prueba de elisa

1. ELISA
Reyes Ruelas Sandy Rossmery
Prueba Inmunoadsorbente Ligado a Enzimas

2.  Prueba de interacción primaria
 Análisis inmunoenzimático heterogéneo
 Detección de sustancias de elevado peso molecular
 Sensibilidad: nanogramos
 Técnicas competitivas y no competitivas
 Vida media larga de los reactivos
 Técnica libre de contaminación radioactiva
 Automatización
CARACTERISTICAS

3. ETAPAS BASICAS
1. Unión del inmunoreactivo al soporte.
2. Reacción del inmunoreactivo en la fase solida
con el inmunoreactivo en la solución.
3. Reacción del conjugado enzimático con el
inmunoreactivo de la fase solida(ELIZA
COMPETITIVO DIRECTO) o con el
inmunocomplejo de la fase solida ( ELIZA
COMPETITIVO).
4. Determinación de la actividad enzimática en la
fase solida y tratamiento de datos

4.  Fase solida
• Las que favorecen la adsorción física (por
fuerzas electroestáticas) de las moléculas de
Ags o Acs:
• poliestireno
• cloruro de polivinilo
• Polipropileno
• nylon
• silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos
reactivos:
○ Acrilamida
○ celulosa
○ isoticianato
ELEMENTOS DEL ELISA

5.  Antigeno anticuerpo
 Conjugado –enzima
Anticuerpos y antígenos pueden ser
fácilmente unidos a enzimas mediante
acoplado covalente
Conjugación ideal: proporción 1:1
Ac:Enzima
Sustrato
○Estable
○Sensible
○Seguro
○Fácil de preparar
○Producto soluble (no precipitable)

7. TIPOS:
 ELISA no competitivo:
Consiste en enfrentar la muestra con el Ag o Ac que
está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se
formará el complejoAg-
Ac, y al agregar el conjugado reaccionará con el
respectivo sustrato desarrollando color.
Directo: Detectan Ag
Indirecto:Detectan Ac
ELISA Sandwich
 Doble (DAS)

8. Pasos generales…
1. Tapizado del pocillo con el Ag o
Ac.
2. Adición de la muestra problema
con la mezcla de Ags oAcs.
3. Unión del Ag o Ac específico alAg
o Ac tapizado en el pocillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de Ag o Ac no unido.
Tween 20 pH:7.2
5. Adición del Ac secundario
marcado con la enzima.
6. Unión del Ac secundario al Ag o
Ac.
7. Lavado del pocillo para eliminar el
exceso de enzima no unida.
8. Adición del sustrato.
9. Unión del sustrato a la enzima.
10. Coloración.

9. ELISAdirecto

10. ELISA indirecto
.
•Detecta: Ac
•La intensidad de color
será directamente
proporcional a la cantidad
de Ac especificos presente
en la muestra.

11. ELISA sandwich directo
•Detecta: Ag
•La concentración del producto será directamente
proporcional a la concentración del Ag presente en
la muestra.

12. ELISA de captura IgM
•Fase aguda de la
enfermedad
•Diagnostico de
enfermedades
congénitas
(infección en recién
nacido)

13. •ELISA competitivo
El Ac de la muestra va a competir con el
conjugado por un número limitado de sitios de
unión del Ag. Habrá ausencia de color en una
muestra positiva debido a que el sustrato no
encontrará a la enzima porque el conjugado ha
sido desplazado por el Ac presente en la muestra

14. LECTURA E INTERPRETACIÓN
DE RESULTADOS:
 Una de las grandes ventajas de la técnica
ELISA es la posible automatización de la
lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha
automatización se puede conseguir con un
simple colorímetro o espectrofotómetro de
cubeta o con sofisticados equipos de
lectura automática de microplacas.

15. APLICACIONES CLÍNICAS:
 Enfermedades producidas por parásitos
 Toxoplasmosis, Triquinosis, Tripanosomas…
 Enfermedades producidas por Micoplasmas
 Enfermedades producidas por bacterias
 Mycobacterium tuberculosis, brucelas, Estreptococos, Salmonelas…
 Enfermedades producidas por virus
 Enfermedad de Newcastle, Peste porcina, Rotavirus, artritis vírica, Leucemia
felina…
 Otras aplicaciones
 Hormonas (GCH, Progesterona,Testosterona..)
 Cuantificación de inmunoglobulinas (IgG, IgE, IgA)
 Inmunopatología (Ac anti-DNA, Factor reumatoide, Inmunocomplejos
circulantes)