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Detección e Identificación
de Bacillus anthracis: De
convencional a molecular
INTEGRANTES:
Carhuamaca Huamani Diana Stefany
Yaringaño Joel
Introducción
Bacillus
anthracis
Agente
Etiologico del
Antrax
Biblia: Primer
Registro de
Antrax
“Pesadilla
Negra” siglo XVII
- Europa
Fue la base para
desarrollar la
bacteriología y
diagnostico
microbiologico
Barthelemy en
1823 demostró
la infecciosidad
de la
enfermedad.
1838 Delafond
observo al bacilo
1863-1864
Davaine
demostró la
transmisibilidad
del ántrax
1877 con los
postulados de
Koch se
demuestra la
causa del Antrax
INFECCION
Fisiopatología
La cápsula está constituída por poli-g-D-glutamato con una
inmunogenicidad extremadamente débil, que le permite
escapar de la fagocitosis. Los principales factores de patogenicidad son codificados por
genes ubicados en los plasmidos de virulencia px01 y pX02.
Las toxinas son 3 proteínas:
Antígeno protector(PA), factor
letal (LF), Factor de edema (EF)
Estadísticas
XX Sigue siendo una de las enfermedades mas importantes a nivel mundial,.
Incidencia en 1958 era de 20000 a 100000.
Debido a vaunas para antimales, se volvió esporádico en países desarrollados en el siglo
XX.
El interés aumento en 2001 después de los ataques bioterroristas en E.E.U.U. denominado
Arerithrax.
Se intentaron hacer pruebas rapidas para el personal de primera línea ( bombero,
soldados, olicias, médicos de emergencia)
S desarrollaron diferentes métodos de detección e identificación pero eran inespecíficas
Desafíos para la Identificación
 Gran similitud con fenotípica con Bacilus cereus y otras especies.
 Hay especies distribuidas en el ambiente como Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus
pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis.
 Es tanta similitud ue se han incluido dentro de un grupo llamado “grupo B cereus sensu lato.
 Los plasmidos de virulencia de B. anthracis pueden rnasferirse.
 Las muestras ambientales pueden contener diversos microorganismos y sus esporas, asi como
sustancias que pueden interferir con los componentes de la prueba, provocando reducción de la
sensibilidad, inhibición de la reacción , falsos positivos por reactividad cruzada.
Métodos
convencionales
Crecimiento en
Medios selectivos
Agar PLET
Agar cromogenico Antrax
(ChrA)
Agar Sangre Antrax (ABA)
Lisis de fagos gamma
Reacción de collar de
perlas
Tinción de la
capsula
Tincion de M”Fadyean
Tita China
Métodos de diagnostico Microbiológico
Métodos Basados en Amplificación de ADN
PCR
Los marcadores para B. anthracis se
encuentran en los plásmidos de virulencia
Pxo1 (componentes de toxina PA, LF, EF ) y
Pxo2 (genes que codifican la capsula).
La selección de un marcador para B.
anthracis es un desafío por que son
inespecíficos: Ba813, BA-5449, ORF vrrA y
rpoB.
La aplicación de PCR permite la detección
de polimorfismos de un solo nucleótido
especifico en los marcadores
cromosómicos seleccionados.
Como el uso de PCR en campo es
complicado se ha propuesto sondas
moleculares (HRM Y PCR-RFLP) para
detectar mutaciones especificas.
PCR
en
tiempo
Real
Se puede usar FilmArray, trabaja una
muestra a la vez para 27 objetivos
genéticos de 17 patógenos
(BioTrealPanel) incluidos los 3 objetivos
para B. anthracis.
RAZOR EX, una muestra a la vez para diez
patógenos.
T-COR 4 y T-COR 8, 4 y 8 muestras a la
vez.
POCKIT, hasta 8 muestras a la vez.
Los reactivos se elaboran en formato en
seco, y se almacenan a 4°C.
El PCR-RT permite la cuantificación del
producto y ausencia de manipulaciones
posteriores a la PCR.
Métodos Basados en Amplificación de ADN
AMPLIFICACION
DE
ADN
ISOTERMICO Amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA), la secuencia objetivo debe de tener un
tamaño de 80 a 400 pb, se usa cebadores y la amplificación se da por la acción de 3
proteínas: polimerasa desplasadora de cadena, una recombinasa y una proteína de unión
monocatenario durante 30 min a 38°C.
Amplificación dependiente de la helicasa (HDA), Participan una polimeraza de
desplazamiento de cadena, una proteína de unión a ADN de cadena sencilla, una helicasa y
un par de cebadores, durante 90 mins a 65°C.
Amplificación isotérmica mediada por bucle(LAMP), usa 6 cebadores para cada marcador, se
amplifica mediante una polimeraza de ADN de desplazamiento de cadena durante 1 hora a
60-65°C. El resultado es una mescla de amplicones, visibles en un gel de agarosa como
patrón de bandas.
Amplificación de circulo rodante (RCA)
Amplificación de ácidos nucleicos iniciada por cebador isotérmico y quimérico (ICAN)
Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA)
Amplificación isotérmica de cebador único (SPIA)
Reacción en espiral de polimerasa (PSR)
Tambien se describió la aplicación de métodos colorimétricos para la visualización de
amplicones LAMP con colorantes fluorecentes intercalados de ADN.
Métodos de Identificación Basados en Antígenos
• La selección de un antígeno diana adecuado depende del tipo de muestras por que se exponen diferentes antígenos en
células vegetales y esporas de Bacilus anthracis.
• Se ha observado reactividad cruzada con otros miembros del grupo B. cereus
• Los ensayos usados son Citometría de flujo combinado con anticuerpos marcados con fluoresceína, FRET (transferencia de
energía por resonancia de Foster), Ensayo Luminex, Inmunoensayo fluorogenico de partículas magnéticas (MPFIA),
inmunofiltracion ABICAP.
• Los Ensayos de Flujo lateral (LFA) son faciles de realizar y no requiere equipo. El Ac marcado con captura se une a su Ag
objetivo y fluye por una tira de cromatografía por fuerza capilar. Los complejos Ag-Ac y Ac libres son capturados por
anticuerpos secundarios inmovilisados en a línea de prueba y línea de control. Tiene una sensibilidad muy baja y sufre
interferencia por otros componentes de las muestras.
• El adelinato ciclasa luminicente para detectar el factor de edema activo. Se basa en la disminución de luminicescia en
respuesta a la dosis de EF, también informa sobre la expresión de uno de los factores clave de patogenicidad.
• Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), fue desarrollado para detectar el antígeno protector, antígeno capsular, y
factor letal.
• Recientemente se ha propuesto un enfoque basado en la reactividad celular de las células huésped con antígenos patógenos
especifico, en este ensayo la presencia de células activadas productoras de interferón gamma (productoras de IFNy) podría
detectarse en muestras de sangre periférica de 3 a 5 días antes que los anticuerpos séricos.
• Los biomarcadores como alternativa a la detección de anticuerpos específicos, podrían detectarse en suero de 3 a 6 horas
después de la infección, sin embargo solo podría lograrse luego de la eliminación de proteínas séricas muy abundantes por
cromatografía.
BIOSENSORES
• Se unen a marcadores de ADN específicos.
• Raveendran desarrollo un biosensor de AND basado en los picos redox de la voltamperometria cíclica(CV).
• Ziokowski desarrollo un biosensor voltametrico, contiene una sonda de bucle de vástago unida a un electrodo de oro para
reconocer el marcador pagA.
• Hao aplico un biosensor de microbalanza de cristal de cuarzo(QCM) para detección de marcadores cromosómicos.
Sondas de acido
nucleico y geo
sensores
• Inmunosensor electroquímico mejorado con metal
• Biosensor capilar portátil ultrasensible
• Sensores piezoeléctricos de microcantilever
Sondas de
anticuerpos e
inmunosensores
• Se menciona dos tipos de biosensores: Aptasensores (usan aptameros) y Biosensores que usan quimeras de péptidos y
acidos nucleicos (PNA) .
• Aun no se han utilizado ampliamente y hay muy pocos artículos sobre este tema.
• Mazzaracchio desarrollo un aptasensor impedimetrico para la detección de esporas simulantes.
• Bruno desarrollo un aptamero magnético.
• La mayoría de los biosensores se han probado en un numero de pacientes muy limitado de cepas.
Aptameros y
sondas quimeras
de péptidos y
ácidos nucleicos
MALDI - TOF
• ESPECTROMETRIA DE MASAS DE TIEMPO DE VUELO DE IONIZACION POR DESORCION LASER ASISTIDA POR
MATRIZ
• Se aplico por la identificación de B. anthracis a partir de cultivos puros, como de muestras clínicas y
ambientales.
CONCLUCIONES
• Se ha hecho un gran esfuerzo para encontrar métodos fiables para la identificación.
• Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos rápidos sensible y
específicos debido al bioterrorismo.
• A pesar del esfuerzo y el rápido desarrollo aun se enfrentan los mismos problemas
como la similitud de B. Anthracis con especies relacionados.
• Tener cuidado con los falsos positivos por que pueden causar terror publico.
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Expo bacterio - 1 - copia.pptx

  • 1. Detección e Identificación de Bacillus anthracis: De convencional a molecular INTEGRANTES: Carhuamaca Huamani Diana Stefany Yaringaño Joel
  • 2. Introducción Bacillus anthracis Agente Etiologico del Antrax Biblia: Primer Registro de Antrax “Pesadilla Negra” siglo XVII - Europa Fue la base para desarrollar la bacteriología y diagnostico microbiologico Barthelemy en 1823 demostró la infecciosidad de la enfermedad. 1838 Delafond observo al bacilo 1863-1864 Davaine demostró la transmisibilidad del ántrax 1877 con los postulados de Koch se demuestra la causa del Antrax
  • 4. Fisiopatología La cápsula está constituída por poli-g-D-glutamato con una inmunogenicidad extremadamente débil, que le permite escapar de la fagocitosis. Los principales factores de patogenicidad son codificados por genes ubicados en los plasmidos de virulencia px01 y pX02. Las toxinas son 3 proteínas: Antígeno protector(PA), factor letal (LF), Factor de edema (EF)
  • 5. Estadísticas XX Sigue siendo una de las enfermedades mas importantes a nivel mundial,. Incidencia en 1958 era de 20000 a 100000. Debido a vaunas para antimales, se volvió esporádico en países desarrollados en el siglo XX. El interés aumento en 2001 después de los ataques bioterroristas en E.E.U.U. denominado Arerithrax. Se intentaron hacer pruebas rapidas para el personal de primera línea ( bombero, soldados, olicias, médicos de emergencia) S desarrollaron diferentes métodos de detección e identificación pero eran inespecíficas
  • 6. Desafíos para la Identificación  Gran similitud con fenotípica con Bacilus cereus y otras especies.  Hay especies distribuidas en el ambiente como Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides, Bacillus pseudomycoides y Bacillus weihenstephanensis.  Es tanta similitud ue se han incluido dentro de un grupo llamado “grupo B cereus sensu lato.  Los plasmidos de virulencia de B. anthracis pueden rnasferirse.  Las muestras ambientales pueden contener diversos microorganismos y sus esporas, asi como sustancias que pueden interferir con los componentes de la prueba, provocando reducción de la sensibilidad, inhibición de la reacción , falsos positivos por reactividad cruzada.
  • 7. Métodos convencionales Crecimiento en Medios selectivos Agar PLET Agar cromogenico Antrax (ChrA) Agar Sangre Antrax (ABA) Lisis de fagos gamma Reacción de collar de perlas Tinción de la capsula Tincion de M”Fadyean Tita China Métodos de diagnostico Microbiológico
  • 8. Métodos Basados en Amplificación de ADN PCR Los marcadores para B. anthracis se encuentran en los plásmidos de virulencia Pxo1 (componentes de toxina PA, LF, EF ) y Pxo2 (genes que codifican la capsula). La selección de un marcador para B. anthracis es un desafío por que son inespecíficos: Ba813, BA-5449, ORF vrrA y rpoB. La aplicación de PCR permite la detección de polimorfismos de un solo nucleótido especifico en los marcadores cromosómicos seleccionados. Como el uso de PCR en campo es complicado se ha propuesto sondas moleculares (HRM Y PCR-RFLP) para detectar mutaciones especificas. PCR en tiempo Real Se puede usar FilmArray, trabaja una muestra a la vez para 27 objetivos genéticos de 17 patógenos (BioTrealPanel) incluidos los 3 objetivos para B. anthracis. RAZOR EX, una muestra a la vez para diez patógenos. T-COR 4 y T-COR 8, 4 y 8 muestras a la vez. POCKIT, hasta 8 muestras a la vez. Los reactivos se elaboran en formato en seco, y se almacenan a 4°C. El PCR-RT permite la cuantificación del producto y ausencia de manipulaciones posteriores a la PCR.
  • 9. Métodos Basados en Amplificación de ADN AMPLIFICACION DE ADN ISOTERMICO Amplificación de polimerasa de recombinasa (RPA), la secuencia objetivo debe de tener un tamaño de 80 a 400 pb, se usa cebadores y la amplificación se da por la acción de 3 proteínas: polimerasa desplasadora de cadena, una recombinasa y una proteína de unión monocatenario durante 30 min a 38°C. Amplificación dependiente de la helicasa (HDA), Participan una polimeraza de desplazamiento de cadena, una proteína de unión a ADN de cadena sencilla, una helicasa y un par de cebadores, durante 90 mins a 65°C. Amplificación isotérmica mediada por bucle(LAMP), usa 6 cebadores para cada marcador, se amplifica mediante una polimeraza de ADN de desplazamiento de cadena durante 1 hora a 60-65°C. El resultado es una mescla de amplicones, visibles en un gel de agarosa como patrón de bandas. Amplificación de circulo rodante (RCA) Amplificación de ácidos nucleicos iniciada por cebador isotérmico y quimérico (ICAN) Amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) Amplificación isotérmica de cebador único (SPIA) Reacción en espiral de polimerasa (PSR) Tambien se describió la aplicación de métodos colorimétricos para la visualización de amplicones LAMP con colorantes fluorecentes intercalados de ADN.
  • 10. Métodos de Identificación Basados en Antígenos • La selección de un antígeno diana adecuado depende del tipo de muestras por que se exponen diferentes antígenos en células vegetales y esporas de Bacilus anthracis. • Se ha observado reactividad cruzada con otros miembros del grupo B. cereus • Los ensayos usados son Citometría de flujo combinado con anticuerpos marcados con fluoresceína, FRET (transferencia de energía por resonancia de Foster), Ensayo Luminex, Inmunoensayo fluorogenico de partículas magnéticas (MPFIA), inmunofiltracion ABICAP. • Los Ensayos de Flujo lateral (LFA) son faciles de realizar y no requiere equipo. El Ac marcado con captura se une a su Ag objetivo y fluye por una tira de cromatografía por fuerza capilar. Los complejos Ag-Ac y Ac libres son capturados por anticuerpos secundarios inmovilisados en a línea de prueba y línea de control. Tiene una sensibilidad muy baja y sufre interferencia por otros componentes de las muestras. • El adelinato ciclasa luminicente para detectar el factor de edema activo. Se basa en la disminución de luminicescia en respuesta a la dosis de EF, también informa sobre la expresión de uno de los factores clave de patogenicidad. • Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), fue desarrollado para detectar el antígeno protector, antígeno capsular, y factor letal. • Recientemente se ha propuesto un enfoque basado en la reactividad celular de las células huésped con antígenos patógenos especifico, en este ensayo la presencia de células activadas productoras de interferón gamma (productoras de IFNy) podría detectarse en muestras de sangre periférica de 3 a 5 días antes que los anticuerpos séricos. • Los biomarcadores como alternativa a la detección de anticuerpos específicos, podrían detectarse en suero de 3 a 6 horas después de la infección, sin embargo solo podría lograrse luego de la eliminación de proteínas séricas muy abundantes por cromatografía.
  • 11. BIOSENSORES • Se unen a marcadores de ADN específicos. • Raveendran desarrollo un biosensor de AND basado en los picos redox de la voltamperometria cíclica(CV). • Ziokowski desarrollo un biosensor voltametrico, contiene una sonda de bucle de vástago unida a un electrodo de oro para reconocer el marcador pagA. • Hao aplico un biosensor de microbalanza de cristal de cuarzo(QCM) para detección de marcadores cromosómicos. Sondas de acido nucleico y geo sensores • Inmunosensor electroquímico mejorado con metal • Biosensor capilar portátil ultrasensible • Sensores piezoeléctricos de microcantilever Sondas de anticuerpos e inmunosensores • Se menciona dos tipos de biosensores: Aptasensores (usan aptameros) y Biosensores que usan quimeras de péptidos y acidos nucleicos (PNA) . • Aun no se han utilizado ampliamente y hay muy pocos artículos sobre este tema. • Mazzaracchio desarrollo un aptasensor impedimetrico para la detección de esporas simulantes. • Bruno desarrollo un aptamero magnético. • La mayoría de los biosensores se han probado en un numero de pacientes muy limitado de cepas. Aptameros y sondas quimeras de péptidos y ácidos nucleicos
  • 12.
  • 13. MALDI - TOF • ESPECTROMETRIA DE MASAS DE TIEMPO DE VUELO DE IONIZACION POR DESORCION LASER ASISTIDA POR MATRIZ • Se aplico por la identificación de B. anthracis a partir de cultivos puros, como de muestras clínicas y ambientales.
  • 14. CONCLUCIONES • Se ha hecho un gran esfuerzo para encontrar métodos fiables para la identificación. • Los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de ensayos rápidos sensible y específicos debido al bioterrorismo. • A pesar del esfuerzo y el rápido desarrollo aun se enfrentan los mismos problemas como la similitud de B. Anthracis con especies relacionados. • Tener cuidado con los falsos positivos por que pueden causar terror publico.