Patologia e inmunologia

GUÍA TÉCNICA
PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA
DE CAMARONES PENAEIDOS
PROGRAMA CYTED
ÁREA DE AGROALIMENTACIÓN
RED II-D: Red Vannamei
Editores:
Vielka Morales Q.
Jorge Cuéllar-Anjel
Autores:
María José Almanza Abud
Margherita Anna Barracco
Donald V. Lightner
Emiko Shinozaki Mendes
Alitiene Moura Lemos Pereira
María Soledad Morales Covarrubias
Carlos Pantoja
Luciane María Perazzolo
Rafael Diego Rosa
Agnés Saborio Coze
Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira

Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos
ii
La presentación y disposición en conjunto de:
GUÍA TÉCNICA - PATOLOGÍA E INMUNOLOGÍA DE
CAMARONES PENAEIDOS
son propiedad de los editores. Ninguna parte de esta obra
puede ser reproducida o transmitida, mediante ningún
sistema o método, electrónico o mecánico (incluyendo
fotocopiado,lagrabaciónocualquiersistemaderecuperación
y almacenamiento de información), sin consentimiento por
escrito de los editores.
Derechos reservados:
© 2008 Vielka Morales Q. y Jorge Cuéllar-Anjel
(507) 6671-8936
(507) 6616-0756
email: vielkamorales2003@yahoo.com
email: jocuan@gmail.com
Panamá
Primera edición en español
Hecho en Panamá
ISBN: 978-9962-661-02-3
Esta obra se citará de la siguiente manera:
Todo el libro:
Morales, V. y J. Cuéllar-Anjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones
Penaeidos. Programa CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp.
Ejemplo para citar un capítulo:
Pantoja, C. y D.V. Lightner. 2008. Enfermedades virales pp. 55-114. En: Morales, V. y J. Cuéllar-
Anjel (eds.). 2008. Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos. Programa
CYTED Red II-D Vannamei, Panamá, Rep. de Panamá. 270 pp.
Diseño e impresión:
New Concept Publications, Inc.
(507) 226-7694
Panamá
Daniel Ho - Fotografías de portada, contraportada, páginas 1, 55, 117, 135, 159, 169, 225, 243 y 254

iii
AGRADECIMIENTOS
Los editores agradecen la colaboración de Reinaldo Morales y Hugo Pérez
Athanasiadis, por la traducción preliminar del portugués al español, de varios capítulos
del libro, así como a Roberto Chamorro (Licencia de intérprete público autorizado del
Ministerio de Gobierno y Justicia de Panamá, Resolución Nº 28, de 8 de marzo de 1984)
por la revisión y perfeccionamiento de los documentos traducidos.
De igual manera por la revisión y aportes de la Dra. Patricia Del Portillo (Métodos
Moleculares), Dra. Margherita Barracco (Parámetros Inmunológicos), Dr. Carlos Pantoja
y Kenneth W. Hasson (Parásitos en Camarones), Ing. Roberto Chamorro y Dra. María del
Pilar Moyano (Métodos de Diagnósticos) y Oscar Olivares (glosario y correcciones de
texto).

iv
IN MEMORIAM
ELPIDIO BELTRAME, el hombre incansable y luchador por la camaronicultura en
la región, hoy no se encuentra con nosotros, no obstante, su recuerdo permanecerá por
siempre en el corazón de todos los que tuvimos la suerte de trabajar a su lado.
El Grupo Técnico Asesor (GTA) de la RedVannamei del CYTED y los autores de esta
Guía Técnica - Patología e Inmunología de Camarones Penaeidos, deseamos dedicarla
a nuestro amigo, hermano y compañero, ELPIDIO. El fue uno de nuestros pilares en el
GTA de la RedVannamei, con aportes de grandes ideas y colaboración desinteresada para
el buen manejo y beneficio de la actividad camaronera no sólo en Brasil, su país natal,
sino también en el resto de los países iberoamericanos que conforman esta importante
familia CYTED.
Gracias por tu contribución a una actividad que seguirá dando respuestas en la
generación de empleos y divisas a diferentes países de iberoamerica.

v
PRÓLOGO
La camaronicultura tiene sus inicios en la década del ‘60 incrementándose
rápidamente en la del ‘70, surgiendo como una de las fuentes de mayores ingresos de
divisas por sus elevadas producciones. En la actualidad y según estudios de la FAO, aún
existen 18 países de América Latina que se dedican a la actividad específicamente con
especies del género Penaeus (también llamado Litopenaeus).
Para la década del ‘90, la reducción en el número de fincas de cultivo, se debió
a enfermedades que se reportaron desde la aparición del Taura en los años 93-94 y
el Síndrome de la Mancha blanca en los años 98-99, afectando grandemente las
producciones y dando como resultado el cierre de muchas empresas, pérdidas de
empleos y por ende de ingresos.
La industria ha tenido que ir implementando innovaciones tecnológicas y
mejoramiento en el manejo de los cultivos de camarón, observándose una lenta
recuperación en sus producciones y en la productividad.
Sin embargo, con la expansión territorial de esta actividad y el desarrollo de técnicas
de diagnóstico de enfermedades, han sido identificados nuevos agentes patógenos. Es
por ello que nos sentimos complacidos que un grupo de científicos, preocupados por la
situación actual en los temas de enfermedades, haya querido compartir sus conocimientos
y experiencias de muchos años, a través de esta importante Guía Técnica de Patología e
Inmunología de Camarones Penaeidos, diseñada para productores, técnicos, estudiantes
y cualquier otro entusiasta interesado en contar con un texto de apoyo que le signifique
una herramienta útil y práctica en su actividad diaria.
Como regente de un sector que vela por el desarrollo de las actividades acuícolas
en la República de Panamá, nos sentimos honrados de poder expresar la importancia de
esta Guía que consideramos un aporte significativo para el sector de la camaronicultura
en Iberoamérica.
GUILLERMO A. SALAZAR N.
Ministro de Desarrollo Agropecuario
Panamá, 2008

vi

vii
INTRODUCCIÓN
El Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED)
es un programa internacional multilateral de cooperación científica y tecnológica de
ámbito iberoamericano y carácter horizontal.
En el marco del CYTED, hay una serie de acciones dentro de las cuales se encuentran
las Redes Temáticas, que son asociaciones de grupos de I+D pertenecientes a entidades
públicas o privadas de al menos seis países miembros del Programa y cuyas actividades
científicas o tecnológicas están relacionadas con el tema de la red.
En este caso en particular, la Red denominada FORO PARA LA GESTIÓN DE
CONOCIMIENTOS Y TRANSFERENCIA DE TECNOLOGÍAS SOBRE EL CULTIVO DE
PENAEUS VANNAMEI: RED VANNAMEI, realizó una serie de actividades en beneficio
de la industria camaronera de los países iberoamericanos que se dedican a la actividad.
Entre los objetivos logrados por la Red, están las siguientes: constitución de un foro
regional de convergencia para los grupos de investigación, productores y sector estatal;
fomento de la investigación interdisciplinaria que coadyuva al desarrollo tecnológico
en temas relativos al L. vannamei; la promoción en el intercambio de información
científica y técnica con miras a favorecer la innovación y fomentar la sustentabilidad;
el establecimiento de un sistema de información electrónico de divulgación periódica,
el cual facilitó la transferencia de conocimientos; organización de actividades de
capacitación para beneficio del personal científico y técnico vinculado a las actividades
de investigación; la ayuda a la consolidación de grupos de investigación y desarrollo, lo
mismo que la interacción con los diferentes grupos, a través de redes o foros nacionales
para el análisis integral de la camaronicultura y, propiciar la movilidad de los científicos
y miembros del sector productivo, quienes participaron en las actividades que coordinó
la red.
Entre los temas de mayor énfasis durante el desarrollo de las actividades de la
red, están los relacionados con la genética, buenas prácticas de manejo y, patología e
inmunología de los camarones, resultados que se ven reflejados en la hoja electrónica de
la red: www.mida.gob.pa/CYTEDVANNAMEI.
Como última actividad de la red, estuvo la realización de un curso teórico-práctico
internacional sobre la patología e inmunología del camarón L. vannamei, donde
participaron científicos de reconocida trayectoria en estos campos. Como producto final
para el cierre de la red, los facilitadotes del curso acordaron contribuir con el desarrollo
de cada capítulo a ellos asignados para la publicación de esta guía, la cual servirá de
herramienta básica para estudiantes, empresas y entidades estatales que se dedican a la
camaronicultura. Este compromiso desinteresado de parte de cada uno de ellos, es uno
de los mejores aportes que quedará plasmado en las acciones que vienen desarrollándose
a través del CYTED y a quienes les agradecemos por haber depositado su confianza para
la coordinación de la RedVannamei. A los autores, amigos y compañeros les extendemos
un cordial agradecimiento por toda su colaboración.
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei

viii

ix
ÍNDICE DE CONTENIDO
Prólogo v
Introducción vii
Reseñas de los editores y autores xi
Capítulo 1 Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de
Cultivo (Jorge Cuéllar-Anjel)
1
1.1 Anamnesis 2
1.2 Examen clínico 2
1.3 Microscopía Directa 5
1.4 Montajes en Fresco (María Soledad Morales-Covarrubias) 8
1.5 Bacteriología 18
1.6 Histología 22
1.7 Pruebas con anticuerpos 29
1.8 Métodos moleculares 31
1.9 Parámetros inmunológicos 39
1.10 Microscopía electrónica de transmisión 45
1.11 Bioensayos 47
1.12 Referencias bibliográficas 52
Capítulo 2 Enfermedades Virales (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 55
2.1 Principales enfermedades y métodos de diagnóstico 58
2.2 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoiética infecciosa (Infectious
hypodermic and hematopietic necrosis virus, IHHNV)
62
2.3 Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (White spot syndrome virus,
WSSV)
70
2.4 Virus del Síndrome de Taura (Taura syndrome virus, TSV) 79
2.5 Virus del síndrome de la cabeza amarilla (Yellow head syndrome virus,
YHV)
87
2.6 Virus de la mionecrosis infecciosa (Infectious myonecrosis virus, IMNV) 92
2.7 Mionecrosis infecciosa viral (IMNV) y sus implicaciones en los
cultivos de camarones brasileños (Alitiene Moura Lemos Pereira,
Emiko Shinozaki Mendes, Tereza Cristina Vasconcelos Gesteira)
96
2.8 Penaeus vannamei nodavirus (PvNV) 104
Capítulo 3 Enfermedades Bacterianas (María Soledad Morales-Covarrubias) 117
3.1 Vibriosis sistémica 120
3.2 Erosión bacteriana del caparazón 122
3.3 Síndrome de Zoea II 124

x
3.4 Enfermedad de luminiscencia 126
3.5 (NHP-B) Necrosis del hepatopáncreas bacteriana 126
3.6 Bacterias filamentosas (Leucothrix mucor) 130
3.7 Spiroplasma penaei (Carlos R. Pantoja y Donald V. Lightner) 131
Capítulo 4 Enfermedades por Parásitos (Jorge Cuéllar-Anjel) 135
4.1 Gregarinas 137
4.2 Microsporidios 142
4.3 Haplosporidios 147
4.4 Epicomensales 148
4.5 Metazoarios 154
Capítulo 5 Enfermedades causadas por hongos (Carlos R. Pantoja y Donald Lightner) 159
5.1 Micosis 161
5.2 Fusariosis 164
Capítulo 6 Inmunología del Camarón (Margherita Anna Barracco, Luciane María
Perazzolo y Rafael Diego Rosa)
169
6.1 Sistema Inmune de los Crustáceos 172
6.2 Inmunoestimulantes 202
6.3 Parametros hemato-inmunológicos como indicadores de salud 204
6.4 Conclusiones y Perspectivas 209
Capítulo 7 Buenas Prácticas De Manejo En La Camaronicultura (Agnés Saborío Coze
y María José Almanza)
225
7.1 Código de Conducta para una camaronicultura responsable 229
7.2 Objetivos de un Código de conducta 229
7.3 Buenas Prácticas de Manejo 230
7.4 Características de las Buenas Prácticas de Manejo 230
7.5 Buenas Prácticas de Manejo en Laboratorios de larvas 231
7.6 Buenas Prácticas de Manejo en granjas camaroneras 231
7.7 Buenas Prácticas de Manejo en plantas procesadoras 241
Glosario 243

xi
RESEÑAS DE LOS EDITORES
VIELKA MORALES Q.
Coordinadora Red Vannamei-CYTED
vielkamorales2003@yahoo.com
Licenciada en Biología. Experiencia de 14 años en el tema de larvicultura, maduración,
zooplancton y fitoplancton en laboratorio de camarones. Responsable del diseño y construcción
de la Estación de Maricultura del Pacífico, PuertoVacamonte en Panamá. Desde 1996 coordinadora
técnica de la Organización del Sector Pesquero y Acuícola de Centroamérica. Consultora
para FAO y PRADEPESCA-UE. Cuenta con 19 publicaciones (11 en temas de camarones). Ha
participado en otras redes del CYTED relacionada a camarones y moluscos.
JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Director del Departamento de Patología e Investigación
Camaronera de Coclé S.A. (CAMACO)
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
Médico Veterinario, Máster en Microbiología. Experiencia de 18 años en las áreas de cultivo
de camarón marino Litopenaeus vannamei; diseño y montaje de laboratorios de patología de
camarones (microbiología, histopatología y biología molecular); docencia universitaria en
pregrados y postgrados así como investigación aplicada en Producción, Patología, Inmunología
y Nutrición de camarones penaeidos; manejo sanitario de cultivos de camarón (larvicultura,
engorde y maduración) mediante clínica y pruebas de campo y de laboratorio (montajes en fresco,
microbiología, histopatología y biología molecular); conferencista en Congresos Internacionales;
miembro del Grupo Ad hoc de la OIE en crustáceos para las Américas. Ha tenido desempeño
laboral en Ecuador, Colombia y Panamá.
RESEÑA DE LOS AUTORES
MARÍA SOLEDAD MORALES COVARRUBIAS
Centro de Investigaciones en Alimentación y Desarrollo, A.C.
Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental
México,
marisol@ciad.mx
Maestría y Doctorado en Patología de crustáceos, Licenciatura en Biología Pesquera
Investigadora en el área de acuicultura y manejo ambiental del CIAD. Sus principales trabajos
de investigación están enfocados a histopatología, virología y fisiología de crustáceos; imparte
cursos en sanidad acuícola y colabora en un programa de transferencia tecnológica, capacitación
y consultoría en histopatología de crustáceos, con diferentes países de América Latina.
JORGE CUÉLLAR-ANJEL
Aguadulce, Coclé, República de Panamá
jocuan@usa.net
La reseña de este autor ha sido citada previamente en “Reseña de los Editores”

xii
AGNÉS SABORIO COZE
Universidad Centroamericana (UCA)
Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos
Managua, Nicaragua.
cideauca@gmail.com
Maestría en Acuicultura, Licenciatura en Ecología y Recursos Naturales. Certificadora de
la Global Alliance Aquaculture para plantas de proceso, granjas de acuicultura y laboratorios.
Cultivos marinos y de agua dulce, Nutrición de peces, calidad de agua. Planificación y desarrollo
de áreas costeras. Investigación de tensiones ambientales en cuencas hidrográficas. Investigadora
en temas relacionados a la zonas costeras. Elaboración y gestión de proyectos acuícolas.
Asistencia Técnica, capacitación y extensión a comunidades costeras. Docente universitaria.
Consultora. Relaciones de trabajo con cooperantes de USA, JICA, UE, Universidades y Centros
de Investigación como Universidad de Rhode Island, Universidad de Florida, Universidad de
Hawai, Universidad de Puerto Rico entre otras, Organizaciones sin fines de lucro Internacionales
como ACRA, GVC, OIKOS entre otras, las Naciones Unidas (FAO) y el Banco de Desarrollo
Interamericano. Coordinadora de Redes Internacionales. Directora de Acuicultura. Directora de
Centro de Investigación.
MARÍA JOSÉ ALMANZA ABUD
Centro de Investigación de Ecosistemas Acuáticos
Universidad Centroamericana (UCA)
Managua, Nicaragua
almanzaabud@gmail.com
Máster en Ciencias Ambientales, Licenciada en Ecología y Recursos Naturales, curso de
Postgrado en Sistema de Información Geográfica aplicada a los Recursos Naturales. Coordinador
técnico del Proyecto SUCCESS, financiado por USAID a través del Centro de Recursos Costeros
de la Universidad Rhode Island y Centro de Recursos Costeros y Acuacultura del Pacífico de
la Universidad Hawai Hilo. Responsable del área de Físico-química de agua del Laboratorio
CIDEA. Coordinador del área de Sistema de Información Geográfica. Coordinador del área de
divulgación y Coordinador de Investigaciones del CIDEA.
CARLOS PANTOJA
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
cpantoja@u.arizona.edu
Ingeniero Bioquímico en Explotación de Recursos Acuáticos (Tec de Monterrey, Campus
Guaymas, México). Maestría en Acuacultura (Tec de Monterrey, Campus Guaymas, México).
Doctorado en Patobiología (The University of Arizona). Actualmente es profesor investigador
asociado en el laboratorio de patología acuícola de la Universidad de Arizona. Principales
áreas de trabajo son patología morfológica, caracterización de nuevas enfermedades y agentes
infecciosos de camarones peneidos, desarrollo de métodos de detección de agentes infecciosos y
diagnóstico de enfermedades. Provee servicios de consultoría a la industria camaronícola en el
área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de enfermedades a través
de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.

xiii
DONALD V. LIGHTNER
Departamento de Ciencias Veterinarias y Microbiología
Universidad de Arizona
Tucson, Estados Unidos
dvl@u.arizona.edu
PhD en Patología y Biología Pesquera, Maestría en Biología Pesquera y su Licenciatura en
Biología Pesquera. Su experiencia está dirigida a la patología y enfermedades de los cultivos
de crustáceos y peces, enfermedades de invertebrados, marinos y de agua dulce, enfermedades
infecciosas, virología, histología, microscopio electrónico, desarrollo de métodos de diagnósticos,
nutrición de animales acuáticos y toxicología acuática. Provee servicios de consultoría a la industria
camaronicola en el área de patología y da entrenamiento técnico en el área de diagnóstico de
enfermedades a través de talleres en la Universidad de Arizona o en el extranjero.
MARGHERITA ANNA BARRACCO
Universidad Federal de Santa Catarina (UFSC),
Departamento de Biología Celular, Embriología y Genética (BEG),
Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA),
Florianópolis, SC, Brasil
barracco@mbox1.ufsc.br
Doctorado en Inmunologia de Invertebrados y Licenciatura en Ciencias Biológicas. Profesora
Titular de Biología Celular, con participación en los programas de Postgrado en Acuicultura y
Biotecnología. Investigadora en el área de inmunología de crustáceos y moluscos de interés para
la acuicultura, con implicaciones en la sanidad y en el monitoreo ambiental. Sus principales
trabajos de investigación están enfocados en el estudio de la respuesta inmunológica a infecciones,
el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos para el monitoreo de condiciones de salud y
el efecto de sustancias inmunoestimulantes en invertebrados acuáticos, con énfasis en camarones
y bivalvos marinos.
LUCIANE MARÍA PERAZZOLO
Laboratorio de Inmunología Aplicada à la Acuicultura (LIAA),
luciane@ccb.ufsc.br
Maestría en Inmulogía de Crustáceos y Doctorado en Vitelogénesis de Peces. Profesora
Asociada de Biología Celular, con participación en el programa de Postgrado en Acuicultura.
Investigadora en el área de inmunologia de crustáceos de interés para la acuicultura, con
implicaciones en la sanidad. Sus principales trabajos de investigación están enfocados en el
estudio de la respuesta inmunológica a las infecciones, caracterización bioquímica y molecular de
proteínas inmunes efectoras y/o reguladoras, el desarrollo de parámetros hemato-inmunológicos
para el monitoreo de las condiciones de salud y el efecto de sustancias inmunoestimulantes en
camarones.

xiv
RAFAEL DIEGO ROSA
Laboratorio de Inmunología Aplicada a la Acuicultura (LIAA),
rddr@gmail.com
Maestría en Biotecnología aplicada a la acuicultura y Licenciatura en Ciencias Biológicas.
Sus principales trabajos de investigación están enfocados en la inmunología de crustáceos y
moluscos bivalvos, en especial en los péptidos antimicrobianos producidos por estos animales.
ALITIENE MOURA LEMOS PEREIRA
Embrapa Meio-Norte,
Parnaíba, PI, Brasil,
alitiene@cpamn.embrapa.br
Tecnóloga en Acuicultura, con Maestría y Doctorado en Acuicultura. Investigadora de
la Empresa Brasileña de Investigación Agropecuaria (Embrapa). Coordinadora del Núcleo de
Investigación en Pesca y Acuicultura da Embrapa Meio-Norte. Responsable por el Laboratorio
de Patología de Organismos Acuáticos (LAPOAq). Participa de La Red de Investigación en
Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades. Responsable por proyectos en
patología, diagnóstico y monitoreo sanitario de camarones cultivados.
EMIKO SHINOZAKI MENDES
Universidade Fed. Rural de Pernambuco,
Recife, PE, Brasil
esmendes@dmv.ufrpe.br
Médica Veterinaria, con Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, Doctorado en
enfermedades tropicales. Profesor Asociado del Departamento de Medicina Veterinária, y en
los programas de pós-grado en Veterinária y de los Recursos Pesqueros y Acuicultura, ambos
de la Universidad Federal Rural de Pernambuco. Responsable por el Laboratorio de la Salud
de los Animales Acuáticos (LASAq) y Coordinadora actual de la Red de la Investigación en
Camaronicultura del Nordeste (RECARCINE), grupo enfermedades, actuando principalmente en
el área de la microbiología.
TEREZA CRISTINA VASCONCELOS GESTEIRA
Universidade Fed. do Ceará,
LABOMAR, CE, Brasil
cgesteira@labomar.ufc.br
Bióloga con maestría en Zoología por la Universidad Federal de Rio de Janeiro y PhD
en Biología por la Universidad de New Brunswick – Canadá. Trabaja en el área de histología
y en histopatología de camarones peneídos. Realiza investigaciones en el área de patologías
de crustáceos marinos. Es responsable por la cátedra de Patología de Organismos Marinos y
Estuarinos y directora de postgrado a nivel de maestría en el Curso de Ciencias Marinas Tropicales.
Es miembro activo de la World Aquaculture Society (WAS) del Consejo Regional de Biología y de
la Asociación Brasileña de Patología de Organismos Acuáticos (ABRAPOA).Participa de la “Red
de Camarones Marinos del Nordeste” – RECARCINE, subred Enfermedades.

Capítulo 1
Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en
Camarones Marinos de Cultivo

Capítulo 1
Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones
Marinos de Cultivo
Coclé, Panamá
Introducción
Con base en las principales técnicas utilizadas en la actualidad para determinar
enfermedades en camarones, la siguiente lista presenta los pasos básicos y métodos
que sirven como herramienta para realizar diagnósticos y detectar agentes etiológicos
en estos crustáceos de gran importancia comercial en la economía mundial. Aunque
algunos de estos procedimientos pueden ser realizados por los mismos productores en
los laboratorios de maduración y/o larvicultura o en las fincas camaroneras, la mayoría
deben ser hechos por profesionales en sanidad acuícola o por Médicos Veterinarios
especialistas. Se debe recordar siempre que el diagnóstico no consiste en una prueba de
laboratorio como tal, sino en la interpretación que hace el especialista con base en sus
conocimientos y en la información recopilada de las pruebas de campo y de laboratorio.
Las citas bibliográficas utilizadas para la preparación de una parte de este Capítulo, no
serán mencionadas a lo largo del texto para facilitar la lectura de los diferentes temas. A
cambio, serán incluidas al final del Capítulo en las “Referencias bibliográficas”.
Pasos para el diagnóstico:
• Anamnesis (información histórica del caso, datos relacionados con el evento)
• Examen clínico
• Microscopía (análisis con microscopio de luz directa, contraste de fase o campo
oscuro, con montajes en fresco de tejidos teñidos o sin coloraciones, barridos o
montajes en fresco de tiras fecales)
• Bacteriología (de tejidos de camarones o de sustratos relacionados como agua,
sedimento y otros organismos acuáticos)
• Histología de especímenes fijados
• Pruebas basadas en anticuerpos para la detección de patógenos utilizando
anticuerpos policlonales (PAbs por sus siglas en inglés) o anticuerpos monoclonales
(MAbs por sus siglas en inglés)
• Métodos moleculares
- Sondas de ADN en pruebas de hibridación dot blot directamente con muestras
frescas de tejido o con ADN extraído
- Sondas de ADN o de ARN en pruebas de hibridación in situ con cortes
histológicos de tejidos fijados

2
- PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real para pruebas directas con muestras de tejido
fresco o con ADN o ARN extraído
• Parámetros inmunológicos (hemogramas y medición de perfiles inmunes)
• Microscopía electrónica de barrido o de transmisión
• Bioensayos con portadores sospechosos o subclínicos, utilizando hospederos
altamente susceptibles (estadios del animal o especies) como indicadores de la
presencia del patógeno
1.1 Anamnesis
En la medida de lo posible, el técnico en sanidad responsable de realizar el
diagnóstico de una enfermedad en una población de camarones, debe incluir una visita
a la instalación afectada (maduración, larvicultura o finca de engorde).
Durante esta visita, el técnico debe recopilar la información histórica previa a
la aparición del brote de la enfermedad. Esto puede incluir cambios en parámetros
ambientales o fisicoquímicos, tránsito inusual de personas o equipos por las
instalaciones, presencia de animales foráneos al sistema como perros, aves, roedores o
vacas, alteraciones en el régimen y tipo/calidad del alimento suministrado, cambios en
los procedimientos o tipos de fertilizantes, uso de productos químicos o biológicos en
el cultivo afectado, existencia de brotes similares con anterioridad en dicha empresa o
en otras conocidas y, toda aquella información pasada o presente relacionada directa o
indirectamente con la población en cuestión.
Debe llevarse un registro de esta información obtenida en la empresa, para estudios
de correlación con los hallazgos obtenidos en el examen clínico y en las pruebas de
laboratorio complementarias que se harán luego de la visita de campo.
1.2 Examen clínico
Cuando se trate de un brote de una enfermedad, durante la visita a las instalaciones
deben evaluarse las unidades de producción (tanques o estanques) que presenten
problemas. Se deben realizar capturas de camarones in situ y hacer una revisión individual
de animales, para formarse una idea aproximada de la proporción del problema: qué
tanta población está afectada (prevalencia en %), grado de severidad de las afecciones
observadas en los organismos enfermos y qué tipo de enfermedad puede estar causando
el brote.
El examen clínico debe incluir un recorrido manual y visual muy cuidadoso de
los camarones que sean revisados, los cuales no deben ser capturados al azar, sino
seleccionados por presentar alguna manifestación de enfermedad. Con base en los
hallazgos de esta valoración clínica, es factible en algunos casos hacer un diagnóstico
presuntivo, el cual se debe confirmar con pruebas complementarias de laboratorio.
El número de animales que se debe tomar para realizar un estudio sobre la etiología
de enfermedades, está afectado por la habilidad de reconocer camarones enfermos
en exámenes generales, la naturaleza del problema presente y por la experiencia del
profesional especialista en sanidad acuícola. Cuando se eligen camarones que presenten
signos clínicos, 5 a 10 por población examinados individualmente, serán suficientes.
La captura o colección de camarones para realizar un examen que busca determinar
la presencia de enfermedad, debe realizarse procurando el mínimo de estrés durante la
manipulación de los animales.

Jorge Cuéllar-Anjel Métodos de Diagnóstico de Enfermedades en Camarones Marinos de Cultivo
3
Si el examen clínico debe ser realizado en un lugar diferente al de la captura y los
camarones deben ser transportados hacia otra parte, la movilización debe hacerse en
recipientes con agua del mismo estanque, limpia (sin lodo ni trozos de vegetales), con
adecuada aireación y teniendo una densidad baja (para evitar el estrés). Si los camarones
van a permanecer un período de tiempo en el recipiente antes de ser examinados, deben
tener buena aireación y, en lo posible, se debe bajar la temperatura a 25-27ºC mediante
la adición de bolsas con hielo (selladas).
En estudios de camarones presumiblemente enfermos, se deben seleccionar
animales moribundos, descoloridos, con comportamiento anormal o que presenten
otras anormalidades macroscópicas con las cuales se sospeche de una enfermedad. Las
principales observaciones que se deben realizar en camarones enfermos durante una
valoración clínica, son las siguientes:
• Color del animal
• Tamaño del cuerpo comparado con el resto de la población (“enanismo”)
• Expansión de cromatóforos
• Deformidades en rostro, abdomen o apéndices
• Flexión del músculo abdominal (calambre)
• Color de las branquias (amarillas, marrón o negras)
• Color de los apéndices (pereiópodos, pleópodos y urópodos)
• Color de las antenas
• Edema (presencia anormal de líquido) en apéndices u otras partes del cuerpo
• Transparencia de los músculos del abdomen y del cefalotórax
• Repleción intestinal (porcentaje del intestino que se encuentra lleno)
• Textura del exoesqueleto (duro o blando)
• Tono del músculo abdominal (firme o flácido)
• Presencia de moco sobre la cutícula (resbaloso o áspero al tacto)
• Manchas, laceraciones, heridas, zonas oscuras u opacas, astillas clavadas
• Color del esófago y estómago (anaranjado sugiere canibalismo o mortalidad)
En cuanto a manifestaciones de enfermedad en condiciones naturales en los tanques
o estanques, las siguientes son observaciones frecuentes en camarones enfermos:
• Nado errático
• Letargia y debilidad
• Pérdida del reflejo de huida (permiten ser capturados sin ejercer resistencia)
• Vulnerabilidad a predadores (aves)
• Nado superficial (“barbeo”)
• Susceptibilidad a la hipoxia
• Disminución en la alimentación
Cuando se realicen muestreos aleatorios intencionales para estimar la prevalencia
de una enfermedad en una población, los camarones deben ser tomados al azar (no
escogidos). El tamaño de la muestra para estudios de enfermedades en camarones,
será revisado en detalle más adelante (Capítulo 2 “Enfermedades virales”) por Carlos
Pantoja.

4
MÉTODO DE EXAMEN CLÍNICO
Figura 1.1 Captura de camarones en un estanque
de cultivo mediante el uso de una atarraya, para
ser sometidos a un examen clínico.
Figura 1.2 Muestra de camarones P. vannamei
sanos, enfermos y muertos observados en un
recipiente de fondo blanco, después de su
captura en un estanque de cultivo. Se observan
algunos camarones muertos sin apéndices
(pereiópodos o pleópodos), debido a que han
sido canibalizados por otros camarones.
Figura 1.3 Camarones P. vannamei que
están siendo observados luego de haber sido
capturados en un estanque de cultivo, durante
un procedimiento de examen clínico. En el
caso de estos 5 camarones, no se observan
manifestaciones clínicas de enfermedad.

5
1.3 Microscopía Directa (Análisis en fresco)
Esta técnica está basada en la observación bajo el microscopio de tejidos o
partes de camarones afectados, con el fin de establecer en la medida de lo posible, un
diagnóstico presuntivo. Las partes más comúnmente examinadas bajo el microscopio,
son: hepatopáncreas, branquias, contenido intestinal (heces), músculo esquelético y
contenido gástrico.
Para una evaluación sanitaria con microscopía directa, deben examinarse las
muestras lo más pronto posible después del muestreo y después de la preparación del
montaje en un portaobjetos. Se deben utilizar organismos vivos siempre que sea posible,
o usar muertos frescos que han sido mantenidos en frío (refrigerados o enhielados), o
especímenes fijados en formalina 10% tamponada, cuando no sea posible trabajar con
camarones vivos. Si se puede contar con un laboratorio de campo adecuado, debe usarse
para procesar y examinar las muestras lo más cerca del sitio de muestreo.
Una aplicación importante del método de microscopía, es el examen del contenido
gástrico en camarones. Para ello, deben ser sacrificados al menos 10 animales capturados
al azar en una población determinada (estanque o tanque). Se extrae cuidadosamente el
estómago luego de hacer una disección del mismo utilizando tijeras y pinzas pequeñas.
Se realiza una incisión por la línea media con las tijeras y se extrae el equivalente a una
gota de contenido gástrico. Se ubica sobre una lámina portaobjetos y se añade una gota
de solución salina. Se coloca luego una lámina cubreobjetos y se hace presión con la
pinza cuidadosamente, con el fin de separar los componentes gástricos.
Se observa luego la muestra bajo el microscopio utilizando los objetivos de 4X
y 10X, registrando la proporción estimada de alimento artificial (pellets), microalgas,
zooplancton, sedimento y otros componentes que se observen. Se promedian los
porcentajes estimados en los 10 camarones para cada una de estas observaciones y se
obtienen los valores para dicha población. Este método permite conocer factores que estén
afectando el crecimiento, así como realizar correctivos en la dieta de los animales.
Los detalles relacionados con la técnica de montajes en fresco, son estudiados más
adelante (en este mismo Capítulo) por María Soledad Morales (Montajes en Fresco).

6
MÉTODO DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)
Figura 1.4 Camarones P. vannamei bajo
observación durante un examen clínico. Nótese
la presencia de una zona oscura en la parte
media del cefalotórax y superior de las branquias
(flechas). La opacidad generalizada del músculo
abdominal puede deberse al tiempo que han
estado fuera del agua (estrés por hipoxia). No
se observan manifestaciones adicionales de
enfermedad.
Figura 1.5 Camarón juvenil P. vannamei en el
cual se está levantando la cutícula posterior
del cefalotórax, para extraer muestras del
hepatopáncreas, las branquias y heces del
intestino medio, a partir de las cuales se va a
preparar un montaje en fresco.
Figura 1.6 Preparación de un montaje en fresco
de un camarón P. vannamei en donde ya se
han colocado bajo el cubreobjetos muestras de
hepatopáncreas (izquierda) y branquias (centro).
Las heces están siendo extraídas del intestino
medio con la ayuda del borde de unas tijeras.

7
MÉTODOS DE MICROSCOPÍA
(Montajes en fresco)
Figura 1.7 Muestra de hepatopáncreas de un
camarón subadulto P. vannamei preparada
mediante un montaje en fresco. Se observa
gran cantidad de vacuolas lipídicas (reservas de
grasa) de colores amarillo y gris y con tamaños
variados (todas normales). En el centro hay un
proceso de melanización (color marrón) de un
túbulo del hepatopáncreas, el cual está rodeado
por varias capas de hemocitos (“halo” blanco
alrededor del túbulo melanizado) y presenta
una forma alargada siendo más ancho hacia la
izquierda. Sin tinción. Amplificación 100X.
Figura 1.8 Muestra de branquias de un juvenil
P. vannamei preparada mediante un montaje
en fresco. Se observan 2 lamelas branquiales
bifurcadas en su extremo (superior), las cuales
presentan melanización de origen tóxico. Sin
tinción. Amplificación 100X.
Figura 1.9 Montaje en fresco preparado a partir de
una muestra de heces de un camarón subadulto
P. vannamei. Se observan dos trofozoitos de
gregarina Nematopsis sp., uno de ellos con el
extremo posterior bifurcado. Estos protozoarios
están formados por 3 células (arriba) y por 2
células (centro), respectivamente. Se puede
diferenciar la célula anterior (protomerito) y
la célula posterior (deutomerito). Sin tinción.
Amplificación 200X.

8
MÉTODO DE MICROSCOPÍA DIRECTA
1.4 Montajes en fresco (María Soledad Morales-Covarrubias)
Introducción
El diagnóstico implica un entendimiento de la causa y, si es posible, un
conocimiento de los factores contribuyentes significativos que influyan en la aparición
de la enfermedad.
Con el diagnóstico aumenta la probabilidad de un control efectivo cuando se
determina la causa exacta y se relaciona con sus factores contribuyentes efectivos. Sin
embargo, debemos aceptar que el conocimiento de la salud y la enfermedad varía en
diferentes animales acuáticos, incluidos los camarones y que en las granjas camaroneras
y laboratorios aparecen nuevas enfermedades. Por tanto, en una situación particular, la
precisión esperada y la calidad de un diagnóstico pueden ser directamente afectadas por
el conocimiento disponible respecto a enfermedades de camarones, por el entrenamiento
y experiencia de la persona encargada de realizar el diagnóstico, así como por las
prácticas de manejo en los sistemas de cultivo.
Uno de los objetivos principales en el diagnóstico de una enfermedad de un animal
en producción, es la determinación de la causa (etiología). La identificación de los agentes
etiológicos de la enfermedad se realiza (o debería realizarse) mediante la aplicación de
métodos científicos de investigación. La observación de muestras de órganos y tejidos
de camarones (para buscar bacterias, hongos, protozoarios, metazoarios e inclusiones
de rickettsias y virus) a través de microscopía de luz e histopatología (respuesta del
hospedero-patología), son métodos comúnmente empleados para establecer los agentes
etiológicos, los cuales conllevan a determinar la causa de enfermedades en camarones.
Los agentes patógenos se encuentran en el ambiente en forma natural y el medio
acuático no es la excepción. Muchos de ellos son oportunistas; es decir que mientras
los camarones se encuentren sanos y las condiciones de los parámetros de cultivo no
se alteren, los patógenos no atacan. Este es un dato muy importante, pues el hecho de
tener patógenos presentes en una granja o laboratorio no significa precisamente que los
Figura 1.10. Montaje en fresco preparado a
partir de heces de una postlarva (pl-10) de P.
vannamei, en la que se observan trofozoitos de
la gregarina Paraophioidina sp. (probablemente
P. scolecoides). Cada trofozoito está compuesto
por una única célula con el núcleo visible. Este
parásito tiene la particularidad de formar grupos
en los cuales varios organismos se adhieren a
uno. Sin tinción. Amplificación: 100X. Foto:
Cuéllar-Anjel et al., 1998.

9
organismos se encuentren enfermos. La gravedad dependerá del nivel de incidencia, de
la prevalencia, tipo de patógeno, de su virulencia, de su patogenicidad, de la especie
cultivada, de la genética de la misma (ciclo cerrado o silvestres) y el nivel de estrés de los
camarones al momento de estar expuestos al patógeno.
El estrés es determinado por calidad del agua, tipo de alimentación, variación drástica
en los parámetros como oxígeno disuelto, temperatura, salinidad, pH, etc., así como por
las prácticas de manejo principalmente. El escenario anterior se complica con el traslado
de organismos vivos, que se realiza de manera frecuente entre zonas y aún entre países.
Esto ha propiciado la introducción y propagación de agentes patógenos exóticos a lugares
donde no existían y que en algunos casos se diseminan a las poblaciones silvestres.
Análisis en fresco
El análisis en fresco, es la técnica que se utiliza para monitorear el estado de salud de
los organismos y realizar diagnósticos presuntivos en laboratorio y campo. Consiste en la
disección del camarón en todos sus estadios, para observar las alteraciones y patógenos
que presenten sus órganos y tejidos. La capacitación para este tipo de análisis consta de
un corto entrenamiento básico que profesionales (biólogos, ingenieros en acuicultura,
médicos veterinarios etc.) pueden recibir en una granja o laboratorio.
Para realizar el diagnóstico del estado de salud de una población se requiere de la
selección y toma adecuada de la muestra, la cual es elegida de acuerdo al estado de salud
de los organismos o a la sospecha de alguna enfermedad. La intensidad del muestreo
(número de muestreos en el tiempo hasta la cosecha) dependerá de la necesidad de la
información, de la historia de la granja, del origen de los organismos y de la densidad de
organismos sembrados en el cultivo. Por lo tanto para una buena selección se tiene que
tomar en cuenta lo siguiente:
Muestreo aleatorio. Cuando solamente se quiere determinar el estado de salud o para
buscar la prevalencia de patógenos, se toman los organismos y estanques al azar, lo cual
debe realizarse de cuatro áreas diferentes del estanque (Figura 1.11).
El tamaño mínimo de muestra o submuestra debe garantizar un 95% de confianza
que de existir una infección, ésta se incluirá en la muestra y para la prevalencia su
muestreo dependerá de la prevalencia estimada del patógeno y del nivel de confianza
elegido (Tabla 1). Los camarones seleccionados se depositan en contenedores con
aireación, procurando crearles el menor estrés posible y se trasladan de inmediato al
laboratorio para su posterior análisis.
Muestreo no aleatorio. Muestra que contiene solamente organismos enfermos. Este tipo de
muestreo se realiza cuando se tiene la sospecha de la presencia en el estanque, de alguna
enfermedad o síndrome. Se seleccionan por lo menos 10 organismos que presenten
señales clínicas tales como: decoloración, melanización y necrosis en la cutícula, así
como anorexia (falta de apetito), letargia (reducción de la actividad normal), coloración
rojiza de los pleópodos y telson o cualquier otra alteración que se observe en ellos. Los
organismos con estas características generalmente se encuentran en la compuerta de
salida de los estanques (Figura 1.12).
Las muestras deben procesarse inmediatamente, de acuerdo al procedimiento o
procedimientosquesehayanelegidoparaladeteccióndelagentecausaldelaenfermedad.
Los organismos deben ser enviados vivos a los laboratorios de diagnóstico.

10
Tabla 1. Selección del tamaño de muestra y cálculo del porcentaje de prevalencia de un patógeno
en una población determinada (Tomada de Lightner, 1996 y modificada de Amos, 1985).
Tamaño de
la población
Tamaño de la muestra necesaria para obtener el porcentaje de prevalencia**
2% 5% 10% 20% 30% 40% 50%
50 50 35 20 10 7 5 2
100 75 45 23 11 9 7 6
250 110 50 25 10 9 8 7
500 130 55 26 10 9 8 7
1,000 140 55 27 10 9 9 8
1,500 140 55 27 10 9 9 8
2,000 145 60 27 10 9 9 8
4,000 145 60 27 10 9 9 8
10,000 145 60 27 10 9 9 8
>/= 10,000 150 60 30 10 9 9 8
* *Prevalencia= Número de individuos de una especie de hospedero infectada con una especie particular de parásito/número de
hospederos examinados (Margolis et al., 1982)
Figura 1.11. Estanque de cultivo de camarón
donde se observan las cuatro áreas diferentes
para la toma de organismos en muestreo al
azar.
Figura 1.12. Estanque de cultivo de camarón
donde se observa la compuerta de salida para la
toma de organismos en muestreo no aleatorio.

11
Para la realización del análisis en fresco, se requiere contar con espacio limpio en
donde se tenga el siguiente material:
Microscopio compuesto con objetivos de 4, 20, 40, 60 y 100 X
Portaobjetos
Cubreobjetos
Bisturí
Navajas de disección
Pinzas de disección
Tijeras finas de disección
Tabla de disección
Cajas de petri
Pizetas
Guantes
Agua de mar estéril o filtrada
Resina
Jeringas desechables de varias medidas (1 mL, 3 mL y 5 mL)
Hematoxilina
Eosina Y
Solución de Davidson (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido acético)
Solución de Davidson modificada (AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido clorhídrico)
Etanol absoluto
Etanol al 70%
Xileno
Contenedores para muestras
Hoja de reporte
Manuales
Desarrollo de la técnica:
Los organismos se miden y pesan para obtener el peso y tamaño promedio.
• Se analiza tanto la superficie del organismo para detectar deformaciones en el rostro
y en el sexto segmento abdominal, como cutícula delgada (o suave), epicomensales,
decoloración, coloración rojiza, melanización, ampollas y necrosis de cutícula
(Figura 1.13); pleópodos, pereiópodos y antenas.
• Se selecciona una pequeña porción de cada tejido u órgano (Figura 1.14). Las
porcionessecolocanindividualmenteenportaobjetoslimpios(nomezclarporciones),
se les adiciona unas gotas de agua de mar estéril y se pone el cubreobjetos; debe
procurarse que en la muestra no se formen burbujas que puedan interferir (para ello
hay que realizar una leve presión sobre el cubreobjetos con la pinza de disección).
Las muestras que se tomarán son:
Branquias: con las tijeras finas se elimina el exoesqueleto que cubre las branquias.
Se toma una pequeña porción y se coloca en el portaobjetos para buscar: cambios
en la coloración de los filamentos branquiales (como melanización, necrosis, áreas
blanquecinas bien definidas), presencia de protozoarios (Zoothamnium sp (Figura 1.15),
Epistylis sp, Acineta, Ascophris, Bodo sp), bacterias filamentosas (Leucothrix mucor y
Flexibacter sp), detritus del fondo de los estanques, restos de microalgas, hongos,
bacterias, melanizaciones y deformaciones. Para detectar cuerpos de inclusión viral en
las branquias por improntas, es necesario fijarlas en solución de Davidson modificada
(AFA, Alcohol-Formaldehído-Ácido clorhídrico), si van a ser procesadas de manera

12
inmediata; si este no es el caso, pueden fijarse en la solución de Davidson (AFA, Alcohol-
Formaldehído-Ácido acético), que se utiliza para fijar organismos para histología.
Hepatopáncreas: se elimina todo el exoesqueleto del cefalotórax para descubrir el
hepatopáncreas (Figura 1.16) y el estómago. Se observa la coloración, el tamaño
del hepatopáncreas para decidir si hay atrofia (reducción de tamaño) o hipertrofia
(aumento de tamaño) del órgano. Con unas pinzas, se retira la membrana que cubre
Figura 1.14. Pequeña porción de hepatopáncreas
lista para ser analizada.
Figura 1.13. Camarón con melanización multifocal.
Figura 1.15 Muestra de branquias donde
se aprecian las formas bien definidas de
Zoothamnium sp.

13
el hepatopáncreas y con un bisturí se parte por la mitad para observar la coloración
del fluido, textura, melanización y necrosis tubular. Se toma una pequeña muestra y
se coloca en un portaobjetos para buscar: Baculovirus penaei, Monodon baculovirus,
gregarinas (trofozoitos y sicigias), bacterias, deformación tubular, nódulos hemocíticos,
melanización y necrosis de los túbulos (Figura 1.17).
También debe observarse la cantidad de lípidos presentes, desprendimiento de
células del epitelio de los túbulos del hepatopáncreas y acumulación dentro de vacuolas
citoplasmáticas de los hepatocitos de una sustancia de color verde oscuro “bolitas
negras”. Para la realización de improntas e histología, es necesario fijar los órganos y/o
tejidos del organismo seleccionado en el fijador adecuado para el diagnóstico elegido.
Intestino: el abdomen, se separa del cefalotórax, del telson y de los urópodos para
facilitar la extracción del intestino. Por la parte posterior se localiza el intestino (que
puede o no contener hilo fecal); con ayuda de una pinza fina, se extrae con cuidado y se
coloca en el portaobjetos, procurando extenderlo. Luego se vierten unas gotas de agua
de mar y se presiona ligeramente al depositar el cubreobjetos (Figura 1.18). Al observar
la muestra en el microscopio, se buscarán: gregarinas con sus diferentes estadios (Figura
1.19), distribución y porcentaje de adherencia en el intestino, inflamación, nemátodos,
cuerpos de oclusión de Baculovirus penaei y Monodon baculovirus.
Músculo y gónadas: se toma una pequeña muestra de músculo y de las gónadas
(especialmente, aquel tejido que muestre opacidad de tipo lechoso). Se coloca en un
portaobjetos y se presiona para facilitar la búsqueda de microsporidios (Figura 1.20), si
estos órganos y tejidos fueron parasitados se deben observar masas de esporas de tamaño
y forma uniformes.
Las muestras ya preparadas se analizan en el microscopio, iniciando con el objetivo
de menor aumento y finalizando con el de mayor. Debido a su rápida descomposición, la
primera muestra que se analiza es la del hepatopáncreas; después se estudia la muestra
de branquias, posteriormente el intestino y por último la muestra de músculo y gónadas.
En la hoja de reporte (Tabla 2), se anota todo lo que se observa con cada objetivo. Luego
se calcula el porcentaje de prevalencia y se determina el grado de severidad (Tablas
3, 4, 5 y 6) que presenten los organismos de la muestra analizada. Se finaliza con el
diagnóstico y el reporte final.
Figura 1.16. Organismo con hepatopán-
creas expuesto para tomar pequeña porción
para su análisis.

14
Figura 1.19. Muestra en fresco de intestino medio, donde
se aprecian las sicigias de gregarinas de 2, 3, y 4 divisiones
adheridas al epitelio y en el lumen del intestino.
Figura 1.20. Muestra en fresco de músculo donde se
observan las cápsulas de Ameson nelsoni.
Figura 1.17. Muestra en fresco de hepatopáncreas con
melanización y necrosis de las células y de los túbulos.
Figura 1.18. Muestra en fresco de intestino.

15
Tabla 2. Formato de reporte para el análisis en fresco.
No_________________________ Fecha._____________________________________________
Procedecia._ ____________________________________________________________________
Especie.________________________________________________________________________
Estanque No. _______________ Tamaño de la muestra._______________________________
No. de muertos.______________ No. de examinados._________________________________
Estado de vida.______________ Peso promedio.___________ Tamaño promedio._________
CARACTERÍSTICAS EXTERNAS OBSERVACIONES
CARACTERÍSTICAS
INTERNAS
OBSERVACIONES
Actividad de los camarones HEPATOPÁNCREAS
Contenido del intestino Atrofia
Presencia de heces en forma de
cadena o discontinua
coloración
Presencia de epibiontes, bacte-
rias y hongos en el camarón
Presencia de los virus: BP
y MBV.
Deformidades en el rostrum,
antenas abdomen, telson,
urópodos y pleópodos
Deformación de los túbulos
Apéndices rotos Color del fluido.
Melanización (color café claro)
Presencia de gregarinas en
todos sus estadíos
Coloración anormal Túbulos melanizados
Características de la cutícula
Presencia de masa de bac-
terias y cantidad de lípidos
BRANQUIAS INTESTINO
Coloración
Presencia de gregarinas en
todos sus estadíos.
Presencia de epibiontes
Masas melanizadas de
hemocitos
Nódulos de bacterias en las
lámelas branquiales
Cuerpos de oclusión de BP
Micosis (hifas, conidios) MÚSCULO
Cuerpos de inclusión de WSSV Textura
Materia orgánica Color
Presencia de melanización y
necrosis
Microsporidios
Síndrome del
encalambramiento

16
Tabla 3. Guía general para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad
a la infección, infestación y síndrome (Lightner, 1996).
GRADO DE SEVERIDAD SIGNOS CLÍNICOS
0
No presentan signos de infección por el agente patógeno, parásito
o epicomensal. No presentan lesiones características de sín-
dromes.
1
Presencia muy baja del patógeno, parásito o epicomensal. En
aquellos donde se tiene un número estándar permitido, éste se
encuentra justo arriba del límite normal. Se observan muy pocas
lesiones características del síndrome.
2
Se observa la presencia baja y moderada del patógeno, parásito o
epicomensal. Se observan lesiones ligeras o moderadas, car-
acterísticas del síndrome. Incremento en la mortalidad si no se
aplica tratamiento (cuando existe tratamiento).
3
Se observa la presencia moderada del patógeno, parásito o epico-
mensal. Se observan lesiones moderadas a severas, características
del síndrome. Potencialmente letal si no se aplica tratamiento
(cuando existe tratamiento).
4
Se observa gran cantidad del patógeno, parásito o epicomensal.
Se observan severas lesiones características del síndrome. Muy
letal con altas mortalidades.
Tabla 4. Guía para dar un valor numérico cualitativo de grado de severidad a la
deformación tubular en hepatopáncreas con análisis en fresco (Morales-Covarrubias,
2004).
0
No presentan signos de deformación tubular (0). No presentan
lesiones características de síndromes.
1
Presencia muy baja de deformación tubular (1-5/campo/organ-
ismo). Se observan muy poco desprendimiento celular.
2
Se observa la presencia moderada de deformación tubular (6-10/
campo/organismo). Presencia de hemocitos y formación de nódu-
los hemocíticos. Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.
3
Se observa la presencia alta de deformación tubular (11-20/
campo/organismo). Se observan lesiones moderadas a severas,
como melanización, desprendimiento celular, atrofia tubular y
formación de nódulos hemocíticos. Potencialmente letal si no se
aplica tratamiento.
4
Se observa gran cantidad de túbulos deformes (mas de 20/campo/
organismo). Se observan severas lesiones como melanización,
necrosis, atrofia tubular, túbulos vacíos, formación de nódulos
hemolíticos y presencia de granulomas. Muy letal con altas mor-
talidades.

17
infestación por gregarinas utilizando análisis en fresco.
0
No presentan signos de infección por el parásito (0). No presen-
tan lesiones causadas por el parasitismo.
1
Presencia muy baja del parásito (1-15/intestino/organismo). Se
observan muy pocas lesiones causadas por el parasitismo como
infiltración hemocítica.
2
Se observa la presencia moderada del parásito (16-50/intestino/or-
ganismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas por
el parasitismo como infiltración hemocítica y formación de nódu-
los hemocítico Se observa mortalidad si no se aplica tratamiento.
3
Se observa la presencia alta del parásito (51-100/intestino/organ-
ismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por
el parasitismo, como infiltración hemocítica y áreas multifocales
mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencial-
mente letal si no se aplica tratamiento.
4
Se observa gran cantidad del parásito (mas de 100/intestino/organ-
ismo). Se observan severas lesiones causadas por el parasitismo
como infiltración hemocítica, melanización multifocal y necrosis.
Muy letal con altas mortalidades.
infestación por epicomensales en lamelas branquiales.
0
No presentan signos de infección por protozoario (0). No presen-
tan lesiones causadas por epicomensales.
1
Presencia muy baja de protozoarios (1-5/lámela/organismo). Se
observan muy pocas lesiones causadas por los epicomensales,
como infiltración hemocítica.
2
Se observa la presencia moderada de protozoarios (6-10/lámela/
organismo). Se observa un incremento en las lesiones causadas
por los epicomensales, como infiltración hemocítica y formación
de n’odulos hemocíticos. Se observa mortalidad si no se toman las
medidas de corrección.
3
Se observa la presencia alta de protozoarios (10-20/lámela/organ-
ismo). Se observan lesiones moderadas a severas causadas por los
epicomensales, como infiltración hemocítica y áreas multifocales
mecanizadas y formación de nódulos hemocíticos. Potencial-
mente letal si no se toman medidas de corrección
4
Se observa gran cantidad del parásito (mas de 20). Se observan
severas lesiones causadas por los epicomensales, como infil-
tración hemocítica, melanización multifocal y necrosis. Muy letal
con altas mortalidades.

18
1.5 Bacteriología
Objetivo. El objetivo de la bacteriología en camarones, es cuantificar la cantidad y el
tipo de las bacterias presentes en la hemolinfa, otros tejidos o larvas y postlarvas, así
como en agua para / de cultivo.
Descripción. La bacteriología es un conjunto de métodos que se utiliza como apoyo en
el diagnóstico de enfermedades en camarones, cuando se sospecha que la causa de la
enfermedad está relacionada con presencia de bacterias patógenas en el agua de cultivo
o dentro del organismo de los animales. Consiste en la siembra de muestras en diferentes
medios de cultivo, para determinar si hay crecimiento o no de bacterias potencialmente
patógenas.
Metodología. Después de definir qué poblaciones afectadas se van a examinar, se debe
determinar el tipo de muestreo con base en el objetivo del estudio. El tamaño de muestra
dependerá de si la captura es aleatoria o, de si se escogen sólo animales enfermos para
la evaluación (ver el Capítulo 2 “Enfermedades virales” para más detalles sobre técnicas
de muestreo). Los camarones que se van a someter a pruebas de bacteriología, deben
estar siempre vivos; no debe realizarse ninguna prueba bacteriológica con camarones
muertos, debido a que los resultados estarán sesgados por los cambios autolíticos (post-
mortem), con los cuales se alteran las poblaciones bacterianas presentes en los tejidos,
así como su crecimiento.
Antes de iniciar cualquier procedimiento bacteriológico, se deben tener previamente
esterilizados todos estos elementos. El material de vidrio se envuelve en papel kraft y se
esteriliza por la técnica de calor seco mediante un horno a una temperatura de 180oC
durante un lapso de dos horas. El agua destilada y los medios líquidos de cultivo como
el agua peptonada deben ser esterilizados por vapor húmedo mediante un autoclave a
15 libras de presión (121°C) durante quince minutos. Las asas de platino se esterilizan
directamente por calor seco mediante la llama del mechero. El momento en el cual el
asa se encuentra estéril sucede cuando ésta se torna de un color rojo incandescente. El
colador con ojo de malla fino se debe desinfectar dejándolo inmerso en una solución de
hipoclorito de sodio concentrado por 5 minutos. Posteriormente se lava con agua estéril
hasta que desaparezca el olor producido por el hipoclorito.
La toma de muestra para análisis bacteriológico tanto de agua de transporte de
nauplios como de los mismos nauplios, se debe realizar, si es posible, en el momento
de recibir los animales y directamente en las bolsas o cajas de transporte. La toma de
muestra de agua en tanques de larvicultura, se debe realizar al menos en 2 puntos: la
entrada del tanque y en el centro del mismo.
En el caso de larvas o postlarvas, se debe tomar una cantidad conocida o estimada
(lo más confiable posible) de animales, con el fin de emitir los resultados en función de
unidades formadoras de colonia (UFC) por animal o por gramo de larvas¬/postlarvas.
La muestra debe ser lavada con agua de mar estéril utilizando una malla fina o un
colador pequeño de cocina, previamente desinfectado con yodo, formalina o etanol
70%. Las muestras deben ser luego maceradas en un recipiente esterilizado y agregando
una cantidad conocida (en mL) de agua de mar estéril o solución salina estéril para la
dilución del macerado.
En el caso de camarones juveniles, subadultos o reproductores, se recomienda
desinfectar el área de punción (seno cardíaco –dorsal– o seno hemolinfático –ventral–)
con trozos de algodón impregnado con etanol 70%. Con una aguja de insulina (1 mL)
nueva y estéril que tenga aguja hipodérmica (muy delgada), se extraen al menos 100 μL

19
de hemolinfa. Es importante que si las posibilidades del laboratorio lo permiten, se utilice
algún anticoagulante (ej.: citrato de sodio 10% en relación 1:1), cuyo volumen dentro
de la jeringa se debe considerar antes de emitir los resultados de los conteos bacterianos
en UFC.
Tanto en el caso de macerado de larvas/postlarvas, hemolinfa de camarones mayores
(anticoagulada o no) o agua de cuerpos de agua en estudio, se deben sembrar 100
μL en un medio sólido para el aislamiento de bacterias (cultivo primario). Esta siembra
puede hacerse en agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sal sacarosa), el cual es un medio
selectivo principalmente para bacterias marinas de la familia Vibrionaceae (género
Vibrio), aunque también crecen especies bacterianas de los géneros Pseudomonas,
Plesiomonas, Aeromonas, Flavobacterium y enterobacterias, entre otras. Para cultivos
primarios existen medios no selectivos en los cuales crecen “bacterias totales” (la mayor
parte de las bacterias presentes en agua o en los camarones), tales como TSA (agar
tripticasa soya) y Agar Marino.
Una vez se inoculan los 100 μL de muestra sobre el agar elegido y en condiciones
asépticas (ambiente estéril con mecheros y/o en una cámara de flujo laminar), se
extiende circularmente mediante el uso de un asa de Drigalski (varilla de vidrio tipo
“stick de hockey”). De esta manera, se obtiene una distribución homogénea del inóculo.
Seguidamente se invierte la caja de Petri y se incuba de esta manera a una temperatura
de 30oC por 24-48 horas. Para determinar la morfología de las bacterias que han crecido,
se realiza un extendido de una colonia representativa sobre una lámina portaobjetos,
habiéndola diluido antes en solución salina estéril hasta obtener un grado de 0.5 en la
escala de McFarland. Luego se deja secar y se colorea con tinción de Gram. Las bacterias
del género Vibrio se observarán como bacilos Gram negativos bipolares.
En caso de que haya crecimiento de bacterias, se deben contar las colonias para lo
cual existen métodos de observación directa (a trasluz) o utilizando un equipo especial
para conteo de colonias. Los valores se dan en UFC; en el caso de larvas o postlarvas
será UFC/g o por cada “X” número de animales. En el caso de hemolinfa o de agua, el
resultado se da en UFC/mL.
Si las bacterias aisladas sugieren ser la causa de una enfermedad en los camarones
(bacteriosis), se realizan pruebas de sensibilidad a antibióticos (antibiogramas), para
establecer qué productos antibacterianos comerciales son capaces de eliminar dichas
bacterias aisladas. Una vez determinado el antibiótico más efectivo, se puede realizar
una prueba para medir la concentración mínima inhibitoria (MIC) de dicho antibiótico,
capaz de matar la mayor parte de las bacterias. El resultado del MIC será utilizado como
referencia para la medicación de la población afectada de camarones.

20
MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA
Figura 1.21 Cabina de flujo laminar,
utilizada durante la siembra de mues-
tras de camarones, agua o sedimento
en medios de cultivo, para evitar la
contaminación con bacterias presentes
en el ambiente. En su parte superior, la
cabina posee un sistema que filtra el
aire que ingresa al área de trabajo. Es-
tos equipos están dotados con entradas
de agua, gas y sistemas de vacío, así
como luz blanca y luz ultravioleta.
Figura 1.22 Autoclave horizontal
utilizado para esterilizar elementos,
materiales y reactivos que se utilizan
en bacteriología. Funciona con alta
presión producida por vapor de agua,
lo que eleva la temperatura a 121ºC, a
la cual se exponen los materiales por
15 minutos.

21
MÉTODO DE BACTERIOLOGÍA
Figura 1.23 Siembra (inoculación) de hemolinfa
anticoagulada de un camarón P. vannamei en
agar TCBS. Se está utilizando un mechero de
alcohol cerca del medio de cultivo, para procurar
tener un ambiente estéril alrededor de la zona
de siembra. El inóculo de 100 μL aplicado con
una micropipeta graduada volumétricamente,
será esparcido por todo el medio utilizando una
barra metálica especial para tal fin.
Figura 1.24 Plato Petri con agar TCBS en
el cual se observa crecimiento de bacterias
Sucrosa positiva (colonias amarillas). La
muestra pertenece a hemolinfa de un camarón
P. vannamei y fue incubada durante 24 horas a
30ºC. El amarillo del medio (y no verde que es
el original del agar TCBS) se debe al cambio de
pH producido por el uso de la Sucrosa por parte
de las bacterias predominantes.
Figura 1.25 Contador de colonias con pantalla
digital, utilizado para la cuantificación de las
colonias en los platos Petri donde se presentan
crecimientos bacterianos. Cada colonia procede
de una bacteria, la cual constituye una unidad
formadora de colonia (UFC).

22
1.6 Histología
Objetivo. La histología es la rama del saber científico que se ocupa del estudio de
los rasgos morfológicos de los tejidos, por medio de instrumentos amplificantes. La
histopatología es entonces la ciencia que estudia las modificaciones patológicas de las
células y tejidos. En camarones, es una herramienta de diagnóstico que permite identificar
cambios a nivel celular en cortes de tejidos que han sido sometidos a procesos físicos
y tinciones rutinarias o especiales. Esta técnica permite detectar factores de mortalidad,
bajo crecimiento, alteraciones de comportamiento y otros aspectos durante el cultivo
en laboratorios de larvicultura, fincas de engorde e instalaciones de maduración de
reproductores.
Descripción. La histopatología permite identificar en la mayoría de los casos, la etiología
de la enfermedad de la población de camarones bajo estudio; se logra generalmente
hacer el diagnóstico de todas las enfermedades virales reportadas en camarones (por
ejemplo las causadas por IHHNV, TSV, WSSV, HPV, YHV, BP, IMNV y PvNV), necrosis
hepatopancreática (NHP), bacteriosis crónicas, gregarinas, protozoarios epicomensales,
nemátodos, enteritis hemocítica y necrosis muscular idiopática, entre otras enfermedades.
Para esto, se requiere que las láminas histológicas sean perfectamente preparadas y
examinadas bajo el microscopio por el ojo de un patólogo entrenado.
La autolisis es un proceso post-mortem que se presenta en los crustáceos
extremadamente rápido y que consiste en la ruptura celular, salida de enzimas y
componentes celulares, pérdida de la arquitectura de los tejidos y destrucción de los
órganos. Por esta razón, los camarones deben morir por efecto de la inyección del fijador
y por la inmersión en el mismo, el cual debe ofrecer una rápida penetración en los
tejidos. El hepatopáncreas es el órgano más susceptible a la autolisis. Durante la fijación,
la solución debe penetrar el órgano rápidamente o los cambios post-mortem conducirán
a la pérdida de estructuras tisulares, eliminando zonas de tejido importantes para el
diagnóstico.
Si existe interés en estudiar problemas de morfología externa en camarones como
es el caso de deformidades en post-larvas o presencia de epibiontes (epicomensales)
adheridos a las branquias, también se obtienen buenos resultados si los animales son
fijados vivos por inmersión en una solución de formalina al 10%.
Metodología. El fijador de Davidson (Humason, 1979) es el más utilizado y sugerido
para los procedimientos de rutina, cuando se van a preparar muestras de camarones
para análisis histopatológico. Además de ofrecer buen nivel de detalle en el núcleo de
las células, el ácido acético del fijador descalcifica la cutícula, evitándose así pasos
adicionales de descalcificación del exoesqueleto durante el proceso histológico. La
preparación del fijador de Davidson debe realizarse con base en la siguiente fórmula:
Para 1 litro de fijador de Davidson:
Etanol 95%: 330 mL
Formaldehído 39%: 220 mL
Ácido acético glacial: 115 mL
Agua (corriente): 335 mL

23
Para la realización de un estudio histológico en camarones, se requiere de un
proceso sistemático que incluye fijación, deshidratación, inclusión en parafina, corte
de segmentos ultradelgados (3 micras de espesor) y tinción. Cada etapa de éstas tiene
sus propios pasos y tiempos cuya finalidad es preservar el tejido lo más intacto posible y
obtener láminas de óptima calidad, las cuales permitan nitidez óptica en la organización
celular de los tejidos, cuando sean estudiados bajo el microscopio.
Fijación. Corresponde a la preservación de los tejidos en las mismas condiciones
estructurales y morfológicas del momento de la muerte del camarón, lo cual como ya se
mencionó, debe ser a causa de la inyección del fijador (Davidson). Los camarones deben
ser fijados vivos o moribundos, nunca muertos. La fijación pretende desnaturalizar los
componentes proteicos de las células. Durante la fijación, se debe inyectar abundante
fijador de Davidson en el hepatopáncreas, resto del cefalotórax y en el músculo. Luego,
el camarón se debe sumergir en el mismo fijador en relación 1:10 (10 veces el volumen
del fijador respecto al de la muestra). En el caso de pls, se deben sumergir directamente en
el fijador. Camarones con más de 12 g se deben someter a un corte lateral y longitudinal
de la cutícula para facilitar el ingreso del fijador. El tiempo óptimo de fijación depende
del tamaño del camarón, requiriéndose 12-24 horas para postlarvas y juveniles, 48 horas
para pre-adultos y 72 horas para reproductores. Luego de estos tiempos, el fijador debe
ser sustituido completamente por etanol 70%, el cual deberá reemplazarse a los 15 días
si los camarones aún no han sido procesados.
Deshidratación e inclusión en parafina. Consiste en eliminar la mayor parte del agua
tisular y reemplazara con parafina líquida. Se realiza con un equipo automático y
programable llamado “procesador de tejidos”. Durante el proceso, los tejidos pasan por
12 recipientes estando 1 hora en cada uno, los cuales contienen etanol 70% (2), etanol
80% (2), etanol 95% (2), etanol 100% (2), aclarante (2) (Xilol o “Hemo-De”) y finalmente
parafina líquida a temperatura controlada (2).
Bloqueo.Terminadalainclusiónenparafina,lostejidossonubicadosenmoldes(metálicos
o plásticos) para formar un bloque el cual al enfriarse se solidifica, conteniendo el tejido
en su interior. En la actualidad, existen “unidades de bloqueo” que consisten en equipos
que manejan simultáneamente superficies con varias temperaturas diferentes, las cuales
permiten tener parafina líquida, superficies de trabajo calientes y planchas con escarcha
(hielo pulverizado) para el enfriamiento final de la parafina al terminar de hacerse el
bloque. Los moldes plásticos disponibles para bloqueo, permiten además servir como
base para el montaje de los tejidos en la unidad de corte (micrótomo).
Corte. Esta es la parte del proceso histológico en la cual se utiliza un equipo altamente
especializado llamado “micrótomo”, nombre dado debido a que permite realizar cortes
de tejido con un espesor de 1 a 15 micras. Luego de ajustar el grosor deseado en este
equipo, se realizan los cortes mediante giros de una manivela y cada vez que se le da
una vuelta, el bloque de parafina avanza la cantidad de micras programada, hacia una
cuchilla con un filo y calidad especial para histotecnia.
Recuperación del corte. Las tiras de parafina que contienen el tejido cortado, son
puestas sobre un equipo llamado “baño de recuperación de tejidos”, el cual contiene
agua moderadamente caliente con temperatura controlada (40-50ºC aprox.), la cual
puede contener una pequeña concentración de gelatina neutra. Las tiras se expanden
al entrar en contacto con el agua caliente y así se elige la que presente una estructura
más completa del tejido en cuestión. Separada de los segmentos no deseados mediante
el uso de un pincel delgado, la porción seleccionada es recuperada con una lámina

24
portaobjetos, en la cual quedará adherida de manera permanente y sobre la cual se hará
la tinción final.
Tinción. En camarones, el método de tinción más frecuente es el de Hematoxilina de
Mayer-Bennett y Floxina/Eosina (H&E). Esta tinción involucra las siguientes soluciones y
reactivos: Hemo De, etanol, agua destilada, hematoxilina, agua corriente, Floxina/Eosina
y medio de montaje. Una vez teñidas las láminas histológicas, se sellan utilizando una
gota de medio de montaje sobre el tejido y un cubreobjetos para proteger la muestra
permanentemente. Los tiempos para cada paso pueden ser consultados en Lightner,
1996.
Los colorantes (o tinciones) son sustancias químicas complejas, a menudo de
comportamiento variable. Pueden ser de uso general para teñir tanto núcleo como
citoplasma, o más específicos respecto a algún componente particular. Son sales neutras
con radicales tanto ácidos como básicos. El colorante es básico cuando la propiedad de
tinción está en el radical básico y las estructuras que tiñe se denominan Basófilas. Las
estructuras basófilas son químicamente ácidas; tal es el caso de los ácidos nucleicos del
núcleo (ADN) y los componentes ácidos del citoplasma (ARN). El colorante es ácido
cuando la propiedad de tinción está en el radical ácido de la sal neutra; tal es el caso
del citoplasma y en este caso las estructuras teñidas con colorante ácido son llamadas
Acidófilas.
La tinción H&E marca y define bien el núcleo, el citoplasma y la membrana celular
por afinidad de electrones, resultando en la coloración azul oscuro del núcleo y la pared
de las membranas por efecto de la hematoxilina y, el citoplasma de color rosado por
efecto de la eosina. Los tejidos se tiñen para aumentar el contraste natural y hacer más
evidentes los diversos componentes celulares, tisulares y material extrínseco. Además de
ver la célula individualmente, la tinción H&E permite observar en conjunto las células de
los órganos o tejidos, ofreciendo una buena diferenciación.
Existen otras tinciones especiales que resaltan ciertas partes de los tejidos u organelos
celulares, como el ácido periódico de Shiff (PAS) que resalta de rojo magenta el citoplasma
de las células que contienen carbohidratos (músculo). Para teñir hongos de negro, se
utiliza la tinción de Groccott ya que contienen sales de plata. Aunque las tinciones para
hongos suelen tener sales de plata, también se utilizan para detectar bacterias como
espiroquetas (Levaditi) y bacilos ácido-alcohol resistentes (Zihel-Neelsen). Otras tinciones
para camarones incluyen la de Gram (bacterias), Brown & Brenn (rickettsias), Steiner
& Steiner (espiroquetas y rickettsias), Giemsa (bacterias), Wright (rickettsias), Pinkerton
(rickettsias), Kinyoun (bacterias ácido-alcohol resistentes), McManus´PAS (glicógeno y
hongos), Feulgen (ADN) y Tricromo de Masson (contrastes especiales).
Montaje. El exceso de colorante después de la tinción se elimina con agua o alcohol y
se deshidrata el corte con alcoholes a concentraciones crecientes, pasando después de
alcohol absoluto a una solución de agente aclarante. Posteriormente, se coloca una gota
de bálsamo de Canadá (medio de montaje) y se cubre con el cubreobjetos dejándose
secar. El corte obtenido, generalmente de no más de 3 micras de espesor, estará listo para
ser observado a través de un microscopio óptico.
Lectura e interpretación. Una adecuada interpretación de un corte observado al
microscopio óptico, depende de factores como el plano del corte, la tinción utilizada y
la interpretación funcional. Respecto al plano, es fundamental reconstruir la estructura
tridimensional de células, tejidos y órganos a partir de cortes bidimensionales. La
tinción es también fundamental ya que debe ser elegida correctamente con base en
las estructuras microscópicas que queremos estudiar. En cuanto a la interpretación

25
MÉTODO DE HISTOLOGÍA
Figura 1.26 Fijación de un camarón juvenil P.
vannamei. La solución que se está inyectando
al animal aún vivo, es Davidson - AFA. Nótese
el cambio de color del hepatopáncreas que pasó
de amarillo (normal) a anaranjado, por efecto
del fijador luego de haber sido inyectado. Se
observa el uso indispensable de guantes para la
manipulación de esta solución fijadora.
Figura 1.27 Cabina para extracción de gases,
utilizada para la manipulación de muestras que
han sido fijadas para procesamiento histológico.
Se observa un vidrio de seguridad en el frente,
a través del cual se pueden ver las muestras
que se manipulan y el cual protege la cara de
salpicaduras de reactivos irritantes. También
cuenta con fuente de agua para lavado de
elementos o partes del cuerpo en donde haya
caído algún reactivo histológico.
funcional, es importante establecer las correlaciones entre estructura y función de lo
observado, tratando de transformar mentalmente las condiciones estáticas del corte en
las dinámicas de la vida. Es fundamental para una correcta interpretación de hallazgos
histopatológicos, que la observación sea hecha por un ojo entrenado en patología y, en
particular, en los tejidos específicos de la especie que se va a estudiar. No es suficiente
tener láminas preparadas con gran acierto y que ofrecen excelente calidad óptica bajo el
microscopio, si quien las examina no tienen habilidad para diferenciar tejidos sanos de
órganos o tejidos con lesiones.
Durante la preparación de los cortes histológicos, pueden presentarse alteraciones
denominadas “artefactos”, los cuales deben ser reconocidos y diferenciados de áreas
conservadas de tejidos. Generalmente, se deben a errores en el empleo de sustancias
en la preparación del tejido, defectos en la cuchilla que se traducen en muescas en la
preparación, contaminación de los colorantes o, errores de montaje como pliegues.

26
Figura 1.28 Procesador de tejidos para histología.
Este equipo cuenta con 10 vasos de 1 L cada uno,
donde se hace la deshidratación de los tejidos y se
incorpora parafina líquida a temperatura controlada
(2 vasos con termostatos, de color blanco ubicados a
la derecha). Cuando esta se enfría, da textura firme al
tejido y permite realizar cortes con el micrótomo sin
que se deformen por el paso de la cuchilla.
Figura 1.29 Central de bloqueo. Esta unidad posee
superficies y compartimentos con temperaturas
controladas electrónicamente (T1, T2 y T3) y permite
preparar los bloques de parafina con los tejidos
incluidos. Durante este proceso, el tejido en parafina
es ubicado en un cassette plástico y cubierto con
parafina líquida obtenida a través de un dispositivo
especial (P), para formar un bloque. Este se solidifica
luego de estar por unos minutos sobre una superficie
con escarcha que posee el mismo equipo (E).
Figura 1.30 Corte de tejidos en el micrótomo. Se observa un
cassette (blanco) con un corte de cefalotórax (anaranjado)
siendo montado en la base móvil de un micrótomo, antes
de que sean cortadas las secciones a 3 micras de grosor.

27
Figura 1.31 Baño de recuperación de tejidos,
en el cual las tiras de parafina con tejido que
se han obtenido con el micrótomo, son puestas
en flotación en agua caliente. La parafina se
expande con el calor y se elige el mejor corte,
capturándolo con una lámina portaobjetos y
ubicándolo sobre esta en la posición en la cual
va a quedar de forma definitiva.
Figura 1.32 Batería de tinción con hematoxilina
y eosina, en la cual se agregan los colorantes
a los tejidos para obtener el contraste entre las
diferentes células y entre las distintas partes de
cada una. En la foto se observan los reactivos
utilizados para la tinción de rutina, donde se
puede apreciar la canasta con láminas siendo
inmersa en eosina.
Figura 1.33 Lámina portaobjetos con cortes
histológicos de un camarón juvenil P. vannamei,
los cuales han sido teñidos con H&E. Se observa
un corte longitudinal de cefalotórax (C), uno
transversal de abdomen (A) y uno longitudinal
de branquias (B).

28
Figura 1.34 Corte histológico de un segmento del
corazón de un camarón subadulto P. vannamei.
Se observa la válvula aórtica de un animal sano
(flechas), en el lugar donde la hemolinfa ingresa
a la arteria aorta (A). H&E. Amplificación 100X.
Figura 1.35 Corte histológico de hepatopáncreas
de un camarón subadulto P. vannamei. Se
observan túbulos normales compuestos por
diferentes tipos de células y con un lumen
en el centro. No hay evidencia de lesiones
que sugieran presencia de una enfermedad
degenerativa. H&E. Amplificación 200X.
Figura 1.36 Corte histológico de hepatopáncreas
de un camarón juvenil P. vannamei, con
inflamación a causa de la enfermedad NHP.
Los principales hallazgos histopatológicos son
agregación hemocítica severa (inflamación),
melanización de varios túbulos, citolisis y
pérdida de la arquitectura de la zona afectada.
H&E. Amplificación 200X.

29
1.7 Pruebas con anticuerpos
Objetivo. La prueba de ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) es una prueba
rápida de laboratorio, en la cual un anticuerpo conocido se une a un antígeno (viral o
bacteriano) presente en una muestra de camarón, con el fin de detectar la presencia o
no de dicho agente patógeno en la muestra. Esta prueba que utiliza anticuerpos para el
diagnóstico de enfermedades en camarones, se llama en español “inmunoanálisis ligado
a enzimas” o también “enzimoinmunoanálisis de adsorción” (EIA).
Descripción. La técnica de ELISA utiliza anticuerpos específicos para la identificación
de antígenos también específicos, los cuales son componentes estructurales (usualmente
proteínas) de agentes patógenos o, proteínas únicas producidas o inducidas por ellos.
Esta prueba provee una estrategia de diagnóstico la cual es potencialmente muy
rápida (en algunos casos sólo tarda 1 hora), de buena sensibilidad y adaptable a un gran
número de muestras en un pequeño espacio tanto en laboratorio como en condiciones
de campo. La prueba de ELISA puede ser realizada con base en anticuerpos policlonales
o monoclonales.
Metodología. La prueba de ELISA combina la especificidad de anticuerpos con la
sensibilidad de pruebas enzimáticas simples, usando anticuerpos o antígenos acoplados
a una enzima fácilmente detectable. La ELISA puede proporcionar un sistema útil para la
medición de la concentración de un antígeno o de un anticuerpo. Hay dos variaciones
principales en este método: la ELISA puede usarse para detectar la presencia de antígenos
que son reconocidos por un anticuerpo o para detectar anticuerpos que reconocen un
antígeno.
Una prueba de ELISA es un procedimiento que involucra cinco pasos generales:
1) cobertura de los pozos de la microplaca con el antígeno; 2) bloqueo de todos los
sitios no cubiertos por el antígeno, para evitar resultados falsos positivos; 3) adición de
anticuerpos a los pozos de la microplaca; 4) adición de anticuerpos conjugados con una
enzima; 5) reacción de un substrato con la enzima para producir un producto coloreado,
indicando así una reacción positiva. Hay muchos tipos diferentes de ELISA. Uno de los
tipos más comunes es la ELISA “sandwich”. La siguiente es la metodología general para
realizar una prueba de ELISA. Algunos pasos, reactivos y cantidades podrán cambiar
según se requiera para cada protocolo asociado con un antígeno en particular.
Una microplaca para ELISA se debe cubrir con el antígeno apropiado, llenando
los pozos con 100 μL del antígeno diluido. Se incuba toda la noche a 4ºC y se lava el
antígeno no adherido en la microplaca mediante golpes suaves. Luego se llenan los
pozos con agua destilada y se vacían de nuevo con un golpe suave; se repite esto 2 veces
más utilizando PBS-Tritón.
Se debe bloquear la unión no específica agregando 200 μL de BSA/PBS 1% y se
incuba luego por 30-60 minutos a temperatura ambiente. Se lava la microplaca como se
mencionó anteriormente y se agregan 100 μL de las muestras diluidas en los respectivos
pozos de la microplaca. Hay que asegurarse de incluir siempre controles positivo
y negativo y, si es necesario, una curva estándar. Se incuba por 1 hora a temperatura
ambiente y se repite luego el paso del lavado.
Luego se prepara la dilución apropiada del segundo paso del anticuerpo conjugado
con fosfatasa alcalina o con peroxidasa de rábano (los anticuerpos deben ser titulados
para buscar obtener una dilución óptima).
Se deben agregar luego 100 μL del anticuerpo del segundo paso a los pozos y se
incuba por 1 hora. Hay que repetir nuevamente el paso del lavado. Se prepara la solución

30
del substrato y se agregan 100 μL a los pozos, incubando luego a temperatura ambiente
por 60 minutos. Finalmente se agrega la solución de parada en cantidad suficiente y se
leen las microplacas en un lector de ELISA.
MÉTODO DE PRUEBAS CON ANTICUERPOS Y PARÁMETROS
INMUNOLÓGICOS
(ESPECTROFOTOMETRÍA)
Figura 1.37 Procedimiento de ELISA en
microplaca de 96 pozuelos. Se fijan anticuerpos
y se agrega el antígeno complementario.
Esta unión se detecta agregando un segundo
anticuerpo contra el mismo antígeno, marcado
con una enzima. Esta, en contacto con un
substrato, produce color cuya intensidad es
proporcional a la cantidad de antígeno presente
en la muestra. Foto: Cultek S.L.U.
Figura 1.38 Microplacas de ELISA con
96 pozuelos, utilizadas para pruebas con
anticuerpos y en mediciones de parámetros
inmunológicos de camarones. Son montadas en
un lector de ELISA para detectar por colorimetría
la cantidad existente de un antígeno de interés.
Foto: Cultek S.L.U.
Figura 1.39. Lector de microplacas de ELISA con
96 pozuelos. Colorímetro que permite hacer
lecturas de punto final, funcionando de manera
independiente o conectado a un computador
para registro y análisis de datos. Tiene capacidad
para almacenar 100 ensayos y 20 microplacas
de datos. Foto: Cultek S.L.U.

31
1.8 Métodos moleculares
La hibridación es una de las principales metodologías que se utiliza actualmente en los
laboratorios de biología molecular. Unas de estas técnicas se han diseñado para identificar
secuencias específicas en los ácidos nucleicos.
La hibridación se refiere al apareamiento específico que ocurre entre cadenas de ácidos
nucleicos con secuencias complementarias, proceso que es análogo a la reacción antígeno-
anticuerpo, pero con la diferencia de que en la hibridación en lugar de anticuerpos se emplean
sondas genéticas. Éstas son fragmentos cortos de ADN o ARN sintetizados in vitro y que se
marcan con sustancias radiactivas, fluorescentes o de otro tipo, a fin de hacer posible su posterior
detección y de esta manera la identificación de la secuencia de ADN o ARN de interés.
En camarones, las principales técnicas de biología molecular utilizadas como apoyo para
la detección de agentes patógenos en muestras de animales afectados, son: dot blot, hibridación
in situ, PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real (real-time PCR), esta última principalmente
en investigación más que en diagnóstico. De éstas, las que presentan mayor sensibilidad y
especificidad son las relacionadas con PCR.
Dot blot
Objetivo. Detección de patógenos (ej.: virus) en una muestra de tejido de camarón, mediante
el reconocimiento de la presencia de su ADN a través de un proceso de lisis (ruptura) celular,
extracción del ADN, hibridación y revelado.
En camarones existen sondas para detectar virus como WSSV o IHHNV y para detectar
bacterias intracelulares como la alfa Proteobacteria causante de la NHP.
Descripción. El dot blot es una técnica de hibridación en la cual el ADN se ubica directamente
sobre una membrana de nylon o de nitrocelulosa. Su nombre se debe a que sobre la membrana
donde se ubican las muestras del ADN extraído, se forman círculos o puntos. Esta técnica
involucra sondas genéticas en su procedimiento, las cuales son pequeños fragmentos de ADN
(oligonucleótidos), que son complementarios de regiones que nos interesan en el ADN que
se está buscando en una muestra (ej.: virus). De esta manera, si en una muestra problema se
produce la hibridación entre la sonda y el ADN viral, se puede concluir que el virus en cuestión
se encuentra presente.
Las sondas genéticas para camarones son marcadas utilizando moléculas como la biotina
o la digoxigenina, las cuales son luego detectadas mediante enzimas como la fosfatasa alcalina,
produciendo una reacción colorimétrica y de esta manera detectable por el ojo humano. Las
sondas genéticas son específicas para un único tipo de microorganismo.
En la actualidad, es factible conseguir sondas genéticas en kits comerciales. Este tipo de
prueba es muy útil cuando se quiere estudiar un gran número de muestras, pero tiene la limitante
de no ofrecer muy alta sensibilidad, además de que su revelado final es por colorimetría.
Metodología. El procedimiento de dot blot en camarones, inicia con una muestra de hemolinfa
o de otro tipo de tejido de un animal sospechoso de una enfermedad (ej.: virus WSSV). Cabe
recordar que se debe utilizar una sonda específica para el tipo particular de microorganismo
que se va a buscar.
La muestra es macerada mecánicamente con un tampón (buffer) de lisis, con lo cual
se busca romper las células y permitir la salida de las moléculas de ADN hacia la solución
del macerado. Luego, una cantidad de macerado (inferior a una gota) es puesta sobre una
membrana de nylon (o de nitrocelulosa). El ADN es luego desnaturado, es decir, se separan las

32
cadenas de la doble hebra y luego se coloca la sonda previamente calentada. Dicha sonda ha
sido modificada, habiéndosele unido una molécula de digoxigenina.
Se incuban las muestras con la sonda y si esta encuentra regiones del ADN viral que
sean complementarias (guardando el concepto de complementariedad de los nucleótidos A-T
y C-G), se produce anillado o hibridación (unión entre la sonda y el ADN viral), que es una
molécula estable de ADN híbrida de doble cadena.
Luego de incubar, se realiza un lavado y se agregan anticuerpos anti-digoxigenina, que
han sido previamente marcados con la enzima fosfatasa alcalina. Si la sonda está presente
en las muestras, se formará un complejo “antígeno-anticuerpo” con la digoxigenina. Se hace
un último lavado y se agrega una solución reveladora (BCIP-NBT), la cual reacciona con la
fosfatasa alcalina y produce una reacción colorimétrica. La intensidad del color morado que se
produce, es proporcional a la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (partículas
virales de WSSV en el caso de este ejemplo).
Hibridación in situ (HIS)
Objetivo. Este método permite detectar el ADN o ARN problema en el interior de las células,
permeabilizándolas de tal forma que se permita la entrada de una sonda. Entre las principales
aplicaciones de la HIS, está la detección de ARN o ADN de origen viral o, ADN de origen
bacteriano, en tejidos de camarones fijados y procesados mediante inclusión en parafina. Por
lo tanto, también es útil para realizar estudios retrospectivos en material de archivo fijado e
incluido en parafina varios años atrás.
Los patógenos o enfermedades en camarones que pueden ser detectados en la actualidad
mediante HIS, son IHHNV, TSV,YHV, WSSV y NHP
Descripción. Es un método histoquímico que emplea la biología molecular, de la misma
manera que la inmunohistoquímica utiliza los métodos de la inmunología. Al igual que en el
caso de la hibridación dot blot, la especificidad de la HIS se basa en la unión recíproca de una
sonda (secuencia de oligonucleótidos), con un fragmento complementario de ARN o ADN
dentro de una muestra de tejido.
A diferencia que el dot blot, la HIS utiliza como matriz un corte histológico de un camarón
previamente fijado y procesado mediante inclusión en parafina, el cual ha sido adherido (al
igual que en la histología) sobre una lámina portaobjetos, pero en este caso la lámina debe
tener una carga positiva. En vez de realizar el proceso de tinción como en histología, se realiza
la aplicación de la sonda y los demás componentes para la detección genómica de un agente
patógeno específico.
Metodología. El procedimiento de hibridación in situ en camarones, se inicia a partir de un
bloque de parafina con una muestra de camarón, igual al que es utilizado para histología de
rutina. El bloque es ubicado en un micrótomo y se corta una sección no mayor a 4 micras
de espesor, la cual debe ser recuperada por flotación en una lámina portaobjetos cargada
positivamente.
La lámina con la muestra en parafina debe ser calentada para eliminar la parafina y
posteriormente re-hidratada utilizando xilol (o algún substituto), etanol en concentraciones
descendentes (100%, 95%, 80% y 50%), agua destilada y buffer TNE.
La lámina se incuba luego con proteinasa K en una cámara húmeda, se sumerje luego en
formaldehído y se lava con un buffer. Se aplica entonces la solución de hibridación y se incuba
en cámara húmeda. Si el ADN o ARN del patógeno que se está buscando se encuentra presente
en la muestra, en este momento se realiza el anillado o hibridación que como ya se explicó en

33
la técnica de dot blot, es una unión entre la sonda y fragmentos del genoma viral o bacteriano,
que forma así una molécula estable.
Para los virus IHHNV, HPV y TSV, la sonda se diluye en la solución de hibridación y es
puesta directamente sobre la muestra. En el caso de BP, MVB, WSSV y NHP, se requiere de un
calentamiento previo de la muestra para desnaturalizar el ADN baculoviral de doble cadena
(dsDNA). La muestra se debe incubar en cámara húmeda toda la noche; para el caso de IHHNV
y HPV a 37ºC, para BP, MVB, WSSV, NHP y TSV a 42ºC.
Posteriormente las muestras deben ser sometidas a varios lavados con buffers distintos
y luego se aplican los anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa alcalina. Se
incuban y posteriormente se hacen nuevos lavados con soluciones buffer.
Se aplica la solución de desarrollo y se frena luego la reacción cuando sea ya necesario
de acuerdo con criterios colorimétricos, lavando con soluciones buffer y después con agua
destilada. Las muestras se someten luego a tinción con el colorante “Bismark Brown Y” y se
deshidratan posteriormente utilizando etanoles ascendentes (95% y 100%) y xilol (o algún
substituto).
Sin dejar secar la muestra en este momento (y en ninguno de los procesos anteriores),
se pone una gota de medio de montaje sobre el tejido y se cubre con una laminilla o lámina
cubreobjetos. Se deja secar y se observa luego en un microscopio de campo oscuro, para
detectar depósitos intracelulares de precipitado negro o azul oscuro y/o alguna citopatología
específica que haya sido marcada por la sonda.
La interpretación de los resultados varía en cada muestra, según el patógeno que se está
buscando y, por consiguiente, las células de los tejidos “blanco” que se espera hayan sido
infectados por el agente viral o bacteriano.
En el caso del virus TSV, debe considerarse que una manipulación incorrecta antes de la
prueba, puede arrojar resultados falsos negativos. Adicionalmente, las muestras paraTSV deben
ser manejadas en ambientes y con reactivos libres de RNAsas; el personal debe ser entrenado
en el manejo de muestras con patógenos cuyo genoma es ARN y en este tipo de ambientes
libres de RNAsas.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Objetivo. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés - polymerase
chain reaction), es un método enzimático de amplificación de secuencias específicas de ADN,
que permite la síntesis in vitro de un fragmento de ADN de forma tal que, en cada ciclo del
proceso, se duplica el número de moléculas. De esta manera, se utiliza para la detección
genómica de ciertos microorganismos patógenos como virus (ADN y ARN) y bacterias, en
muestras de camarones o de organismos relacionados.
La PCR es utilizada en camarones para la detección de los virus WSSV, IHHNV, BP, MBV,
SMV,YHV (grupo), IMNV, TSV y PvNV.
Descripción. El principio de la PCR consiste en determinar la secuencia de interés y seleccionar
pequeños segmentos de nucleótidos llamados iniciadores o cebadores (“primers” en Inglés),
complementarios con la secuencia de nucleótidos de los extremos opuestos de las cadenas que
flanquean a dicha secuencia, a partir de los cuales se inicia la elongación o síntesis de nuevas
cadenas en el extremo 3’ de cada iniciador.
La PCR se realiza en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo que
permite obtener hasta un millón de copias de un solo fragmento en pocas horas. Los elementos
necesarios para llevarla a cabo se comercializan en forma de kits.

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