ELISA

1. ELISA
Enzyme-Liked
Immunosorbent Assay
Realizado por: Johnny Aguilar Montalván
Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas

2.  ANTÍGENO (Ag):
Molécula exógena, que se encuentra
en la superficie de un agente patógeno,
y que al entrar en contacto con el
organismo, induce la producción de una
respuesta del Sistema Inmune específica
(formación de Acs)
 ANTICUERPO (Ac):
Proteína producida como respuesta a una sustancia “extraña” (Ag)
y que tiene la capacidad de combinarse con él (complejo Ag-Ac).
Antes de nada
quería recordarles
que…

3. ¿Qué es un INMUNOENSAYO?
 Es una prueba que usan complejos antígeno:anticuerpo
(también denominados inmunocomplejos) para medir la
presencia de un analito¹ específico en una muestra.
“Inmuno” se refiere a una respuesta inmunológica que hace
que el cuerpo genere anticuerpos, y “ensayo” se refiere a una
prueba. Entonces, un inmunoensayo es una prueba que utiliza
inmunocomplejos cuando hay una unión Ag-Ac.
 Los Inmunoensayos se diferencian de otros tipos de pruebas
de laboratorio (como las pruebas colorimétricas) ya que usan
complejos Ac-Ag para generar una señal que pueda medirse.
 Los Acs son la base de los inmunoensayos, ya que poseen
una alta especificada y afinidad para un Ag específico. Es
esta unión lo que permite la detección de analitos por medio
de una variedad de técnicas de inmunoensayo.
¹Analito es todo
lo que se mide
en una prueba
de laboratorio.
En el
inmunoensayo,
el analito puede
ser tanto un Ac
como un Ag.

4.  El nombre enzyme-liked immunosorbent assay,
luego abreviado como ELISA, fue acuñado por
los investigadores suecos Eva Engvall y Peter
Perimann, los cuales describieron el
procedimiento, publicado en 1971.

5. INTRODUCCIÓN:
 El método ELISA, se basa en el uso de Ags o Acs
marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática.
 Al estar uno de los componentes (Ag o Ac) marcado
con una enzima e insolubilizado sobre un soporte o
pocillo (inmunoadsorbente) la reacción Ag-Ac quedará
inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico que al
actuar, la enzima producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.

6.  FASE SÓLIDA
 Antígeno o Anticuerpo
 Conjugado: ENZIMA
 SUBSTRATO

7. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE
SUSTANCIAS
 Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas
electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno,
nylon y silicona.
 Las que permiten la fijación covalente de esos
reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato
 Los mejores resultados se obtienen con el
peliestireno y el polvinilo, por su rigidez,
transparencia y propiedades adsortivas.

8. La enzima escogida como marcador debe:
 Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
 Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
 Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y
de fácil preparación.
Las enzimas más utilizadas
son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rábano y ß-
galactosidas

10. La elección del substrato es de gran importancia
para la estandarización del método ELISA y hay
que tener varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura,
así como estabilidad después de la
reacción.
Requerimientos del sustrato
• Solubles en agua
• Fácil de manipular
• No tóxicos, no mutagénicos
• Bajo costo

11. Materiales Orgánicos
 Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre,
etc.)
 Antígenos
 Anticuerpos
 Enzimas
Materiales No Orgánicos
 Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de
pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de
100µ.
 Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores
ELISA).

12. TIPOS:
 ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que está en la
fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo Ag-Ac,
y al agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato
desarrollando color.
 Directo: Detectan Ag
 Indirecto: Detectan Ac
 ELISA Sandwich
 Doble (DAS)
 Heterólogo (HADAS)
 ELISA competitivo:
El Ac de la muestra va a competir con el conjugado por un
número limitado de sitios de unión del Ag. Habrá ausencia de color en
una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la

13. Pasos generales…
1. Tapizado del pocillo con el Ag o
Ac.
2. Adición de la muestra problema
con la mezcla de Ags o Acs.
3. Unión del Ag o Ac específico al Ag
o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
5. Adición del Ac secundario
marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o
Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10. Coloración.
El primero es el
ELISA directo,
seguido del indirecto

14. ELISA directo
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Acs específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Acs fijados deficientemente o no fijados.
3. Adición de la muestra problema conteniendo Ags que permitirá la
unión al Ac tapizado en el pocillo.
4. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Acs reaccionan con los Ags, el complejo quedará solubilizado.

15. ELISA directo
5. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
6. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Los lectores
ELISA se
llaman
espectrofómet
ros!!

16. ELISA indirecto
Consta de las siguientes etapas:
1. Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de Ags específicos.
2. Lavado con solución salina Tween 20 como agente tensioactivo
(ph-7,2) para eliminar los Ags fijados deficientemente o no fijados.
3. Adición de la muestra problema conteniendo Acs que permitirá la
unión al Ags tapizado en el pocillo.

17. ELISA indirecto
4. Adición de Acs marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
Antianticuerpos reaccionan con los Acs, el complejo quedará
solubilizado.
5. Lavado para eliminar los Acs marcados que no hayan
reaccionado.
6. Adición de un substrato sobre el que sea capaz
de actuar la enzima marcadora.
7. Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

18. ELISA indirecto
Por si no les ha
quedado claro…

19. Ag o Ac
fijado a
una fase
Sólida
Ag o Ac
en la
Muestra
Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA SUSTRATO
CAMBIO
DE
COLOR

21. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
 Una de las grandes ventajas de la técnica
ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de
lectura automática de microplacas.
 Los resultados finales de la lectura
colorimétrica se reflejan numéricamente
mediante valores de absorbancia o
densidad óptica que se obtendrán a la
longitud de onda más adecuada para la
coloración final alcanzada.

22. APLICACIONES CLÍNICAS:
 Enfermedades producidas por parásitos
 Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas…
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos,
Salmonelas…
 Enfermedades producidas por virus
 Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis
vírica, Leucemia felina…
 Otras aplicaciones
 Hormonas (GCH, Progesterona, Testosterona..)
 Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
 Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide,
Inmunocomplejos circulantes)

23.  En estudios serológicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, en los
transplantes, la medicina forense y la
antropología.
 Con propósitos médicos se han aplicado en
la determinación de hormonas y proteínas
plasmáticas, antígenos tumorales, drogas,
Ag y Ac de microorganismos (parásitos,
hongos, bacterias, virus)
 Los resultados aportan elementos
diagnósticos, información de una
enfermedad y coadyudan en la planificación
del tratamiento