Este documento resume los métodos innovadores para reemplazar la experimentación animal en la evaluación de la sensibilización dérmica, incluyendo métodos in vitro basados en la iniciación molecular, la respuesta de queratinocitos y células dendríticas, y la activación y proliferación de linfocitos T. Se discuten los desafíos de integrar los datos de múltiples métodos para predecir el potencial alergénico y el riesgo, así como las nuevas técnicas como la impresión 3D y los "chips de piel" que podrían

1. Reptes per a una ciència més ètica: mètodes innovadors per reemplaçar l'experimentació animal
30 setembre – 1 d’octubre 2019
Alternatives a estudis de
sensibilització dèrmica
Dra. Montse Mitjans Arnal
Professora Agregada, Dt. Bioquímica i Fisiologia, Facultat de
Farmàcia i Ciències de l’Alimentació, UB

2. • Dermatitis de contacto alérgica i identificación de alérgenos
• Mecanismo fisiológico de la DCA
• Estudios preclínicos tradicionales
• Alternativas in vitro: presente y futuro.
Temas que se trataran
Murphy et al., Allergy and Hypersensitivity, 2008

3. Dermatitis y salud: impacto sobre población
22%
Estética
17%
Hostelería
A partir de Subiabre-Ferrer et al., Med Segur Trab
(Internet) , 62 (245), 2016
Peiser et al., Cell Mol Life Sci, 69:763–781, 2012
• Dermatitis de contacto alérgica: problema de Salud Pública
• Prevalencia 20% Europa, aumentando en todo el mundo
• Consumidores, trabajadores (Salud laboral)

4. Los alérgenos de contacto son cotidianos
• Fragancias: ~ 3.000, productos químicos y extractes naturales.
30% DCA cosméticos
• Metales: Cr, Ni
• Conservantes: isotiazolinas, formaldehído
• Tintes. DCA severas
• Otros ingredientes:
• Filtros solares (foto alergia)
• Resinas epoxi
• Gomas
• Acrilatos
Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS)
https://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety_en
ρ-Phenylenediamine
(Hydroxyethyl)methacrylate
Cananga Odorata
(Ylang-ylang oil)
Cinnamal
Maio et al., Dermatology Online
Journal 18 (2): 13, 2012

5. Garantizar la seguridad: identificar alérgenos
Identificar
Ensayo(s) positivo(s)
Caracterizar
Potencia
Gestionar
Etiquetaje
Valorar
Patrones
Límites de exposición

6. Sensibilización dérmica
Saito et al., Int J Mol Sci , 17, 202, 2016
• Hipersensibilidad retardada o tipo IV

7. Sensibilización: ID + tópica con/o sin adjuvante (5-8)
Tópica parche oclusivo (0, 6, 8)
Criterio de clasificación: > 30% o 15%
Provocación: Aplicación tópica (20-22 o 27-28)
Valoración: Observación 21h a 72
h, según método
Maximización - Buehler;
OECD 406, 1992
Evaluación tradicional: in vivo
Local Lymph Node Assay;
OECD 429, 2010
Nombre animales10 x 2 grupos 4 x 5 grupos
0, 1, 2d
3H-timidina
Día 5
5 h
Proliferación celular
Índice de estimulación: SI
Concentración EC3
Nódulos
linfáticos
24-30 días
Subjetiva
5-6 días
Objetiva
Tiempo de ensayo
Valoración resultado
Daicel-ATP (OECD 442A, 2010)
BrdU-ELISA/FCM (OECD 442B, 2018)

8. Estrategias in vitro: Adverse Outcome Pathway
LLNA y modificaciones (OECD 429)
Ezendam et al., Arch Toxicol 90:2861–2883, 2016
Maximización y
Buehler (OECD 406)
PC.1 PC.2 PC.3 PC.4 AO

9. Estructura y propiedades del alérgeno
• Biodisponibilidad dérmica (hapteno, prohapteno, prehapteno
• Absorción cutánea
• Metabolismo
• Propiedades reactivas: QSAR (OECD QSAR Toolbox, VEGA, TOPKAT, …).
Modelos in silico
Necesario pero no determinante
https://www.lhasalimited.org/products/Derek-Nexus-for-skin-
sensitisation.htm
https://www.123rf.com/photo_17432855_epidermis
-of-the-skin.html

10. MIE: reacción molecular inicial
https://www.creative-diagnostics.com/blog/index.php/immunogen-antigen-hapten-epitope-and-adjuvant/
prohapteno prehapteno
Oxidación
UV
Hapteno
Interacción nucleófila - electrófila
Proteína Ag completo

11. Métodos basados en la iniciación molecular
DPRA, OECD 442C, 2015 Unión covalente de electrófilos a proteínas cutáneas
Cor1C420
Natsch et al. 2015
ADRA-DM
Yamamoto et al. 2015
PPRA
Peroxidasa, prohaptenos LC-MS, adductes ↓ AA
otros

12. Respuesta inflamatoria de los queratinocitos
Keap1
ROS
Nrf2
p38MAPK NF-ҡB
IL-1β
IL-18
TLR
Caspasa-1
My088
Haptè
HMOX1
NQO1
Altres gens
Citocinas proinflamatorias
SENS-IS
EpisensA
Keratinosens™, OECD 442D
LuSENS
KC cell lines
RhE IL-18 potency assaymRNA
Membrana celular
ARE

13. Activación de las células dendríticas
• Expresión de moléculas de superficie: h-CLAT y U-SENS™ OECD TG 442E,
mMUSST
• Secreción de IL: IL-8 Luc, OECD TG 442E
• Activación (huella) genética: GARD
Ryan et al., Toxicol Appl Pharmacol 221 (3): 384-394, 2007 Forreryd et al., Toxicol in Vitro 37: 178–188, 2016

14. • Loose-fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA): cocultivo
• Migración de DC
Wong et al., Frontiers in Pharmacology, 6: 94, 2015 Adaptado de S. Gibbs et al., Toxicol in Vitro 27: 1170–1179, 2013
alérgeno irritante
IL-1-α
TNF-α
↑CXCR4
mLC
↑CXCL12 ↑CCL2
↑CCL5
iLC
Activación de células dendríticas

15. Activación y proliferación de linfocitos T
Martin et al., Cell Mol Life Sci 67:4171–4184, 2010
Moser et al., J Immunol methods. (2010) 353: 8–194
• Elevada variabilidad: donantes linfocitos T
• Presencia de Treg
• Propiedades del alérgeno: reactividad
• Formación de complejo hapteno-proteína
• Protocolos a perfeccionar

16. Martin et al., Contact Derm , 72, 2-10, 2014
Activació i proliferació de limfòcits T

17. hCLAT
U-Sens/MUSST
IL-8 Luc Assay
SENS-IS
Ezendam et al., Arch Toxicol 90:2861–2883, 2016
Keratinosens/Lusens
SENS-IS
PC.1 PC.2 PC.3 PC.4 AO
Resumen: disponibilidad actual
DPRA/PPRA

18. Integración de los datos: el reto
Identificación y potencia del alérgeno
(NESIL) para evaluación del riesgo
Integración de datos
Linfocitos T:
Activación
Reguladores
NK
Metabolismo
SAR
Linfocitos B ?
Mastocitos?
Integrada
ITS
Secuencial
STS
Iterativa
IATA
(WoE)
Estrategias
modelos de predicción

19. Noves técnicas y métodos: Impresión 3D?
• Combinación de diferentes células y materiales
• Fabricación automatizada
• Validación para ensayo toxicológico?
• Elevada relación coste/rendimento
• Células del sistema inmune
Wei Long Ng et al, Biofabrication 10 025005, 2018

20. Noves técnicas y métodos: skin-on-chip?
Ramadan Q Ting Lab on a Chip, 16: 1899–1908, 2016
• Cultivo celular basado en la tecnología de los microfluidos
• Interacciones intercelulares y matriz extracelular
• Cocultivo queratinocitos – células inmunitarias
• Tiempos más largos

21. Reptes per a una ciència més ètica: mètodes innovadors per reemplaçar l'experimentació animal
30 setembre – 1 d’octubre 2019
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