ELISA

2. • El nombre enzyme-liked immunosorbent assay,
luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los
investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann,
los cuales describieron el procedimiento, publicado
en 1971.
• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el
campo de la microbiología y parasitología.

3. Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.
• Se considera ligado a enzima porque una enzima
se une químicamente a un anticuerpo en las dos
versiones de la prueba (indirecta y directa)
• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que
los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un
plástico.
ELISA puede investigar la presencia de un antígeno
o de un anticuerpo.

4. DEFINICIÓN
• El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos
marcados con una enzima, de forma que los conjugados
resultantes tengan actividad tanto inmunológica como
enzimática.
• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo)
marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo
quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada
mediante la adición de un substrato especifico
• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a
simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotómetro o un colorímetro.

5. • Los antígenos son, por definición, generadores de
anticuerpos.
• Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas
pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.
• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen
como <no propias> o extrañas, para el organismo.
• Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de
identificación

6. • Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente
infeccioso.
• Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los
plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos
correspondientes.
• Anticuerpos se caracterizan por:
– Ser Defensa natural
– Tener Utilidad terapéutica
– Tener Utilidad Diagnóstica
Marcador de Infección o exposición.
Detección de antígenos
• Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen
monoclonal o policlonal.

7. • Anticuerpos Policlonales
Heterogéneos
Reconocen epítopes diferentes del Ag
Producidos por numerosos clones de
Linfocitos B
• Anticuerpos Monoclonales
Homogéneos
Especificidad única
Producidos por un único clon de
Linfocitos B

8. Se utilizan para asegurar que la prueba
esta funcionando correctamente
• Control POSITIVO
Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando
así, un patrón sobre el cual basar los
resultados.
• Control NEGATIVO
Incluyen sustancias que no deben
reaccionar .

9. Ag o Ac
fijado a
una fase
Sólida
Ag o Ac
en la
Muestra
Conjugado:
Ac unido a
ENZIMA
SUSTRATO
CAMBIO
DE
COLOR

10. • FASE SÓLIDA
• Antígeno o Anticuerpo
• Conjugado: ENZIMA
• SUBSTRATO

11. SE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas
electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs:
poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y
silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos:
acrilamida, celulosa y isoticianato
• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y
el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades
adsortivas.

12. La enzima escogida como marcador debe:
• Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,
• Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de
fácil preparación.
Las enzimas más utilizadas
son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rábano y ß-
galactosidas

14. La elección del substrato es de gran importancia para
la estandarización del método ELISA y hay que tener
varios factores en cuenta, como son
sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así
como estabilidad después de la
reacción.
Requerimientos del sustrato
• Solubles en agua
• Fácil de manipular
• No tóxicos, no mutagénicos
• Bajo costo

15. Los métodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimática se dividen en dos tipos:
• Competitivos
• No competitivos
• ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir
con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del
antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a
que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido
desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.

16. • ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o
anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es
positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará con el respectivo
sustrato desarrollando color
Dentro de los no competitivos tenemos:
• Los directos que detectan antígenos
• Los indirectos que detectan anticuerpos

17. • Si la prueba se diseña para
detectar un antígeno, es un ELISA
DIRECTO porque esta buscando
directamente, como su nombre lo
dice, la sustancia extraña.
• En cambio, un ELISA INDIRECTO,
por su parte, se diseña para
detectar los anticuerpos que el
paciente ha creado contra el
antígeno

18. El sistema de detección emplea dos
anticuerpos: uno primario contra el
antígeno y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene
mayor sensibilidad por presentar una
amplificación de señal debida a la
unión de dos o más anticuerpos
secundarios por cada primario.

19. Materiales Orgánicos
• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)
• Antígenos
• Anticuerpos
• Enzimas
Materiales No Orgánicos
• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo
ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).

20. • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los
antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos
reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al
soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que
no hayan reaccionado.

21. • Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los
cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en
el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos.
Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no
hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la
enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado

22. Leyenda
Antígeno
Anticuerpo
Primario
Anticuerpo
Ligado a Enzima
Sustrato
Prueba ELISA Indirecta

23. • Detección de antígenos o anticuerpos:
Virus
Hongos
Parásitos
Bacterias.
• Detección de autoanticuerpos:
IgG(Factor reumatoideo)
DNA
Proteína del núcleo

24. • Medición de Hormonas:
Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina,
testosterona, gonadotropina coriónica humana, TSH.
• Detección de antígenos tumorales:
Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína
Antígeno del ovario
Antígeno carcinoembrionario

25. • En estudios serológicos, hematológicos,
endocrinológicos, oncológicos, en los
transplantes, la medicina forense y la
antropología.
• Con propósitos médicos se han aplicado en
la determinación de hormonas y proteínas
plasmáticas, antígenos tumorales, drogas,
Ag y Ac de microorganismos (parásitos,
hongos, bacterias, virus)
• Los resultados aportan elementos
diagnósticos, información de una
enfermedad y coadyudan en la planificación
del tratamiento