Bioquimica del punto isoelectrico

1. La característica más llamativa de los aminoácidos (AA) es la
existenciaenuna mismamoléculadegruposácidos(capacesde
ceder H+) y gruposbásicos (capaces de captar H+). Por lo tanto, en
medio ácido se comportan como bases, y en medio básico se
comportan como ácidos. Las moléculas que presentan esta
característica se dice que son anfóteros oanfolitos.
Los grupos ácidos y básicos pueden neutralizarse mutuamente,
constituyendo una sal interna formada por un ión híbrido (carga
positiva y carga negativa), que se llama zwitterión.
Si consideramos un AA sencillo, éste puede adoptar tres formas
iónicas diferentes:
Elprimer grupo que se disocia es el carboxilo(pK1 =2,22). Porlaproximidad del grupo NH3+, el COOH
se comporta como un ácido moderadamente fuerte. Si aplicamos la ecuación de Henderson-
Hasselbalch alprimer equilibrio de disociación,resulta que a pH fisiológico(7,4),la concentraciónde
la forma catiónica es prácticamente despreciable (una de cada 151.000 moléculas en la forma
zwitterión). El segundo grupo en disociarse es el NH3+. Como el pK2 es 9,86, la concentración de la
forma aniónica es muy pequeña en comparación con la forma zwitterión (1 molécula en forma
aniónica por cada 300 en forma zwitteriónica). El AA se comporta a pH fisiológico como un ácido
débil que está disociado al 0,35%.
Existe un pH para el cual la carga eléctrica media de las moléculas es cero. Este pH se llama punto
isoeléctrico (pI).ElpI es el pH en el que la molécula se disocia por igual en ambos sentidos, y como
equidista de los dos valores de pK, puede obtenerse por su semisuma:
Así, para la glicina (pK1=2,22 y pK2=9,86, el pI vale 6,04. Así, a pH=6,04 la immensa mayoría de las
moléculas de glicina estarían en forma de iones híbridos (zwitterión) y no se desplazarían hacia

2. ningún poloal aplicarles un campoeléctrico(Pinchaenel botón"Actualizar"del navegador y observa
la figura inferior).
Cuando el AA contiene otros grupos ácidos o básicos, el poder amortiguador gana posibilidades. Así,
elácido glutámico tiene tres grupos disociables, cuyos pK son: pK1=2,1; pK2=3,9 y pK3=9,8:
La forma I (totalmente protonada) tiene una carga neta positiva. La forma II tiene carga neutra (una
positiva y una negativa), la formaIIItiene una carga negativa y la forma IVtiene dos cargas negativas.
El punto isoeléctrico del ácido glutámico será aproximadamente 3,0 (la semisuma de pK1 y pK2,
los pK que flanquean a la forma zwitterión). La proporción de moléculas en la forma IV (2 cargas
negativas) es tan pequeña que puede considerarse como despreciable a la hora de calcular el pI.
En el caso del AA arginina existen dos grupos básicos y uno ácido. La disociación de la arginina se
esquematiza del siguiente modo, donde pK1=2,2; pK2=9,2 y pK3=12,5:

3. La forma I (totalmente protonada) tiene dos cargas positivas. La forma II tiene una carga neta
positiva, la forma III es neutra (una positiva y una negativa) y la forma IV tiene una carga negativa.
El punto isoeléctrico de la arginina será aproximadamente 10,85 (la semisuma de pK2 y pK3, los
pK que flanquean ala formazwitterión).Laproporciónde moléculasen la formaI(2cargas positivas)
es tan pequeña que puede considerarse como despreciable a la hora de calcular el pI.
Las proteínas están formadas por la unión de AA mediante
un enlace peptídico. Este enlace se produce entre el grupo
COOH de un AA y el grupo NH2 de otro, de forma que
desaparecen sus propiedades amortiguadoras. Sin
embargo, siempre existirá al menos un grupo amino y un
grupo carboxilo terminal, que puedan actuar como
amortiguadores. Además hay algunos AA que aportan
grupos ionizables en sus cadenas laterales: ácido
aspártico y glutámico, arginina, lisina, histidina, etc. En la
tabla de la derecha se recogen los valores de pK de estos
grupos.
Los pK para la disociaciónde los grupos ácidos o básicos de
estas cadenas laterales pueden verse alterados por la
influencia de otros grupos ionizables próximos. La
posibilidad de formar un puente de hidrógeno entre un
residuo de tirosina y uno de ácido aspártico puede alterar
el pK de la disociación del grupo carboxilo.Asímismo, el pK
de la disociación del grupo carboxilo de una cadena lateral
de ácido glutámico puede verse afectado por las interacciones electrostáticas que se pueden
establecer con un residuo de lisina cercano. Un caso particularmente importante es el de
la histidina próxima al grupo hemo de la hemoglobina, ya que su pK adopta valores muy distintos
en función de que esté unida al oxígeno o no (figura derecha de la tabla inferior).
ácido aspártico ácido glutámico Histidina

4. Determinar el PIde una proteína observando la solubilidad mínima a un PH de la solución en
la que se produce, con el fin de contribuir y establecer la importancia de conocer las
propiedades de las proteínas.
MATERIALES PROVISTOS POR EL LABORATORIO:
3 Pipetas de 5 ml
1 pipeta de 10 ml
1 vaso de precipitación de 250 ml
6 tubos de ensayo 16 x 150
2 pipetas Pasteur o goteros
Gradilla
EQUIPOS:
Potenciómetro.
REACTIVOS:
Buffer Acetato PH:2.0
Buffer Acetato PH: 4.8
Buffer Acetato PH: 10.0
Fenolftaleína
NaOH al 10%
MATERIALES PROVISTOS POR EL ALUMNO:
150 ml de leche
Alcohol 96°
BUFFER ACETATO
PH: 2.0
BUFFER ACETATO
PH: 4.8
BUFFER ACETATO
PH: 10.0

5. Calentar en baño maría a 40°C, la muestra y las soluciones Buffer correspondientes, y luego
implementar el siguiente sistema:
REACTIVOS TUBOS
I II III
LECHE 5.0 ML 5.0 ML 5.0 ML
BUFFER ACETATO PH: 2.0 5.0 ML - -
BUFFER ACETATO PH: 4.8 - 5.0 ML -
BUFFER ACETATO PH: 9.0 - - 5.0 ML
PIPETAS DE 5 Y 10 MLTUBOS DE ENSAYO
PIPETAS PASTEUR
NaOH AL 10% FENOLFTALEÍNA
GRADILLA
VASO DE PRECIPITACIÓN DE
250ML LECHE 150 ML
POTENCIÓMETRO

6. Mezclar y observar el grado de precipitación en cada tubo y anotar usando cruces (+) de
acuerdo a la intensidad.
Se valora el PH de cada uno de los tubos utilizando un potenciómetro; para lo cual se deberá
trasvasarse el contenido de los respectivos tubos a vasos de precipitación de 50 ml, luego
proceder a medir el PH correspondiente a cada tubo.
Agregar 4 gotas de fenolftaleína a cada uno de los tres tubos del sistema anterior y agregar
solución NaOH al 10% hasta la aparición ligera del color grosella. Observar el aspecto de
solubilidad en cada tubo y anotar.
Hacer la discusión de los resultados de cada uno de los tubos, indicando los parámetros de
referencia utilizados para determinar el punto Isoeléctrico (PI) de la proteína de la leche
(caseína).
Establecer el tubo experimental que contiene el PI de la caseína e inferir las propiedades
diferenciales que presenta en ese PH.
Explicar para qué se agregó el NaOH al 10% en cada tubo y que propiedades presenta en ese
estado la solución de proteína.
Explicar cómofue la evoluciónde la polaridad de la caseína durante el proceso experimental
total.
Hubo precipitación de proteínas obteniendo una consistencia grumosa, quiere decir
que existen micelas (++)/Combinación de LechePH:6.6+ BufferPH:2.0. Obteniendo como resultado
final después de haber pasado por el Potenciómetro un PH de 4.8, además de este resultado se
agregó fenolftaleínaperoéstacambiasu colorcuandotieneun PHde 8.2y esta tiene de 4.8, entonces
NO CAMBIÓ, al ver que no hubo reacción se vierte la solución de NaOH al 10% obteniendo como
resultado un color Grosella habiendo tan solo gastando 15 gotas de esta solución.
No hubo precipitación (-) / Combinación de Leche PH: 6.6 + Buffer PH: 4.8. Donde se
obtuvo como resultado final después de pasar por el potenciómetro un PH de 5.5, a este resultado
se le agregó fenolftaleína, pero como ésta cambia su color cuando tiene un PH de 8.2, entonces al
tener el tubo2, PH: 5.5 NO CAMBIÓ,al ver que no hubo reacciónse vierte la soluciónNaOHal 10%
obteniendo como resultado un color Grosella habiendo tan solo utilizado 9 gotas de la solución.
No hubo precipitación (-) / Combinación de Leche PH: 6.6 + Buffer PH: 9. Aquí se
obtuvocomoresultado finaldespués de haber pasado por el potenciómetrounPH de 7.5o 8,a pesar
de este resultado se le agregó fenolftaleína,peroalsaber que ésta solo cambia de colorcuando tiene
un PH de 8.2, y sabiendo que mi tubo 3 solo tiene PH de 7.5 o 8 NO CAMBIÓ, al ver que no hubo
reacciónse viertela soluciónNaOHal 10% obteniendocomoresultado un colorgrosellahabiendo
tan solo utilizado 6 gotas.

7. ¿Qué tipo de proteínas es la caseína, estructural y funcionalmente?
La caseínaes una fosfoproteína(un tipo de heteroproteína) presente en la leche y en algunos de sus
derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la fase
soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado caseinógeno.
Las moléculas individuales de caseína se caracterizanen general portener untamaño mediano (unos
200 aminoácidos, siendo algo menor la caseína κ) contarconpocostramos conestructura secundaria
organizada, debido a la presencia de abundantes restos de prolina, y tener unidos covalentemente
grupos fosfatoa algunos de los restos de serina, y muy ocasionalmente a restos de treonina. La falta
de organización de las moléculas de caseína ha hecho que hasta el momento ninguna haya podido
cristalizarse para llevar a cabo estudios detallados de su estructura secundaria y terciaria.
Una propiedad clásica, que ha servido durante un siglo para su definición operacional, es que las
caseínas precipitan a pH 4,6, que es su punto isoeléctrico (a temperatura ambiente).
Desde el punto de vista de la estructura, en la leche bovina (y en la mayoría de las leches de otras
especies) existen cuatro caseínas, conocidas comoαs1, αs2, (las del subfijo indica que son “sensibles”
al calcio, es decir, que pueden precipitar al asociarse con él) β y κ. Las llamadas “caseínas γ” son
simplemente fragmentos de la caseína β producidos por proteólisis por la plasmina. Todas las
caseínas tienen variantes genéticas, producidas por sustitución de aminoácidos y en algunos casos
por delección. Existen diferencias en la proporción que representa cada tipo en el total de las
caseínas. De entre las especies más comunes, las mayores diferencias se encuentran en el contenido
de caseína κque representa el 3% de las caseínas de leche de búfala, el 13% de las de la leche de vaca
y el 26% de las de la leche humana.
¿Qué métodos se conocen para aislar y purificar proteínas?
AISLAMIENTO DEPROTEÍNAS:
Aislamiento de las proteínas es un método de segregación de un únicotipo de proteína a partir de un
grupo de proteínas que se encuentran en una mezcla. Este proceso es importante en el estudio de la
función de la proteína, así como su estructura individual y cómo interactúa con otros nutrientes en
el cuerpo. Existen diferentes técnicas de aislamiento de proteínas utilizadas en este proceso y, a
través de ellos, las propiedades de la proteína tales como tamaño, físico-química y la afinidad de
unión se puede determinar.
EXTRACCIÓN:
La extracción es una técnica de aislamiento de proteína en la que el tejido se divide en una solución
para obtener la proteína a estudiar. El tejido se somete a procedimientos tales como ciclos de
congelación, sonicación, homogeneización, filtración o permeabilización utilizando disolventes
orgánicos. Después de que las proteínas solubles han sido separadas de las no solubles, la proteína
de interés puede separarse de las membranas celulares y finalmente se extrae el ADN.
PRECIPITACIÓNYSOLUBILIZACIÓNDIFERENCIAL:
La precipitación y solubilización diferenciales una manera rentable de aislar proteínas a granel. Este
método utiliza la precipitación con sulfato de amonio, durante el cual se añade al tejido este
compuesto de manera creciente con el fin de recoger las diferentes fracciones de la proteína
precipitada.
ULTRACENTRIFUGACIÓN:

8. Otra técnica de aislamiento de proteína es la ultracentrifugación, que utiliza la fuerza centrífuga por
medio de undispositivo de ultracentrífugapara separar partículas de diferentes masas deuna mezcla
dada. Las partículas presentes en la mezcla se mueven hacia afuera de acuerdo con su masa, con las
proteínas menos densas girando más lentamente que las más densas. Cuando se centrifuga el tiempo
suficiente, las proteínas se segregan en funciónde su densidad, yaque permanecen en suspensión en
los lugares en los cuales su densidad de flotaciónse equilibra con la fuerza centrífuga aplicada. Hay
dos tipos de técnicas de ultracentrifugación: centrifugación y centrifugación en gradiente de
sacarosa.
CROMATOGRAFÍA:
También se pueden aislar proteínas por medio de un procedimiento de cromatografía. Una mezcla
de proteínas se vierte en una columna rellena de diferentes materiales con los cuales pueden
interactuar las proteínas presentes. Las proteínas se detectan de acuerdo al material con el que
interactúan así como por su nivel de absorbencia. Existen muchos procedimientos de cromatografía,
como exclusión de tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, de afinidad, de
inmunoafinidad, de unión a metal y cromatografía líquida de alto rendimiento.
CONCENTRACIÓN:
Una vez terminado el proceso de aislamiento, la proteína separada se somete a un proceso de
concentración como liofilización, en el que la proteína se seca y se separa de todas las demás
partículas solubles mediante ultrafiltración, donde la solución de proteína se pasa a través de
membranas permeables por medio de bombas o centrifugación. Una vezconcentrada, la solución de
proteína se puede utilizar para el estudio.
PRIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:
Una purificación de proteínas es una serie de procesos que permiten aislar un sólo tipo
de proteína de una mezcla compleja. La purificación de proteínas es vital para la caracterización de
la función,estructura en interacciones de la proteína de interés, por ejemplo una enzima un receptor
celular o un anticuerpo. El material inicial es generalmente un tejido biológico o un cultivo
microbiano. Hay varios pasos en el proceso de purificación; puede liberar a la proteína de la matriz
que lo confina,separar las partes proteica y no proteicade la mezcla,y finalmente separar laproteína
deseada de todas las demás. Este último paso puede ser el aspecto más laborioso de la purificación
de proteínas.
TÉCNICAS EMPLEADAS:
 Homogeneización
 Fraccionamiento celular
 Desnaturalización reversible con sulfato de amonio
 Cromatografía
 Electroforesis
 Diálisis
 Espectroscopia ultravioleta-visible
 Ensayo enzimático
¿Qué es el punto isoeléctrico de una proteína?
El punto isoeléctrico (pI) es el pH en el que el aminoácido se encuentra en la forma neutra o de
zwitterión, ya que como presentan grupos ácido y básico en la misma molécula podrán encontrarse
3 estructuras posibles según el pH del medio:
A B
COOH COO-
I+ I+
H-C-NH3 <---->H-C-NH3

9. I I
R R
B C
COO- COO-
I + I
H-C-NH3 <---->H-C-NH2
I I
R R
la forma catiónica o A es la que predomina a pH ácido, la forma neutra o zwitterión es la B y
predomina al pH isoeléctrico; y la forma aniónica o C predomina a pH alcalinos, el punto
isoeléctrico es importante cuando se hace electroforesis, de modo que a ese pH como la partícula es
neutra su movilidad electroforética es nula. Se lo calcula como el promedio de los pKa de los grupos
predominantes.
¿Por qué las proteínas precipitan con altas concentraciones de sales?
Las proteínas precipitan porque se desnaturalizan, es decir pierden su estructura terciaria
exponiendo al medio los residuos hidrofóbicos de la misma, que en condiciones normales estarían
en el centro de la proteína (y los residuos hidrofílicos en el exterior o superficie de la proteína). Al
exponer estos residuos a la solución acuosa la proteína deja de ser soluble porque sus residuos
hidrofóbicos entran a jugar un papel fundamental en la insolubilidad de la misma, ya que estos
residuos al no poder interactuar con el agua porque son apolares, interactúan con los residuos
hidrofóbicos de otras moléculas de proteína, se van uniendo unos moléculas con otras hasta formar
un aglutinamiento de moléculas que termina precipitando.
 Bioquímica Ilustrada Harper, PUNTO ISOELÉCTRICO 29 edición, Robert K. MURRAY, David A.
BENDER, Kathleen M. BOTHAM, Peter J. KENNELLY, Victor W. RODWELL, P. Anthony WEIL.
 Aminoácidos,Péptidosyproteínas, Punto Isoeléctrico (Pag 12-25), M. EN C. ISRAEL VELÁZQUEZ
MARTÍNEZ
https://tuylaquimica.files.wordpress.com/2011/03/aminoacidos-peptidos-y-proteinas-
espectacular.pdf
 Química biológica, PUNTO ISOELÉCTRICO, Antonio Blanco, 8va edición Actualizada.
 Bioquímica de los Alimentos, CASEÍNA, Miguel Calvo.

10. http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/proteins/caseina.html