1. THE FASCIOLA HEPATICA TEGUMENTAL
ANTIGEN SUPPRESSES DENDRITIC CELL
MATURATION AND FUNCTION
Clare M. Hamilton,1 David J. Dowling,1 Christine E. Loscher,2
Russell M. Morphew,3
Peter M. Brophy,3 and Sandra M. O’Neill1*
Parasite Immune Modulation Group, School of Nursing,1 and
Immunomodulation Group, School of Biotechnology,2
Dublin City University, Glasnevin, Dublin 9, Ireland, and Institute of
Biological Sciences, Aberystwyth University,
Aberystwyth, Ceredigion, Wales, United Kingdom3 (2009)
Yenny Maylin Aybar Flores
2. ANTECEDENTES Y *OBJETIVO:
Helmintos propiedades antiinflamatorias.
De forma significativa:
Teg de Fasciola H. IFN-γ & IL-12p70
Ag de Parásitos con efectos
inmunomoduladores en Dcs afectando prod.
de citoquinas proinflam.
* Investigar los efectos de Teg en la activación
y función de las DC.
3. ¿POR QUÉ CÉLULAS DENDRÍTICAS?
Buena fuente de IL-12p70.
Fundamentales en la inmunidad
adaptativa.
Generan respuestas inflamatorias
asociadas a inmunopatología.
4. CONCEPTOS:
IL-12p70: Una IL-12 en la forma activa del
heterodímero (p40 & p35), promueve la
diferenciación hacia Th1 / Favorece al Th1
por producir TNF-α e IFN-γ. Dcs.
IFN-γ: Importante en la activación de los
macrófagos. ( Th2)
CD 40, 80 & 86: Moléculas
coestimuladoras en la activ. De LPS- TLR
(4) que desencadena una cascada de
señaliz. de Mapks y NF-KB.
Activación de TLR asociado a desórdenes
inflamatorios.
7. Maduración DC prod. de
citoquinas (así como de factores
proinflamatorios)
¿Respuesta inmune?
*Alteración de función por:
Capacidad fagocítica (IFN-γ & otras
citoquinas)
Activar cél. T
8. Las respuestas Th2 ejercen un papel clave en la resistencia a helmintos.
Actividad anti-inflamatoria
Th2:
Más
oportunidades
De sobrevivir.
9.
10. ¿QUÉ HACE FASCIOLA HEPÁTICA?
La respuesta Th1 debería ocurrir en
condiciones normales pero el parásito la burla.
¿Cómo?
Modulan a las células presentadoras de
antígeno (CD.)
Regulan la producción de Th2 en el tracto
digestivo e inducen la producción de células
T reguladoras que pueden controlar células
T autorreactivas => Limitan la inflamación.
11. MATERIALES & MÉTODOS:
Ratones: C57BL/6j, BALB/c & DO11.10 TCR
transgenic mice.
Balb/c: Son cepas europeas que generan
tumores.
C57BL/6j: La más usada para ser
manipulada genéticamente en el estudio de
las enfermedades humanas.
DO11.10 TCR: TCR que reconoce OVA
como PAMP.
12. MATERIALES & MÉTODOS:
Gusanos adultos de F. hepática en PBS-
>incubación en Nonidet P-40-> colectar
sobrenadante -> aire comprimido para: filtrar &
concentrar => centrifugación => guardar a
20°C.
13. MATERIALES & MÉTODOS:
Estudios de MAPK: incubadas con ERK, p38
o JNK I (1 hora antes) del TLR-Lig. Stim.;
Control: Teg solo, medio, LPS solo (+
inhibidores).
No se muestran resultados.
15. Shock séptico: 4 grupos
C57BL/6j
Finalidad: Inducir al
organismo a una rpta.
Inflamatoria.
En el modelo en ratones de
shock séptico in vivo:
Teg suprime IFN-
γ & IL-12p70
(ELISA)
• Sacrificio 6 horas
después.
Potente efecto
antinflamatorio.
-/+ 2.5 hrs
L
e
v
e
L
16. Dcs excelentes productoras de citoq.
proinflamatorias ¿Teg estaría alterando
sus funciones?
17. ILs medidas por ELISA.
Nitrito: Rctivo de Griess
IL-6: Citoquina proinflamatoria
IL-10: interviene en la regulación de la respuesta
inflamatoria.
Teg modula la producción de
citoquinas en Dcs estimuladas por
18. 1: LPS (1h)
2: Teg + LPS
(1h)
3: LPS (4h)
4: Teg+LPS
(4h)
*Teg inhibe la transcripción al
comienzo. Pero no es
constante.
Con RNA extraído de Dcs.
La subunidad p35 está siendo
regulada.
19. a) Línea gruesa: Cél estimuladas con LPS.
b) Línea delgada: Cél estimuladas con Teg + LPS
c) Sombreado: Controles de isotipos.
*Hay menos cantidad de las Cds en membranas pero no
llega a concentraciones basales.
Expresión, típico de
maduración en DCs
inducidas por LPS.
a)
Teg modula la
expresión
de marcadores de
superficie
20.
21. Cél vivas
Cél
muertas
Cél Apopt.
Tempranas
Cél Apopt.
tardías
Viabilidad celular con un ensayo de Anexina V ~ Cuantificación:
sorting celular de fluorescencia activada.
Teg modula la producción de citoquinas de DC
estimuladas por LPS & de marcadores de superficie
(Cds) sin afectar la viabilidad celular.
La dif. entre prod. de
citoquinas y menor
expresión de Cds no se debe
a muerte celular.
22. Evaluación de crecimiento y viabilidad celular:
Ensayos colorimétricos para medir la
actividad de enzimas que reducen MTT o
tintes cercanos.
23. La supresión de producción de citoquinas en DC inducidas por LPS por
Teg no depende del tiempo de exposición y no es mediado por TLR4.
Dif. significativa
con el
control, mas no
entre sí. T de
exposición
NO
importa.
control Mutante
TLR4
Cepas de
ratones
Ratones knock-
out
Es
independiente
de TLR 4
Teg antes
A: No
compite con
LPS por
binding.
24. ¿Estaría afectando a otras
vías? ¿Tiene un efecto supresor más
amplio y complejo que atacar a
una sola vía?
25. Med:
Ausencia
Teg ataca a múltiples vías de TLR en
Dcs.
*En todos los casos se cultivó con 2.5 hrs antes
d stim
a)ELISA sandwich, 18 hrs luego de la stim. TLR-
L=> maduración (sobrenadante)
TLR
2
TLR 5 TLR 9TLR 3TLR
2
Beta glucano.
PGN
Flagelina
Polyinosinic:polycytidylic acid
(vir –stim)
Moléc. DNA Synth Single-
27. Teg afecta a una
vía diferente a la
del TLR.
Dcs cultivadas con Teg 2.5 hrs antes
de ser estimuladas con PMA para
producir tales citoquinas y los CDs
respectivos.
A:Se usó ELISA sándwich para
medirlas
B: Citometría de flujo.
X stimulation
28. Teg suprime fagocitosis de cél
dendríticas.
Eritrocitos
fagocitados
Fueron tratados por 2.5 horas para luego exponer al cultivo de Dcs a
eritrocitos opsonizados por IgG.
CytoSelect 96-well phagocytosis assay para medir la habilidad
fagocítica, ensayo colorimétrico usando una absorbancia de 610 nm.
29. Teg afecta la habilidad de las DCs para activar a Células T.
Se usaron ratones DO11.10. virgen Se cultivaron las Dcs con OVA en
presencia o ausencia de Teg antes de inocularlas. En SDLNs la activación
de cél T se midió 7 días después por reestim. con OVA o PMA/antiCD3.
Medición con un ensayo comercial.
Estimulación:Prod:
Dcs expuestas a
Teg suprimen la
rpta Th1 in vivo.
Teg tiene un
efecto
supresivo en
rptas no
específicas
de cél T
(Especif)
2x DNA
Uso de un
isótopo:
[3H]thymidin
e
30. FIG. 8. F. hepatica Teg
suprime la activación de
NFK- Bp65, pero la
activación de JNK, p38, o
ERK no puede explicar el
efecto total de supresión
de F. hepatica Teg (FhTeg)
en DCs.
Cultivadas después de 2 horas de stimul- LPS, se determinó NF-kB por
lisis celular en western blot.
Medium (lane 1), FhTeg (lane 2), LPS for 15 min (lane 3),
FhTeg plus LPS for 15 min (lane 4), LPS for 30 min (lane 5), FhTeg
plus LPS for 30 min (lane 6), LPS for 1 h (lane 7), and FhTeg plus LPS
for 1 h (lane 8).
Incremento
momentáne
o
Análisis
densitométrico
32. ¿QUÉ OCURRÍA?
Teg NO inducía producción de citoquinas
ni expresión de marcadores en superficie
celular si no…
33. Teg significativamente suprimió la producción de citoquinas (IL-12p70, IL-
6, IL-10, tumor necrosis factor alpha & nitrite) y la expresión de
marcadores de superficie (CD80, CD86, and CD40) en DC maduras =>
Supresión de los CD indica falla en la activación de linfocitos T.
Teg tiene un mecanismo de acción = al del reconocimiento por TLR-4
({LPS) debido a que aún funcionaba en CD generadas a partir de TLR-4
mutante & knock out .
Parece no atacar los componentes comunes de la vía de TLR. En DC
madura suprime al la subunidad p65 activa de NF- KB => Explicando la
alteración de la producción de citoquinas proinflamatorias.
** P50 & P65 del heterodímero NF-KB. Entre las respuestas celulares
involucradas con la activación de NF-kB se encuentran: la activación de
células del sistema inmune a través de la inducción de citoquinas, la
migración celular y reparación de tejidos a través de la inducción de
moléculas de adhesión, inflamación a través de la inducción de proteínas
de fase aguda, inhibición de la apoptosis y tumorigénesis a través de la
Expresados en la
superficie de:
CD40: Linfocitos B
CD 80 & 86: DC.
IL-6:, TNF-α Citoquina proinflamatoria
IL-10: interviene en la regulación de la
respuesta inflamatoria.
Nitrito: Producto final del NO. (Defensa
parás.)
IL-12p70: Estimula TNF-α y (IFN-γ => IL
– 4)
Favorece Th1
34. No induce a maduración DCs, aún así son capaces de
inducir a una rpta potente mediadas por Th2.
La supresión de citoquinas fue selectiva.
Faltan estudios para determinar de forma concluyente si Teg
deriva a una rpta.
Th2 o respuesta T-regulatorias.
Teg mantiene a las DCs inmanduras, alterando su función y
su habilidad para rpta adaptativa.
35. CONCLUSIÓN FINAL:
En suma, los resultados obtenidos
demuestran las potentes propiedades anti-
inflamatorias del Teg de F. hepática y su
potencial terapéutico como un agente anti-
inflamatorio.