Microbiologia

1. Microbiología-Práctica
Aislamiento, cultivo y
recuento de
microorganismos
Mg. Mayron A. Candia Puma

2. Cultivo de microorganismos
Para la determinación de
la presencia de un
microorganismos en una
determinada muestra,
será necesario un cultivo
Proporcionar al
microorganismo las
condiciones ideales para
su multiplicación
Con el fin de
Se busca obtener un
número suficiente
de células
Determinar la presencia o
ausencia de microorganismos
Hacer un recuento de
microorganismo
Identificar
microorganismos
Determinar la sensibilidad
a antimicrobianos

3. Medios de cultivo
Composición
Es una mezcla equilibrada de
nutrientes y otros componentes
que permiten el crecimiento de
microorganismos in vitro
depende
Base mineral
Nutrientes
inorgánicos
contiene
Macronutrientes Micronutrientes Fósforo Requerimientos
específicos
K
Mg
Ca
Fe
Mn
Co
Cu
Mo
Zn
Puede ser
suministrada
en forma sales
inorgánicas
Sirve como
regular de pH
Suplementación
de la base mineral
Fuente de
carbono
Fuente de
nitrógeno
Fuente de
azufre
Fuente de
crecimiento
Microorganismo que se quiera
cultivar y de la determinación que
se vaya a llevar acabo

4. Medios de cultivo
Constituyentes
Agente
gelificante
Da solidez
al medio
Agar Gelatina
Polisacárido
obtenido a partir
de algas marinas
Se licúa alrededor
de los 100 oC y se
gelifica sobre los
40 oC.
https://www.youtube.com/watch?v=YGoPu0cn9ms
Tiene naturaleza
proteica y se
obtiene a partir
del colágeno de
tejidos animales
Extractos
Animales Vegetales Levaduras
Nutrientes ricos en
carbohidratos,
proteínas, vitaminas
y minerales
Ejemplo: Extracto de
levadura es utilizado
debido a su alto contenido
en vitaminas del grupo B
Sangre, suero
o plasma
Aportan
hormonas y
factores de
crecimiento
Usos
Detección de reacciones
hemolíticas (sangre)
Determinación de la
actividad coagulasa (plasma)
Algunos microorganismos
patógenos necesitan la
presencia del factor X (hemina)
para su crecimiento

5. Medios de cultivo
Constituyentes
Carbohidratos Peptonas Buffers e
indicadores
de pH
Se utilizan como
fuente principal de
carbono y energía
Son el producto de la
digestión ácida de
enzimática de
proteínas, por lo que su
composición es variable
Son ricas en
aminoácidos y
péptidos, por lo que
constituyen una fuente
de nitrógeno
Permiten el
crecimiento optimo
de microorganismos
Detectan variaciones
de pH en el medio
Bilis y sales
biliares
Se utilizan para
inhibir el
crecimiento de
grampositivos
Agentes
reductores
Por ejemplo, la
cisteína se emplea
para el
crecimiento de
microorganismos
microaerófilos o
anaerobios
Colorantes
Se emplean como
inhibidores de
crecimiento de un
determinado
grupo de
microorganismos

6. Medios de cultivo
Clasificación
Consistencia
Física
Según su
Caldos o medios
líquidos
Medios
semisólidos
Medios
sólidos
Consistencia intermedia
entre los caldos y los
medios sólidos
Se utilizan para apreciar
la movilidad de los
microorganismos
https://www.youtube.com/watch?v=Uv-s97Y8IkA
Su composición es la
misma que los medios
liquido, pero se les
añade un agente
gelificante

7. Medios de cultivo
Clasificación
Consistencia relacionados con el
recipiente de uso y su utilidad
Según su
Caldos o medios
líquidos
Medios
semisólidos
Medios
sólidos
Matraz
o frasco
Tubo
Obtención
de una gran
cantidad de
biomasa
Estudio de
características
especificas
Obtención
de biomasa
Tubo
Estudio de
movilidad
Placa
Petri
Tubo
inclinado
Pico de
flauta
Aislamiento
Estudio de
características
Recuentos, etc.
Aumento de
la superficie
de siembra
en aerobiosis

8. Medios de cultivo
Clasificación
Composición
química
Según su
Medios definidos
o sintéticos
Medios
complejos
Medios
enriquecidos
No se conocen con
exactitud los
porcentajes de cada
nutriente, ya que es
una mezcla compleja
que generalmente
posee extractos
Son medios complejos a
los que se les han añadido
elementos nutritivos
complementarios como
sangre o albúmina
Se conoce exactamente
la composición de los
elementos presentes en
el medio y su
proporción

9. Medios de cultivo
Clasificación
Composición
química
Según su
Medios
generales
Medios
diferenciales
Medios
selectivos
Contienen reactivos
que permiten distinguir
unos microorganismos
de otros en función de
su crecimiento en dicho
medio
Permiten el
crecimiento de solo de
determinado grupos
de microorganismos
Permiten el crecimiento
de una amplia variedad
de microorganismos
Medios
de enriquecimiento
Favorecen el crecimiento
de un determinado
microorganismo, sin
inhibir completamente el
crecimiento de otros.
Normalmente los medios de cultivo se
obtienen deshidratados en polvo para
su preparación en el laboratorio
Colonias bacterianas es un conjunto de células
bacterianas que se pueden observar macroscópicamente
y que proceden de una misma célula

10. Medios de cultivo
Más
utilizados
Agar
McConkey
Medio
selectivo
para
bacterias
entéricas
Contiene
sales biliares
y cristal
violeta
Inhibe el crecimiento
de grampositivas y de
muchas gramnegativas
no entéricas
Es un medio diferencial
porque permite
diferenciar las bacterias
fermentadoras de glucosa
de las no fermentadoras
La lactosa es
el único
carbohidrato
del medio
Contiene un
indicador de pH,
el rojo neutro
(rojo a pH < 6.8)
Las bacterias
fermentadoras
de lactosa
producen
ácidos
formando
colonias color
rojo
Las bacterias no
fermentadoras
de lactosa
forman colonias
incoloras o
transparentes
Bacterias entéricas o enterobacterias son un grupo
heterogéneo y extenso de bacilos gramnegativos
cuyo hábitat natural es el intestino del ser humano
y de los animales.
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
Shiguella Salmonella

11. Medios de cultivo
Más
utilizados
Infusión Cerebro
Corazón (BHI)
Agar Mueller-
Hinton
Medio complejo
utilizado para el
crecimiento de una
amplia gama de
microorganismos,
incluyendo
bacterias y hongos
Medio utilizado
para la
determinación
de la
sensibilidad a
antibióticos
Agar Hektoen
entérico
Medio para
aislar bacterias
entéricas
gramnegativas,
especialmente
Salmonella y
Shiguella spp.
Contiene sales
biliares que
inhiben el
desarrollo de
muchas
bacterias
grampositivas y
gramnegativas
no entéricas
Posee azul de
bromotimol y
fucsina acida
como indicadores
de fermentación
de carbohidratos
Contiene citrato
de hierro como
un indicador de la
formación de H2S
Bacterias fermentadoras de
lactosa: colonias amarillas
Bacterias no fermentadoras de
lactosa: colonias verde azuladas
Bacterias
productoras se
SH2 : colonias con
centro negro

12. Medios de cultivo
Más
utilizados
Agar Levine Agar CLED Medio Luria-
Bertani
Medio utilizado
para el aislamiento
de enterobacterias,
ya que inhibe el
crecimiento de
grampositivos
Se utiliza para la
diferenciación de E.
coli, que forma
colonias verde
negruzco con un
brillo metálico
Medio de cultivo
utilizado para el
crecimiento de
microorganismos
patógenos en
muestras de orina
Previene el desarrollo
invasor de Proteus
spp.
Es un medio rico
en nutrientes
que permite el
crecimiento de
una gran
variedad de
bacterias
Agar Bilis
esculina
Es un medio
selectivo y
diferencial
utilizado para el
aislamiento y la
diferenciación
de enterococos
Agar
DNasa
Agar con alto
contenido de
ADN
Se utiliza para la
detección de
microorganismos
coagulasa
positivos como
Staphylococcus
aureus
Agar
Granada
Agar diferencial y
selectivo para
estreptococos del
grupo B,
principalmente
Estreptococcus
agalactiae

13. Agar
Manitol
salado
Agar
Chapman
Permite la
detección y
aislamiento de
estafilococos.
Diferenciación
entre las especies
Poseen una alta
concentración de
NaCl (7.5%)
Medios de cultivo
Más
utilizados
Coagulasa
positivas
Coagulasa
negativas
Tiene un
indicador
de pH –
Rojo fenol
Utilizan el manitol
generan un pH ácido y el
medio se torna amarillo
No provocan cambio de
color y el medio
permanece rojo
Evita el crecimiento
la mayoría de
bacterias de otros
géneros
Agar
Mitis
salivarius
Aislamiento de
estreptococos
orales y
enterococos
Presenta cristal violeta,
telurito de potasio y azul
de tripán que son
agentes selectivos que
inhiben la mayoría de
bacilos gramnegativos y
bacterias grampositivas

14. Medios de cultivo
Más
utilizados
Agar
Sabouraud
Agar tripticasa
de soya
Agar
Nutritivo
Medio diferencial
especifico para el
crecimiento de
hongos y levadura
Poseen una alta
concentración de
glucosa que no es
tolerable por la
mayoría de
bacterias
Favorece el
crecimiento de una
gran variedad de
microorganismos
Medio para el aislamiento
y recuento de
microorganismos con
escasos requerimientos
nutricionales
Agar
sangre
Combinación de
agar nutritivo
con sangre (5%)
Permite el crecimiento de
microorganismos
nutricionalmente exigentes
y la clara visualización de
reacciones de hemólisis

15. Medios de cultivo
Preparación
https://www.youtube.com/watch?v=C-SuBH14R-E
Actividad 1
Observar el siguiente video y describir el
procedimiento para la preparación de los
medios de cultivo

16. Medios de cultivo
Esterilización y
almacenamiento
Tras su preparación,
los medios de
cultivo deben ser
esterilizados
Si el medio es estéril, se
podrá tener la certeza de
que el crecimiento
obtenido sea el de la
muestra sembrada y no
proceda de
contaminaciones
El uso del autoclave
es el método mas
utilizado en la
esterilización de
medios de cultivo
Los medios de
cultivo preparados
deberán ser
almacenados en
frío (2 – 8 oC), para
lo cual se utiliza
frigoríficos
Los medios sólidos preparados
pueden conservarse unos tres
meses y los medios líquidos en
recipientes que no dejan pasar
el aire, duran 6 meses
Para mejorar la
conservación de los
medios de cultivo,
las placas deben
guardarse
invertidas y dentro
de bolsas de
plástico o papel.
https://www.youtube.com/watch?v=C-SuBH14R-E

17. Medios de cultivo
Siembra de
microorganismos
Luego de la preparación
del medio de cultivo, se
podrá realizar la
siembra de las muestras
Principales técnicas
Agotamiento
por estría
Estudiar las características de las colonias
Obtener colonias aisladas
Obtener gran cantidad de masa microbiana
Se agota el inoculo que arrastra el asa de
forma que, al final, lleve solo unas pocas
células que se depositan una a una en el
agar, generando una colonia aislada
https://www.youtube.com/watch?v=6NckVGCobwY

18. Medios de cultivo
Siembra de
microorganismos
Principales técnicas
Extensión
superficial
Realizar recuentos o aislamientos a
partir de microorganismos
suspendidos en un muestra liquida
https://www.youtube.com/watch?v=rUwSmytEpiU

19. Medios de cultivo
Siembra de
microorganismos
Principales técnicas
En profundidad
o en placa
vertida
Utilidad similar a la siembra de
extensión superficial. Sin
embargo, esta permite utilizar
un volumen de muestra mayor
Será necesario que los
microorganismos que se
quieran sembrar soporten
temperatura de 45 oC.
https://www.youtube.com/watch?v=oDeVPidJZ1k

20. Medios de cultivo
Siembra de
microorganismos
Principales técnicas
En tubo de
medio solido
inclinado
Se utiliza para el crecimiento
de miroorganismos en
anaerobiosis.
Permita que exista una
mayor superficie sobre la que
sembrar en un espacio
pequeño, por lo que el riesgo
de contaminación es menor
Picadura
Estría
https://www.youtube.com/watch?v=WbblbW5OqkQ

21. Medios de cultivo
Siembra de
microorganismos
Principales técnicas
En medio líquido
Se utiliza para estudiar características
especificas del microorganismo
sembrado o para obtener grandes
cantidades de biomasa
https://www.youtube.com/watch?v=Pq193eZI3fk

22. Medios de cultivo
Incubación
Periodo de tiempo comprendido
entre la siembra del microorganismos
y la lectura de resultados
Se generan y mantienen las
condiciones ambientales que
permiten el crecimiento optimo
del microorganismo de interés
Condiciones
Varían según el
microorganismo y la
determinación que se
quiere llevar a cabo
Temperatura
Cada microorganismo
posee un temperatura
óptima de crecimiento
Los microorganismos
patógenos
Grupo de los
mesófilos
pertenecen
Crecen a
temperaturas
entre 20 – 40 oC
En general, los patógenos para el hombre
poseen una temperatura optima de
crecimiento cercana a los 37 oC
Humedad
Se usa un ambiente
húmedo para el correcto
crecimiento de los
microorganismos
Las incubadoras poseen una puerta de cristal
que permite ver a través de ella, evitando la
perdida de humedad y temperatura

23. Medios de cultivo
Incubación
Condiciones
Luz Presencia/
ausencia
de oxigeno
La mayoría de las
bacterias crecen mejor
en ausencia de luz
Los microrganismos
presentan diferentes
requerimientos en
función al oxígeno
Aerobias
Anaerobias
estrictas
Necesitan
oxígeno
Anaerobias
facultativas
No pueden vivir en
presencia de oxigeno
Son capaces de soportar condiciones
de anaerobiosis, pero crecen mejor en
presencia de oxígeno
Microaerófilas
Crecen en pequeñas
cantidades de oxígeno
Aerotolerantes
Crecen en presencia de oxigeno,
pero no lo necesitan para vivir
Capnófilas
Son bacterias aerobias que, además
de O2, necesitan también la presencia
de un 5-10% de CO2 para crecer
Para realizar un cultivo
en condiciones de
anaerobiosis
Jarras de
anaerobiosis
Cubeta normalmente transparente
que cierra de manera hermética y
que posee un soporte donde se
introduce las placas

24. Medios de cultivo
Aislamiento de
microorganismos
Método de
aislamiento
más utilizado
Es la obtención de colonias de
un microorganismo que se
encuentren perfectamente
separadas de otras colonias
Todas las bacterias presentes en
dicha colonia provengan de una
misma bacteria inicial (unidad
formadora de colonias – UFC) Siembra de
agotamiento por estría
Al tener una muestra,
no se sabe la cantidad
de microorganismos
presentes en la misma
Preparar diferentes diluciones de la
muestra inicial y realizar varias
siembras con el fin de asegurar la
obtención de colonias aisladas
Se debe

25. Medios de cultivo
Recuento de
microorganismos
Contadores
de colonias
Número de
microorganismos presentes
en un volumen de muestra
determinado
Zona iluminada
para colocar la
placa Petri
Cuadricula que
sirve de guía
Una lupa
Un contador
https://www.youtube.com/watch?v=Gp-two7MINU

26. Actividad 2
a) En cuanto al agar manitol salado Indicar los siguientes
aspectos:
• Composición
• Utilidad de cada componente
• Instrucciones de preparación, siembra e incubación
b) Indicar cual es la probable bacteria de acuerdo a los siguiente resultados, fundamente su respuesta
Agar Manitol Salado después de
24 horas de incubación
Tinción de Gram
Agar Manitol Salado
sin sembrado

27. Bibliografía
• Bou, G., Fernández-Olmos, A., García, C., Sáez-Nieto, J. A., & Valdezate, S. (2011). Métodos
de identificación bacteriana en el laboratorio de microbiología. Enfermedades infecciosas y
microbiología clínica, 29(8), 601-608.
• Harrigan, W. F., & McCance, M. E. (2014). Laboratory methods in microbiology. Academic
press.
• Porres, N., & Ruiz E. (2018). Microbiología clínica. Paraninfo.
• Saravia, M. E., Nelson-Filho, P., Silva, R. A. B., De Rossi, A., Faria, G., Silva, L. A. B., & Emilson,
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