sistema de iluminación por encima de la misma. Esto permite contar con una mayor
distancia de trabajo y poder observar células creciendo en medios de cultivo de varios mm
de espesor.
• Microscopio de fluorescencia. Permite detectar moléculas que fluorescen, que absorben
determinada longitud de onda y reemiten luz de una longitud de onda mayor. Las estructuras
fluorescentes aparecen luminosas y brillantes, resaltando sobre fondo oscuro.
• Microscopio de luz ultravioleta. Usa exclusivamente esta luz para atravesar la muestra. Es
particularmente útil para detectar la presencia de distintos tipos de moléculas (ácidos
nucleicos) en las células. La visualización sólo puede realizarse con fotografías.
• Microscopio láser confocal. Permite obtener imágenes de excelente definición y de una
resolución un 30% superior a la de un MO común. Combina partes de un MO al que se
adapta un equipo fluorescente, con un sistema de barrido en el que se emplea un rayo láser.
Pueden lograrse imágenes de la muestra a diferentes profundidades, como si se observara
capa por capa, pudiendo reconstruir una imagen tridimensional completa de la célula
estudiada.

8. Campo oscuro Contraste de fases
Polarización
Polarización
Láser confocal

9. El microscopio electrónico:
fundamentos y tipos
• Utiliza electrones en lugar de fotones o luz
visible para formar imágenes de objetos
diminutos. Los microscopios electrónicos
permiten alcanzar amplificaciones mayores que
los mejores microscopios ópticos, debido a que
la longitud de onda de los electrones es
bastante menor que la de los fotones "visibles".
• Existen dos tipos principales: el de transmisión o
TEM (Transmission electron microscope),
desarrollado en primer lugar, y el de barrido o
SEM (Scanning electron microscope).

10. TEM
• El microscopio electrónico
de transmisión emite un haz
de electrones dirigido hacia
el objeto cuya imagen se
desea aumentar. Una parte
de los electrones rebotan o
son absorbidos por el objeto
y otros lo atraviesan
formando una imagen
aumentada de la muestra.
Para utilizar un TEM debe
cortarse la muestra en capas
finas, generalmente no
mayores de unos 5000 Å (10
ángstrom= 1nm), o sea, 0,5
μm. Los microscopios
electrónicos de transmisión
pueden aumentar la imagen
de un objeto hasta un millón
de veces.

11. SEM
• En el microscopio electrónico de barrido la
muestra es recubierta con una capa de metal
delgado, generalmente oro depositado
mediante la técnica del sombreado, y es
barrida con electrones enviados desde un
cañón. El haz de electrones no está fijo, sino
que se mueve y rastrea continuamente la
superficie de la muestra. Un detector mide la
cantidad de electrones enviados que arroja la
intensidad de la zona de muestra, siendo
capaz de mostrar figuras en tres dimensiones,
proyectados en una imagen de TV. Su
resolución está entre 3 y 20 nm, dependiendo
del microscopio. Permite obtener imágenes de
gran resolución en materiales pétreos,
metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por
un haz de electrones, las lentes por
electroimanes y las muestras se hacen
conductoras metalizando su superficie.
• Se suele emplear para la observación
tridimensional de estructuras completas,
pequeños organismos o partes de órganos
(cristalino), pequeñas estructuras (esporas,
polen), células completas (eritrocitos), así
como orgánulos en células fraccionadas.

12. Comparación de la formación de la imagen en un microscopio de transmisión
óptica, un microscopio electrónico de transmisión (TEM), un microscopio
electrónico de barrido (SEM) y un tubo de rayos catódicos (CRT) de pantalla de TV