Este documento describe un ensayo in vitro que analiza el efecto del suplemento Alquernat Inmuplus sobre la tasa de traducción ARN-proteína en macrófagos alveolares porcinos. Los resultados muestran que Alquernat Inmuplus aumenta la tasa de traducción cuando se usa una dilución 1:1000, lo que indica que puede inducir la síntesis proteica en estas células.

1. Capacidad de Alquernat Inmuplus para inducir la
traducción ARN-proteína en macrófagos alveolares
Ensayo in vitro, 2015

2. OBJETIVO
Análisis del efecto de Alquernat Inmuplus sobre la tasa de
traducción RNA‐proteína en macrófagos alveolares de origen
porcino.
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3. • La medición‐detección de la tasa de traducción RNA‐
proteína es posible gracias a la puromicina, que sirve
como indicador de la actividad ribosomal.
• Puromicina: antibiótico capaz de bloquear la síntesis
proteica mediante la terminación prematura de las
cadenas polipeptídicas que están siendo sintetizadas.
3
Análisis de la actividad ribosomal
Medición

4. Análisis de la actividad ribosomal
Medición
• La puromicina se incorpora a las cadenas peptídicas
recién formadas: una cantidad superior de este
compuesto indica una mayor actividad ribosomal.
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5. Análisis de la actividad ribosomal
Medición
• La detección se basa en la utilización de un anticuerpo
anti‐puromicina.
• Tras el revelado con un anticuerpo secundario marcado
con peroxidasa, una mayor señal en western blot o ELISA
se correlaciona con una cantidad superior de puromicina
(mayor tasa de traducción ARN‐proteína).
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6. Procedimiento
Células 3D4/2 (ATCC® CRL‐2845TM)
6
• Macrófagos alveolares inmortalizados con el antígeno T
de SV40 transformado en pSV3‐neo.

7. Procedimiento
Medio
7
• Dulbecco’s modified Eagle medium: mezcla de nutrientes
F‐12 (Ham) (1:1) con GlutaMAXTM‐1 (DMEM/f12)
suplementado con 20% de suero fetal bovino.
Atmósfera
• Humidificada, 5% CO2 a 37ºC
Amplificación
• Pases hasta una densidad celular de 2x105 ml con 5 ml de
medio fresco en placas de 25 cm2, cada 4 días.

8. Procedimiento
8
• Los ensayos se realizaron en 12 pocillos.
• Se añadieron 1,2x105 células/ml en un volumen de 2 ml
por pocillo.
• Tres días después, una vez observada la confluencia en
todos los pocillos, se retiró el medio y se sustituyó por 2
ml de DMEM suplementado con los tratamientos
correspondientes.

9. Procedimiento
9
A. Ningún tratamiento (control negativo)
B. Puromicina
C. Alquernat Immuplus (dil.1) + puromicina
D. Alquernat Immuplus (dil.2) + puromicina
E. Cicloheximida + puromicina
Control con cicloheximida: inhibidor de la síntesis proteica en eucariotas que
actúa interfiriendo en la actividad peptidil-transferasa del ribosoma 60S.
A
A
A
B
B
B
C
C
C
D
D
D
E
E
E

10. Procedimiento
10
• Las células de cada pocillo se recogieron, se lisaron y se
cuantificaron las proteínas totales extraídas.
• Las muestras se cargaron en un gel SDS‐poliacrilamida.
• Se realizó el western blot:
• Anti‐puromicina como anticuerpo primario (Kerafast Anti‐
puromycin [3RH11] antibody).
• Rabbit anti‐mouse marcado con peroxidasa como
anticuerpo secundario (Thermo Rabbit Anti‐mouse HRP).

11. Procedimiento
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• Se utilizaron dos diluciones (1:1000 y 1:5000) de
anticuerpo primario distintas con el fin de aumentar la
sensibilidad de la técnica.
• Se utilizaron reactivos ECL (Pierce) y películas reveladas
para la detección de quimioluminiscencia.

12. Resultados
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1. Sin tratamiento
2. Puromicina
3. Compuesto Biovet 1:1000 + puromicina
4. Compuesto Biovet 1:10000 + puromicina
5. Cicloheximida + puromicina

13. Conclusiones
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• ALQUERNAT INMUPLUS aumenta la tasa de traducción
RNA-proteínas en células alveolares de origen porcino.
• El efecto se observa cuando se utiliza una dilución
1:1000 de ALQUERNAT INMUPLUS.