TEMAS CORTOS DE ALIMENTOS Y MICROBIOLOGÍA Hola a todos. Respondiendo nuevamente a pedidos de jóvenes seguidores y alumnos, les dejo un ensayo de temas cortos por demás de interesantes como ser: Historia de la bromatología Esterilización en microbiología Coloración de Gram Espero les resulte de interés y muchas gracias por permitirme hacer un pequeño y humilde aporte para el acervo cultural de quien lo necesite. Buena jornada.

2. ACLARACIÓN LEGAL
Las fotografías de la presentación, son propiedad del
autor y publicadas oportunamente con sus fuentes en su Blog
científico: SEGURIDAD ALIMENTARIA, BROMATOLOGÍA y
MICROBIOLOGÍA de los ALIMENTOS
(www.bagginis.blogspot.com)

3. 1. HISTORIA DE LA BROMATOLOGIA
El interés del conocimiento histórico en la enseñanza de la Ciencia ya fue fomentado por
Pasteur quien decía que "es conveniente que los alumnos conozcan y recuerden los esfuerzos
individuales de los primeros investigadores al adoptar sus técnicas de trabajo, e incluso los métodos
utilizados en su elaboración. Los educadores deben intentar que los alumnos sepan la difícil gestación
de muchos de éstos, con el fin de aclarar y ensanchar su inteligencia y, con ello, hacerlos aptos para
producir Ciencia por sí mismos".
El origen de la Bromatología, y por tanto de la Higiene, Inspección y Control Alimentario,
puede remontarse a los propios inicios de la historia del hombre, en el intento de éste por conseguir
alimentos que satisfagan sus necesidades nutritivas. Por otra parte, si la alimentación es
consustancial con la especie humana, las normas higiénicas, más o menos elementales, van
necesariamente unidas a ésta. Esta dependencia del suministro alimenticio obligó al hombre a
profundizar en el estudio de los alimentos, siendo éste el punto de partida de la evolución histórica
de la Bromatología como Ciencia.
Las primeras prácticas de higiene alimentaria las realizó el hombre primitivo cuando aprendió
a distinguir aquellos alimentos tóxicos o contaminados que, como indicaba Hipócrates, su consumo
era con frecuencia causa de disturbios gastrointestinales. De hecho, tal vez fuese la mujer, que en
épocas primitiva era la encargada de la recolección de frutos y bayas para la alimentación, la primera
en realizar un control de los alimentos, diferenciando de forma intuitiva los alimentos dañinos de los
que no lo eran y estableciendo una relación causa-efecto entre la ingestión de un alimento
determinado y el malestar digestivo producido al cabo de cierto tiempo. Ante la necesidad de una
mayor cantidad de alimentos, se desarrollaron actividades como la caza y la domesticación de
animales que supusieron un cambio de la tradicional dieta vegetariana (recolección frutas y semillas)
a un mayor consumo de carnes y vísceras de animales.

4. El descubrimiento del fuego también supuso una modificación trascendental de los hábitos
alimentarios y tuvo consecuencias importantes en la higiene alimentaria desde el punto de vista de la
conservación de los alimentos. El desarrollo de la agricultura en el cercano Oriente supuso la
aparición de civilizaciones caracterizadas por un conocimiento agrícola avanzado en los cultivos de
distintos cereales como el trigo, arroz, cebada, avena y mijo. Estos avances en la producción y
obtención de alimentos obligaron al hombre a iniciarse en el campo del procesado y conservación de
los mismos.
Destacan las civilizaciones egipcias, griegas y romanas que ya elaboraron alimentos como el
pan, vino, aceite de oliva, queso, cerveza, miel, aplicaron técnicas de salazón y ahumado para la
conservación de pescados y carnes y produjeron conservas de alimentos, tanto en vinagre como en
salmuera. En este contexto, el hombre comienza a preocuparse por la relación entre el consumo de
alimentos y la aparición de enfermedades, empezando a reconocer empíricamente los alimentos con
sustancias nocivas responsables de intoxicaciones alimentarias. A este respecto, destaca la
preocupación de las distintas religiones a la hora de practicar en condiciones higiénicas los sacrificios
de los animales que se ofrecían a los dioses y proceder al posterior reconocimiento de sus carnes. De
hecho, existen referencias históricas del antiguo Egipto sobre prácticas de inspección de la carne,
encomendadas a las castas sacerdotales que ejercían la medicina en los templos (Parisier, 1975).

5. También, entre los pobladores de las regiones del Tigris y Éufrates, las prácticas de higiene de
los alimentos eran de exclusiva misión sacerdotal. Quizás por ello, las primeras religiones
establecieron una cierta legislación alimentaria, en forma de preceptos y prohibiciones religiosas, y
una policía de alimentos que fue, en los primeros tiempos, una función sacerdotal. Hace siglos que las
leyes de los israelitas detallaban los alimentos que podían ser comidos y los que debían de ser
rechazados, las formas de prepararlos, las medidas de limpieza a adoptar por los manipuladores, las
prácticas correctas del sacrificio y de la inspección de los animales, tal y como queda recogido en el
libro El Talmud.
Existen datos de que, ya en la Grecia Clásica, se aplicaban ciertas normas higiénicas en la
inspección de los alimentos, en especial sobre la carne por su facilidad para alterarse, ya que se
conocían los efectos patológicos de algunos parásitos en la carne. En la antigua Roma, las carnes, y
los productos alimenticios en general, se sometían a la inspección de la autoridad estatal,
representada por los Praefecti (Praefectus annonae y Praefectus urbís) y realizada la inspección
directa por los Aedili curuli, funcionarios que atendían a los impuestos y al control de alimentos
(aptos o no aptos).

6. Del año 150 a.C. datan las primeras multas por venta de carnes no inspeccionadas
previamente. Ya no se realizaban sacrificios rituales sino matanzas regladas, diseñándose los
primeros mataderos. Los romanos instituyeron la inspección oficial de los abastecimientos de víveres,
puesto que con frecuencia se adulteraban el pan, el vino, la leche, la cerveza y hasta el pescado.
En el Antiguo Testamento se recogen las primeras referencias escritas sobre la higiene de los
alimentos, concretamente en los libros 3º y 5º del Pentateuco, Levítico y Deuteronomio
respectivamente. En el Levítico (cap. XXI y XXII) se recogen normas higiénicas de actuación de los
sacerdotes durante el sacrificio de los animales “...ni ejercerá su ministerio si fuere ciego, si cojo, si de
nariz chica, o enorme, o torcida, si de pie quebrado, o mano manca, si corvado, si legañoso, si tiene
nube en el ojo, si sarna incurable, si algún empeine en el cuerpo o fuera potroso”, así como las
condiciones higiénicas de los animales destinados al sacrificio, "si el animal es ciego, si estropeado, si
tuviese matadura o verrugas, o sarna, o empeines, no le ofrezcáis al Señor, ni hagáis quemar nada de
él sobre el altar del señor". En el Deuteronomio (cap. XII y XIV) se describen los animales que se
consideran limpios que pueden consumirse y los inmundos que están prohibidos.
Según este libro, los animales aptos para servir de alimentos al hombre deben de tener la
pezuña hendida y rumiar, mientras que la carne procedente de animales heridos, muertos o
enfermos, la carne de animales y aves de rapiña, los reptiles y la carne de cerdo se prohibía su
consumo. Entre los animales de medio acuático, sólo se consideran comestibles los peces con aletas y
escamas. Estos preceptos eran consecuencia del riesgo, por aquellos tiempos ya conocido, de
transmisión de ciertas enfermedades bacterianas y parasitarias asociado al consumo de estos tipos
de carne. Más recomendaciones higiénico-sanitarias las encontramos en preceptos religiosos de otras
civilizaciones. El Libro de Manú (500 años a.C.), fundamento del comportamiento religioso de los
brahmanes de la India, indica cómo debe realizarse la carnización de los animales y el faenado de su
carne. En el Corán (644 años d.C.) se menciona” os está vedada la carne mortecina, la sangre, la carne
de cerdo, la del animal sobre el que se haya invocado un nombre diferente del de Dios, la del animal
muerto a palos, de una caída, de una cornada, la del devorado parcialmente por las fieras, incluso si
aún lo sacrificáis vosotros, la del inmolado en piedras erectas” (versículo 5.3).
En la Edad Media, los gremios profesionales de las grandes ciudades de Europa Central fueron
los principales responsables de la regulación del comercio, destacando los gremios de carniceros,
pescaderos y panaderos que promulgaron reglamentos para impedir las adulteraciones de los
alimentos. Fue en 1276, en Augsburgo, cuando se dispuso que los sacrificios debían llevarse a cabo en
mataderos públicos. Otro aspecto importante a considerar son las consecuencias del descubrimiento
de América en relación a la incorporación de nuevos alimentos y la necesidad de cargar las bodegas
de los barcos con víveres duraderos para las grandes expediciones. A nivel nacional, parece ser que el
primer matadero estuvo ubicado en Málaga, ya que, en una Cédula Real de 1498, se ordena su
traslado.

7. En Sevilla, en 1525, se tiene conocimiento de la existencia de un matadero, obligándose al
cumplimiento de ciertas normas higiénicas en el comercio de alimentos. En esta época, la inspección
y los decomisos fueron encomendados a los “fieles o veedores” de los mercados, representantes de
la autoridad municipal, sin estudios especializados, que llegaron a tener gran importancia en
determinadas capitales donde alcanzaron el grado de “veedores diputados”. Durante esta época, los
conocimientos sobre Higiene, Inspección y Control Alimentario se basaban en las creencias religiosas
y en las conclusiones obtenidas de la observación y experiencia.
Esto supone una inspección de alimentos empírica, poco científica y en numerosas ocasiones
no exenta de supersticiones. No se producen cambios importantes hasta el nacimiento de la propia
profesión veterinaria, cuando los veterinarios fueron sustituyendo a los “veedores”. Para tener una
visión general sobre la influencia de los conocimientos científicos en el desarrollo histórico de la
Higiene, Inspección y Control Alimentario, se comentará brevemente aquellas investigaciones más
interesantes en los distintos campos científicos relacionados con esta disciplina.
No es hasta el siglo XIX cuando el veterinario adquiere la debida importancia como higienista e
inspector de alimentos, ya que es a partir de esta época cuando comenzaron a sucederse hechos que
identificaban la relación entre la alimentación y el estado de salud. A medida que se profundiza en el
conocimiento de la patología humana y animal, se llega a la conclusión de que ciertas enfermedades
podrían transmitirse de los animales al hombre por el consumo de carnes procedentes de animales
enfermos. A este respecto, fueron de primera magnitud los hallazgos en Parasitología y Bacteriología.
A partir de los siglos XVII y XVIII, la mayor preocupación social frente a la teniasis, triquinosis y
tuberculosis, junto con los avances en Química y Microbiología, originó una etapa sanitaria en el
control de los alimentos y un importante empuje al desarrollo de esta disciplina.

8. Respecto a los avances en Microbiología, a pesar de que los microorganismos fueron descritos
por primera vez por Van Leeuwenhoek (1675), fue Louis Pasteur quien, 200 años después, hizo
comprender al mundo científico la importancia de las observaciones del primero. Pasteur investigó
numerosas enfermedades del hombre y de los animales, comprobando, sin lugar a duda, que las
bacterias eran la causa responsable de muchas de ellas. Sus investigaciones tuvieron una particular
importancia en la Ciencia de los Alimentos. Como consecuencia de los descubrimientos de Pasteur,
médicos y veterinarios comenzaron a tomar la responsabilidad de la lucha frente a las zoonosis y
epizootias como base de la Higiene Alimentaria. Además, en esta época se empieza a adquirir un
conocimiento científico sobre la relación entre el consumo de alimentos contaminados y la falta de
higiene con la aparición de enfermedades bacterianas en el hombre. Algunos hallazgos científicos de
importancia en la Microbiología de los alimentos son los siguientes:
✓ John Snow (1854) identificó el agua de bebida como principal fuente de difusión del
cólera
✓ William Budd (1856) llegó a la conclusión de que la fiebre tifoidea era difundida con la
leche o el agua de bebida contaminada
✓ Gaertner (1888) describió, por primera vez, una bacteria capaz de provocar una
toxiinfección alimentaria y que después se identificó como la Salmonella
✓ Van Ermengem (1896) identificó el Clostridium botulinum como agente causal del
botulismo
✓ En 1914 se comprobó la relación de los estafilococos con las enfermedades
alimentarias
✓ Entre 1945-53 se identifica el Clostridium perfringes como responsable de
toxiinfecciones alimentarias.
En resumen, un mejor conocimiento de la patología general, los adelantos en histopatología,
el descubrimiento de bacterias y parásitos, el papel desempeñado por algunos veterinarios (clínicos y
microbiólogos) y la comprobación de la existencia de enfermedades zoonóticas determinaron que se
contase con estos profesionales como parte fundamental de la inspección y control de los alimentos
(Sanz, 1988). Los principales cambios a destacar en el campo de la Tecnología de los alimentos son el
desarrollo de los métodos de pasterización y esterilización o apertización, fundamentales para
asegurar la higiene y conservación de los alimentos.

9. Nicholas Appert diseñó un sistema con el que se conseguía prolongar la vida útil de los
alimentos, conservándolos en las populares latas de conservas. A este método se le denominó
“apertización o esterilización” y fue premiado con 12.000 francos por Napoleón, ya que se utilizó para
proporcionar un mejor aprovisionamiento de víveres a las tropas francesas. El método de
pasterización debe su nombre a Pasteur (1869) y se aplicó por primera vez con la finalidad de
higienizar la leche destinada al consumo humano (1890).
La demanda creciente de alimentos y los numerosos descubrimientos de la Química en los
siglos XVII y XVIII dieron lugar a un campo abonado para la adulteración fraudulenta de los alimentos.
Estos hechos complicaban la labor de inspección y control sanitario de los mismos, ya que resultaba
más difíciles de descubrir estos fraudes. Por tanto, los métodos químicos eran necesarios para
asegurar la calidad de los productos y evitar las adulteraciones. En este contexto, cabe destacar los
trabajos realizados por Fredrick Accum (1820) que, desde su propio laboratorio, llevo a cabo una
actividad de consultoría y análisis de alimentos y luchó contra la adulteración con métodos sencillos,
tales como la determinación de alumbre en pan por precipitación con cloruro de bario, o la de plomo
en queso o en agua también por precipitación con hidrógeno sulfurado, quedando reflejados estos
métodos en su libro titulado “Treatise on Adulterations of Food and Culinary Poisons”.

10. Estos estudios sobre la adulteración de los alimentos fueron retomados posteriormente por
Warley (1855) y originó la publicación del libro titulado “Food and Its Adulterations”. Estos hallazgos
científicos supusieron un llamamiento a los gobiernos sobre la necesidad de legislar en materia de
alimentación, con la finalidad de evitar la adulteración de los alimentos y asegurar su salubridad.
Hasta el siglo XVIII, las prácticas fraudulentas o adulteraciones se limitaban a la sustracción de
parte del peso o del volumen del alimento comprado, a la incorporación de sustancias inertes para
aumentar su peso y volumen, a la venta de carne de animales muertos de enfermedades esporádicas
o infecciosas y a la de alimentos descompuestos, cuyo sabores y olores repugnantes se
enmascaraban, como en la Edad Media, con la adición de yerbas aromáticas y especias diversas
(Sanz, 1988). La preocupación de los consumidores, cuando éstos comprendieron la gravedad de la
adulteración alimentaria y el riesgo toxicológico de algunas sustancias fraudulentas, junto con los
nuevos conocimientos en la Ciencia y la Tecnología de los Alimentos, dieron lugar a un aumento
progresivo de las medidas de protección y se comprendió la importancia de establecer sistemas de
inspección y control alimentarios, por parte de las entidades gubernamentales, como medio de
salvaguardar la Salud Pública.
Entre las acciones tomadas, destaca el desarrollo de una legislación que endureció las medidas
frente a la adulteración y el gran esfuerzo de los científicos para establecer las propiedades
inherentes de los alimentos, las sustancias químicas empleadas como adulterantes y la forma de
detectarlas. De ahí que, durante 1820-1850, la química en general, y la de los alimentos en particular,
experimentaran un gran desarrollo en Europa.
En el siglo XX, con la llegada de la 2ª revolución industrial, se van transformando las
sociedades rurales en urbanas, con las consiguientes concentraciones de población. Este hecho
provocó cambios importantes respecto a las prácticas de obtención, procesado y preparación de los
alimentos. Por otra parte, la revolución de la Química Orgánica, con la aparición de numerosos
compuestos químicos comerciales, supuso grandes beneficios económicos y sanitarios para la
agricultura y producción animal, por la aplicación de plaguicidas y fármacos en la terapéutica
veterinaria. No obstante, el empleo de estos compuestos supone un riesgo para la salud pública, ya
que pueden quedar residuos de los mismos en los alimentos, incorporarse a la cadena alimentaria y
dar lugar a alteraciones patológicas tras su ingestión, como consecuencia de su carácter tóxico,
comprometiéndose las garantías de inocuidad de los alimentos.
Por ello, la Higiene, Inspección y Control Alimentario es una disciplina en continua
actualización, debido a estos avances en el campo de la alimentación que suponen nuevos riesgos a
controlar para seguir asegurando la inocuidad, el valor nutritivo y el valor comercial de los alimentos.

11. Hoy en día, el gran auge de la industria agroalimentaria los avances de la tecnología
alimentaria, la evolución de los métodos de análisis, la aparición de productos nuevos (alimento o
ingrediente) y la modernización de los canales de comercialización exigen una mayor intervención
gubernamental que asegure la salubridad de los alimentos. De hecho, durante el inicio del siglo actual
se asiste a la creación de instituciones que tienen por objetivo velar por la seguridad de los
consumidores y por las condiciones sanitarias de la población, regulando y coordinando la disciplina
de Higiene, Inspección y Control Alimentario mediante orientaciones o códigos de prácticas.
De estas instituciones se pueden destacar las siguientes:
✓ −Instituto Internacional de Agricultura (1905)
✓ Oficina Internacional de Higiene Pública (1907), creada tras la firma del Convenio de
Roma, dotada de un Comité permanente con sede en París.
✓ Organización Internacional para la Agricultura y la Alimentación (FAO), fundada tras las
Conferencias de Naciones Unidas para la alimentación y la agricultura, celebradas en
Virginia (1943) y Quebec (1945), que fija inicialmente su sede en Washington para
trasladarla definitivamente a Roma, en 1951. Esta organización tendrá un papel
preponderante en la regularización y armonización de las legislaciones relacionadas
con la salubridad de los alimentos.
✓ −Organización Mundial de la Salud (OMS) (1948), creada tras convocar la recién nacida
ONU en Nueva York, una Conferencia Internacional de Sanidad, que adopta el proyecto
de constitución de la OMS, con sede en Ginebra. Su principal misión es promover una
mejora sanitaria en todo el mundo.
✓ Comisión del Codex Alimentarius (1962), formada para poner en práctica el programa
conjunto FAO/OMS sobre normas alimentarias y es la responsable de elaborar el Codex
Alimentarius, que se define como una compilación de normas alimentarias
internacionalmente adoptadas cuya finalidad es proteger la salud e intereses
económicos de los consumidores y garantizar prácticas correctas en el comercio de
alimentos.
Estos organismos instaron a los Gobiernos a llevar a cabo estudios técnicos y sanitarios sobre
las condiciones que debían reunir los alimentos destinados al consumo humano, lo que tuvo como
consecuencia la preparación y/o perfeccionamiento de los Códigos Alimentarios Nacionales.

12. Tanto la evolución de los conocimientos bromatológicos en campos como la Microbiología,
Analítica, Tecnología, Toxicología y Nutrición, como que los consumidores platean cada vez mayores
exigencias en cuanto a la calidad y variedad de los alimentos, suponen nuevas posibilidades y retos
para la Higiene, Inspección y Control Alimentario a distintos niveles. Respecto a los hallazgos
científicos y tecnológicos acaecidos, la Higiene, Inspección y Control Alimentario tiene una
participación futura sobre los siguientes puntos:
✓ Nuevos productos como alimentos y la aparición de nuevos alimentos procesados
(biológicos, dietéticos/light, enriquecidos, biotecnológicos).
✓ Síntesis de compuestos químicos, (terapéutica vegetal y animal para mejorar los
procesos de producción)
✓ Fraudes cada vez más sutiles y sofisticados.
✓ Incremento de las enfermedades de origen alimentario.
✓ Diseño de nuevas tecnologías en la industria alimentaria relativas a la conservación de
los alimentos.
✓ Investigación pormenorizada de los aditivos.
✓ Aplicación de nuevas técnicas de análisis en los sistemas de inspección y control de
calidad de la industria alimentaria (automatizadas y “on line”).
✓ Procedimientos y materiales de envasado no convencionales que consiguen alargar la
vida comercial del alimento.
✓ Estudio de los microorganismos “patógenos emergentes” en los alimentos (Salmonella
enteritidis, Listeria monocytogenes y el serotipo de Escherichia coli 0157:H7).
✓ Profundización en el estudio de proteínas infecciosas o “priones” (Encefalopatía
Espongiforme Bovina, EEB/BSE).
✓ Participación en programas de protección y defensa del medio ambiente y
ecotoxicología a través de los Sistemas de Gestión Ambiental en industrias
agroalimentarias.
Entre los cambios socio-culturales que ha experimentado la población y que han condicionado
una nueva perspectiva de la Higiene, Inspección y Control Alimentario, destacan:
✓ El consumo de alimentos fuera del hogar y los cambios en los hábitos alimentarios y en
la estructura familiar y social.
✓ Una mayor preocupación social por una alimentación sana y nutritiva.
✓ La asociación en grupos de consumidores organizados y las mayores exigencias
cuantitativas y cualitativas de los mismos en lo referente al estado higiénico de los
alimentos
✓ La venta de alimentos en las grandes superficies y los nuevos canales de
comercialización.
✓ Un mayor consumo de alimentos semielaborados y elaborados.

13. ✓ La movilización de masas y el turismo que introducen nuevas modas en el suministro
de alimentos a colectividades y establecimientos hoteleros.
De los aspectos relativos a las relaciones políticas entre países en materia de Higiene,
Inspección y Control Alimentario, hay que resaltar dos hechos:
✓ La apertura de fronteras y la liberalización de los mercados que obliga a cambios
continuos en la legislación alimentaria para adecuarse a las necesidades de los países y
siga cumpliendo con su finalidad última de asegurar la salubridad de los alimentos y
proteger al consumidor.
✓ El tipo de relaciones políticas existente entre países que, en determinados momentos y
circunstancias, pueden llegar a poner en duda la credibilidad de sus entes reguladores.
La disciplina de Higiene, Inspección y Control Alimentario se concibe bajo dos puntos de vista;
control de los productos y control de las aplicaciones tecnológicas. Es decir, la inocuidad de los
alimentos depende del óptimo control de todas las operaciones realizadas desde su obtención hasta
su distribución, venta y consumo.
Tradicionalmente, la inspección y control de los alimentos se ha centrado en la toma de
muestras y análisis del producto final como prevención de riesgo. Este tipo de inspección no es
factible en la situación de un Mercado Único, puesto que los alimentos circulan libremente sin
someterse a inspección durante el comercio y distribución, siendo necesario un exhaustivo control en
el origen de la producción. Por otra parte, los problemas higiénicos, con frecuencia, son debidos a
errores en los procedimientos de manipulación o procesado.

14. Estos son los motivos por los que se está imponiendo, como base de la inspección y control de
alimentos, la detección de errores relacionados con la elaboración de alimentos en todos los
eslabones de la cadena alimentaria, procediéndose a su rápida corrección y prevención,
especialmente sobre las materias primas como etapa más decisiva. Este nuevo planteamiento ha
supuesto pasar de funcionar según reglamentaciones de obligado cumplimiento, en las se tendía a
realizar una inspección exhaustiva de la Administración como única responsable, a la normativa
voluntaria y el autocontrol.
Esta nueva concepción en el control de calidad higiénica de los alimentos es conocida como el
sistema Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP), presentado por primera vez en la
National Conference on Food Protection (1971). Posteriormente, el Comité Consultivo
Norteamericano sobre Criterios Microbiológicos de los Alimentos (NACMCF) elaboró un documento
denominado HACCP Principles for Food Production (1989) en el que se plasma los fundamentos
generales y los 7 principios del sistema HACCP. Desde entonces, se ha venido aplicando en la
industria alimentaria, en primer lugar, para prevenir riesgos de tipo microbiológico, y en la actualidad
para asegurar la calidad sanitaria de los alimentos, evitando riesgos biológicos, físicos y químicos.
La traducción al español de este programa ha sido análisis de riesgos y control de puntos
críticos (ARCPC). No obstante, además de aplicar un sistema de prevención de los riesgos asociados al
consumo de alimentos, es necesario desarrollar técnicas analíticas que permitan una detección e
identificación rápida y fiable de los contaminantes bióticos y abióticos que comprometen la inocuidad
de los mismos. La introducción de las nuevas tecnologías con el desarrollo de métodos
inmunológicos, genéticos, ultrasonidos, visualizadores de imágenes, biosensores, etc., constituye uno
de los principales pilares de la moderna inspección de los alimentos. En definitiva, conviene señalar
que, en sintonía con lo descrito por otros científicos, el desarrollo futuro de la Higiene, Inspección y
Control Alimentario pasa por:
✓ la adopción de medidas de prevención de la calidad más racionales
✓ el desarrollo y utilización de técnicas analíticas más objetivas, rápidas, económicas y
seguras
✓ el seguimiento de una legislación alimentaria más racional y menos compleja

15. 2. ESTERILIZACIÓN EN MICROBIOLOGÍA
Desde hace mucho tiempo es un reto el control de enfermedades infecciosas por destrucción,
disminución de su número o inhibición de microorganismos. Se puede llevar a cabo con diferentes
métodos en función del lugar a aplicar y el grado de erradicación microbiana que se pretende
conseguir. Por esto es conveniente definir algunos conceptos:
✓ Esterilización: proceso físico o químico que destruye toda forma de vida de vida
microbiana, incluidas las esporas.
✓ Desinfección: tiene por objeto la destrucción de microorganismos mediante
agentes de naturaleza química (desinfectantes), con el fin de disminuir el número
de formas vegetativas a niveles mínimos.
✓ Desinfectante: es la sustancia química que inhibe o destruye microorganismos al
aplicarla sobre material inerte sin alterarlo significativamente.
✓ Asepsia: término que se aplica a los procedimientos utilizados para prevenir que
los microorganismos progresen en un medio determinado (quirófano, laboratorio.
etc.)
✓ Antisépticos: son agentes desinfectantes que se utilizan sobre superficies
corporales con el fin de reducir la cantidad de flora normal y de contaminantes
microbianos de carácter patógeno. Tienen un menor grado de toxicidad que los
desinfectantes y generalmente menor grado de actividad. Determinados
preparados pueden utilizarse como antisépticos o como desinfectantes
indistintamente, pero a diferentes concentraciones en cada caso.

16. ✓ Antimicrobianos: son sustancias químicas producidas por microorganismos o
sintetizadas químicamente que a bajas concentraciones son capaces de inhibir e
incluso de destruir microorganismos sin producir efectos tóxicos en el huésped.
Los métodos de esterilización más importantes y más comúnmente utilizados, son:
Físicos
a. Flameado: Es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un objeto
a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esterilizan de esta forma, las ansas de cultivo de
siembra como se visualiza en la fotografía a continuación.
Flameado en mechero Bunsen

17. b. Incineración: Es el mejor sistema para esterilizar todos aquellos productos en los que
no importa su destrucción como, por ejemplo, un material biológico.
c. Estufa: Utiliza calor seco a alta temperatura, 20 minutos durante 180º C, 60 minutos a
160º C, siendo suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º C, se lo utiliza para
esterilizar material de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc.
d. Autoclave de Chamberland: La esterilización con calor húmedo (vapor de agua) es
mucho más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las
proteínas de forma irreversible mediante rotura de las uniones H entre los grupos peptídicos a
temperaturas relativamente bajas. Consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituido por
vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de
presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir
todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza para
esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy
utilizado para la esterilización de medios de cultivo.
e. Tindalización: (esterilización intermitente)
consiste en someter el producto a calentamientos intermitentes
entre 56 y 100ºC durante 30 minutos con lo que se asegura
destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a
temperatura ambiente o a 37ºC, las esporas germinan y las
bacterias resultantes se hacen más sensibles al calentamiento
posterior.

18. Radiaciones
a. Luz UV: Es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por ácidos nucleicos
causando daños genéticos alterando las bases. Se la utiliza en la preparación de vacunas, cabinas de
seguridad biológica, lugares de trabajo como mesadas de laboratorios, etc.
b. Radiaciones ionizantes: Actúan lesionando ácidos nucleicos. Se la utiliza sobre todo en
procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos, guantes, jeringas, etc.
Químicos
Los agentes químicos como el óxido de etileno, formaldehído o glutaraldehído reaccionan con
gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los ácidos nucleicos y proteínas alquilando éstos
radicales esenciales.
a) Óxido de etileno: Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante
que inactiva microorganismos sustituyendo átomos de hidrógeno lábiles por otros grupos como
hidroxilos, carboxilos, etc. El material se expone a esterilizar a un 5-10% de óxido de etileno en
dióxido de carbono a 50-60º en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es
necesario someterlo después a un período de aireación debido a su carácter mutagénico. Es un
agente efectivo en la esterilización de material termolábil como prótesis, catéteres, etc.

19. b) Formol o formaldehído: Es un gas fácilmente soluble en agua que se utiliza al 40%
(formalina). Usado en forma gaseosa y en cámara cerrada se emplea en la esterilización hospitalaria y
en la industria farmacéutica. También es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas
altamente contaminadas que una vez tratadas deben airearse.
c) Glutaraldehído: Se emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se
emplea sobre todo en la esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria.
La actividad de los compuestos derivados de metales pesados (como plata, mercurio, etc.,) se debe a
la formación de sales que se disocian con dificultad de los grupos sulfhidrilos de las proteínas.
d) Nitrato de plata y derivados argénticos: Son buenos bactericidas. El nitrato de plata se
ha utilizado en el tratamiento de quemaduras en soluciones al 0,5% y en la profilaxis de la oftalmia
neonatorum por Neisseria gonorrhoeae.
e) Derivados mercuriales: El más utilizado como desinfectante de la piel es el
mercurocromo, no es tóxico y sigue siendo activo en presencia de materia orgánica.
f) Agua oxigenada (peróxido de hidrógeno): Es un agente oxidante de efecto fugaz por
ser descompuesto por las catalasas de los tejidos.
g) Permanganato de potasio: Agente oxidante que se inactiva en presencia de materia
orgánica. Es poco utilizado. En dermatología es utilizado por su propiedad antifúngica.
h) Derivados clorados: Se inactivan en presencia de materia orgánica. El cloro y
derivados son agentes oxidantes muy usados en la potabilización del agua en forma de cloro gaseoso
en grandes establecimientos, y en forma de hipoclorito es utilizado para descartar material biológico
(sangre, suero, etc.) La cloramina es un antiséptico menos potente que el hipoclorito, de acción más
lenta pero mejor tolerada en la aplicación tópica.
i) Derivados yodados: Son agentes oxidantes que se usan en forma de solución acuosa,
combinándolos con detergentes o sustancias orgánicas. Los yodoformos son compuestos que se
liberan progresivamente. El Yodo se encuentra en la polivinilpirrolidona (povidona yodada). Existen
también soluciones alcohólicas.

20. j) Alcoholes: Actúan desnaturalizando proteínas. Su acción es rápida, pero se evaporan
con facilidad. El alcohol etílico se utiliza en antisepsia a una concentración del 70%, a esta
concentración se reduce más la tensión superficial de la célula bacteriana facilitando el proceso de
desnaturalización.
k) Fenoles: Actúan precipitando proteínas. El hexaclorofeno y el fenol no se emplean por
su toxicidad. Otros derivados fenólicos son los cresoles, los que unidos a jabones originan
compuestos estables.
l) Clorhexidina: Es un derivado fenólico que actúa alterando la permeabilidad de la
membrana celular bacteriana. Tiene inactivación rápida y es bien tolerado por la piel. Se emplea
mucho en hospitales en el lavado de la superficie cutánea en forma de solución (acuosa o alcohólica)
o asociada a detergentes no iónicos.
m) Detergentes aniónicos: Actúan desorganizando las membranas citoplasmáticas.
Tienen escaso poder bacteriostático. Se pueden mejorar combinándolos con desinfectantes u otras
sustancias tensoactivas como lauril sulfato.
n) Detergentes catiónicos: Tienen acción antiséptica, se inactivan en contacto con jabón,
algodón y materia orgánica. Son poco usados.
o) Glicoles: Propilenglicol y Etilenglicol, se aplican por medio de unos aparatos llamados
glicosatos o en forma de aerosoles para desinfección ambiental.
Los productos descritos como estériles deben satisfacer el llamado Ensayo de esterilidad.
Estos productos se esterilizan en su recipiente definitivo, excepto en los casos en que el producto, a
causa de su naturaleza, no pueda ser sometido al correspondiente tratamiento en su recipiente. Los
productos que no pueden ser esterilizados en su recipiente definitivo se preparan por métodos y en
condiciones determinadas para evitar contaminación microbiana después de someter a un proceso
de esterilización adecuada todos sus componentes, si es posible, así como los recipientes y cierres.

21. La eficacia de los procedimientos de esterilización está notablemente influenciada por el grado
inicial de contaminación microbiana, debiéndose observar las precauciones siguientes:
✓ Las condiciones de trabajo deben controlarse de forma adecuada tratando de evitar la
introducción y crecimiento de microorganismos,
✓ El nivel de contaminación microbiana de las materias primas, del equipo y de todo el
material utilizado debe ser el menor posible antes de la esterilización.
✓ Debe efectuarse un control microbiológico de las materias primas susceptibles de
presentar un nivel elevado de contaminación a causa de su naturaleza o de su modo de
preparación.
✓ Cada proceso concreto de esterilización debe ser validado.
✓ Los procedimientos y las precauciones empleadas deben ser tales que se alcance en el
producto final un nivel teórico de contaminación, correspondiente a no más de 1
microorganismo vivo por 1 x 106 unidades sometidas a la esterilización.
Para todos los métodos de esterilización, las condiciones críticas de la operación deben
controlarse de forma que aseguren que todas las unidades del lote hayan sido sometidas, al menos, a
las condiciones mínimas de esterilización. La duración del tratamiento se mide a partir del momento
en el que se consiguen las condiciones prescritas para la esterilización en el conjunto de productos a
esterilizar.
Esterilización por vapor: En el autoclave, la temperatura y la presión de vapor deben medirse
independientemente con una precisión superior a ± 2° C y a ± 10 KPa (0,1 atm) respectivamente;
preferentemente se debe obtener un registro continuo de estos parámetros. La temperatura debe
medirse en la parte más fría del autoclave que está situada generalmente cerca de la conducción de
salida del vapor. La temperatura debe medirse también, preferentemente, en dos o más recipientes,
situados en diferentes lugares del autoclave, de forma que las temperaturas medidas representen en
lo que cabe los valores extremos de todos los recipientes del lote. Cuando es difícil que en un
autoclave se consiga rápidamente el desplazamiento del aire por el vapor (por ejemplo, al tratar
materiales porosos, textiles, utensilios de varios tipos), es necesario evacuar el aire del autoclave
antes de la admisión del vapor. La eficacia del procedimiento puede ser confirmado por la utilización
de indicadores biológicos apropiados.
Esterilización por calor seco: El horno debe normalmente estar provisto de un sistema de
circulación de aire forzado y llenarse de forma que se alcance una distribución uniforme de la
temperatura en toda la carga. La temperatura se debe medir y, preferentemente, registrar en al
menos dos lugares en los que haya menos probabilidades de alcanzar las condiciones de
esterilización. La eficacia del procedimiento puede confirmarse utilizando indicadores biológicos
adecuados.

22. Esterilización por radiaciones: Durante el procedimiento de esterilización, la dosis de
radiación debe ser controlada regularmente. Este control implica procedimientos dosimétricos,
independientes de la tasa de radiación, que permitan una medida cuantitativa de la dosis recibida por
el propio producto. Debe demostrarse que la dosis de radiación aplicada es eficaz y apropiada para la
naturaleza del producto a esterilizar y su material de acondicionamiento. La eficacia del
procedimiento puede ser confirmada por la utilización de indicadores biológicos adecuados. El
sistema de dosimetría se compara con la ayuda de métodos físicos, químicos o microbiológicos con el
mismo sistema dispuesto en una instalación de radiación de referencia. Este control se efectúa cada
vez que se realiza un cambio en los procedimientos de radiación y, al menos, una vez al año.
Esterilización por gases: Los parámetros físicos y químicos significativos (tiempo, temperatura,
humedad relativa, presión, concentración del gas) deben medirse y registrarse con la mayor
frecuencia posible. Los productos que no pueden ser esterilizados en su recipiente definitivo
necesitan precauciones especiales. Deben ser preparados en condiciones concebidas para evitar
cualquier contaminación microbiana. Los locales de producción y el sistema de ventilación deben
estar diseñados para reducir al máximo la contaminación microbiana y deben someterse
periódicamente a un control apropiado. El equipo, los recipientes y los tapones y, si es posible, los
componentes deben ser sometidos a un proceso de esterilización adecuada.
Filtración a través de filtros que retienen bacterias: Las disoluciones pueden ser filtradas a
través de membranas de porosidad nominal inferior o igual a 0,22 µm, o a través de otro tipo de filtro
que retenga bacterias. Se deben tomar precauciones que aseguren el mantenimiento de las
propiedades del filtro durante su utilización. En el caso de la filtración de un líquido en el que se
pueda desarrollar un crecimiento microbiano, los mismos filtros no deben ser utilizados si la duración
del procedimiento es superior a un día de trabajo.
Preparación en condiciones asépticas: Los productos que se someten al proceso de filtración
descrito anteriormente y algunos otros, son preparados en condiciones asépticas. Pueden someterse
a un tratamiento final por el calor compatible con su termoestabilidad, si este tratamiento se
demuestra justificado. Las condiciones de preparación pueden, en ciertos casos, ser controladas con
la ayuda de un medio de cultivo apropiado, previamente esterilizado repartido en las mismas
condiciones que el producto a examinar; el medio se incuba y después se examina a fin de descubrir
una eventual contaminación.
Los indicadores biológicos son preparaciones de microorganismos seleccionados por su alta
resistencia a uno o más métodos de esterilización. Pueden utilizarse para confirmar la eficacia de un
proceso de esterilización. El indicador biológico tiene que ser claramente distinguible del producto a
esterilizar, con el fin de evitar cualquier mezcla o contaminación del producto.

23. El crecimiento de los microorganismos testigos que son sometidos al proceso de esterilización
demuestra que éste es insuficiente. Un indicador biológico puede estar constituido por unidades del
producto a examinar inoculadas artificialmente o por sustancias fibrosas, arena, vidrio, láminas
metálicas que sirven de soporte a los microorganismos testigo, simulando los productos
contaminados. Los microorganismos testigo deben depositarse en sitios considerados como los más
difíciles de esterilizar. La elección de los microorganismos testigos se basa en los criterios siguientes:
✓ La resistencia de la cepa testigo al método particular de esterilización debe ser grande,
comparada con la resistencia de todos los microorganismos patógenos y la de los
contaminantes microbianos del producto.
✓ La cepa testigo no debe ser patógena.
✓ La cepa testigo debe ser cultivada fácilmente.
Un indicador biológico se caracteriza por la cepa de microorganismos testigo que incorpora, el
número de unidades formadoras de colonias por unidad de indicador, el valor D (1) y la fecha de
caducidad. Sólo los microorganismos indicados deben estar presentes. Se debe precisar toda la
información referente al medio de cultivo y a las condiciones de incubación.

24. Esterilización por vapor. Las esporas de Bacillus stearothermophilus, por ejemplo, ATCC 7953
O CIP 52.81, se recomiendan como microorganismos testigos. El número de esporas viables debe ser
superior a 1 x 10 exp5 por unidad de indicador y el valor D a 121° C debe ser de 11/2 min
aproximadamente.
Esterilización por calor seco. Las esporas de Bacillus subtilis, por ejemplo, var. niger ATCC
9372 0 CIP 77.18, se recomiendan como microorganismos testigos. El número de esporas viables
debe ser superior a 1 x 10 exp5 por unidad de indicador y el valor D debe ser a 160° C de 5 a 10 min
aproximadamente.
Esterilización por gases. Las esporas de Bacillus subtilis, por ejemplo, var. niger ATCC 9372 0
CIP 77.18, o las esporas de Bacillus stearothermophilus ATCC 7953 o CIP 52.81, se recomiendan como
microorganismos testigos. Es esencial que el indicador biológico sea capaz de revelar una
humidificación insuficiente en el esterilizador y en el producto para asegurarse que incluso los
microorganismos deshidratados son inactivados.
Esterilización por radiaciones. Las esporas de Bacillus pumilus, por ejemplo, ATCC 14884 ó CIP
3.83, se recomiendan para una dosis mínima de 25 KGy (2,5 Mrad). EI número de esporas debe ser de
1 x 10 exp7 a 1 x 10 exp8 por unidad de indicador y el valor D debe ser de 3 KGy (0,3 Mrad)
aproximadamente. Otras cepas formadoras de esporas (mutantes de Bacillus cereus, por ejemplo, SSI
C1/1), Bacillus sphaericus, por ejemplo (SSI C1A) que presentan una mayor resistencia, pueden ser
utilizadas para dosis de radiación más alta.
(1) El valor D es el valor de un parámetro de esterilización (duración o dosis absorbida)
necesario para reducir a un 10% el valor inicial del número de microorganismos viables. El valor D
sólo adquiere significación bajo condiciones experimentales bien definidas.
El Ensayo de Esterilidad, se aplica a las sustancias, preparaciones y objetos que, según la
Farmacopea, deben de ser estériles, pero un resultado favorable solamente significa que no ha sido
encontrado ningún microorganismo en la muestra examinada en las condiciones del ensayo. La
extensión de este resultado a todo un lote de producto necesita la certeza de que todas las unidades
que lo componen han sido preparadas de tal manera que hay un alto grado de probabilidad de que
hubieran satisfecho el ensayo. Es evidente que esto depende de las precauciones tomadas en el curso
de la fabricación. Para los productos sometidos a un proceso de esterilización en sus recipientes
finales y sellados, la prueba física, con fundamento biológico y registrado automáticamente que
testimonia el correcto desarrollo del tratamiento de esterilización en la totalidad del lote, es de una
fiabilidad superior a la del ensayo de esterilidad. Este último sin embargo es el único método analítico
disponible para cualquier autoridad que tenga que controlar la esterilidad de un producto. Un ensayo
de esterilidad debe realizarse en las condiciones estudiadas para eliminar todo riesgo de
contaminación accidental del producto en el curso del ensayo, por ejemplo, utilizando campanas de
flujo laminar de aire estéril. Las precauciones tomadas para evitar tal contaminación no deben
afectar a los microorganismos cuya presencia deba ponerse de manifiesto en el ensayo.

25. La eficacia de las precauciones observadas debe ser regularmente verificada por un control del
aire y de las superficies de trabajo, efectuando paralelamente controles de preparaciones de las que
se sabe que son estériles. Los medios de cultivo adecuados para el crecimiento de bacterias
anaerobias y aerobias y para hongos, así como sus métodos de preparación se describen más
adelante. Pueden utilizarse otros medios siempre que haya sido demostrada su capacidad para
asegurar el crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Deben satisfacer los ensayos que
se indican, efectuados sobre cada lote de los medios elegidos, antes de utilizarlo, o paralelamente al
ensayo del producto a examinar.
Esterilidad. Se incuban en cada caso durante 7 días como mínimo, a 30-35 °C, porciones de los
medios destinados a evidenciar las bacterias y a 20-25° C, las porciones de los medios destinados
principalmente a evidenciar contaminación por hongos. No deben presentar ningún crecimiento
microbiano.
Propiedades nutritivas. Se siembran tubos de los medios escogidos respectivamente con 100
microorganismos viables aproximadamente (aerobios, anaerobios y hongos) y se incuban durante 7
días como máximo a las temperaturas indicadas arriba (Esterilidad). El medio es adecuado si permite
un crecimiento rápido y abundante de los microorganismos que correspondan.
Si el medio destinado principalmente a la búsqueda de hongos sirve también para el ensayo de
esterilidad bacteriana, debe ser sometido a un ensayo con ambos tipos de microorganismos. Si en el
curso de la incubación, el crecimiento microbiano es similar en presencia y en ausencia del producto
a examinar (crecimiento precoz y abundante), este último no tiene actividad antimicrobiana y el
ensayo de esterilidad puede ser efectuado sin modificación. Si los cultivos que contienen el producto
a examinar presentan un crecimiento más débil, retardado, o totalmente inhibido respecto a los
cultivos que no contienen este producto, éste último tiene una actividad antimicrobiana por lo que
debe ser eliminado por filtración, por dilución, o por neutralización, antes o durante el curso del
ensayo de esterilidad. La eficacia de la eliminación debe de ser controlada volviendo a repetir el
ensayo.

26. 3. COLORACIÓN O TINCIÓN DE GRAM
Esta tinción fue desarrollada empíricamente por el médico danés Hans Christian Joachim Gram
en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tinción apenas se ha modificado y es uno de los primeros
pasos que se realiza para cualquier identificación bacteriana. La técnica es capaz de diferenciar dos
grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (+) y Gram negativas (-).
En el estudio de la ciencia que nos ocupa, la microbiología, es fundamental la observación de
los microorganismos. Esta observación se hace necesaria para su clasificación e identificación. Para
ello se usa el microscopio tanto óptico como electrónico, y en sus diversas variantes (microscopio de
rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de fase, de campo oscuro). Nosotros abordaremos
únicamente el microscopio óptico compuesto de dos lentes (condensador y objetivo).
Un microscopio suele tener cuatro objetivos, pero en microbiología se usa preferentemente el
objetivo de inmersión, aunque para visualizar una preparación siempre se recomienda empezar por
el objetivo de x10 y una vez localizada la muestra ir subiendo poco a poco el nivel de aumentos. Al
microscopio óptico hay dos formas de ver las preparaciones:

27. 1. Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de que las
preparaciones son muy difíciles de ver debido al poco contraste del medio que les rodea.
2. Preparaciones fijadas y teñidas con el objetivo de inmersión. Se matan las bacterias,
pero son más visibles y su contraste es superior y de mayor calidad.
3.
Entre los tipos de preparaciones del segundo tipo, hay un método de tinción que se usa
universalmente para distinguir a las bacterias en dos grandes grupos: se trata de la Coloración o
Tinción de Gram. Es una tinción diferencial que basa su distinción en la estructura diferente de la
pared bacteriana de las bacterias Gram (+) (pared más gruesa, y una sola capa de peptidoglucano) y
de las Gram (-) (pared más delgada y dividida en dos partes).
Para explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis fundadas
en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos. Los dos grupos bacterianos
que distingue esta técnica difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram (+)
se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las
bacterias Gram (-) perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán
de rosa debido a la safranina.

28. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias Gram
(+) poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las Gram (-),
recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la
célula. Una de las precauciones al realizar esta tinción es la de trabajar con cultivos en fase
exponencial. De lo contrario se pueden obtener resultados falsos. Por ejemplo, las bacterias Gram (+)
en fase estacionaria pueden aparecer como Gram (-).
Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería
de colorantes para realizar la tinción de Gram presentan algunas diferencias respecto a los
preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio
de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos
patrón de los dos tipos (Gram (+) y Gram (-)) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el
resultado de todas las tinciones que se hagan mientras dure esos colorantes son fiables. Otra
posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro.
Los pasos más estandarizados a nivel mundial, son los siguientes:
a. Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca
una gota de agua destilada a la que, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se
lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se
extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor, calentando
suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.

29. b. Coloración
✓ 1 minuto en Cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
✓ se lava con agua destilada
✓ 1 minuto en solución de Lugol (mordiente)
✓ se decolora con Alcohol de 95º (decolorante)
✓ se lava con agua destilada
✓ 1 minuto en Fucsina o Safranina (colorante de contraste)
✓ se lava con agua corriente
✓ se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro
Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite de
cedro y observar al microscopio con el objetivo de inmersión. A continuación, brindaremos algunos
matices de los colorantes empleados:
1. Colorante básico Cristal Violeta o Violeta de Genciana: Es el primer colorante que se
echa sobre el frotis previamente preparado. Es un colorante selectivo que tiñe a todos los
microorganismos cargados negativamente. Se deja actuar durante un minuto y se lava con agua a
continuación.
2. Solución de Lugol: Producto compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente,
que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre
el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases Se
deja actuar un minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el colorante del
todo.
3. Alcohol 96º: El alcohol retira el colorante de las Gram (-) debido a su diferente
estructura de la pared celular (tamaño de los poros). A veces se usa otro agente decolorante o
disolvente orgánico como alcohol-acetona (1:1).

30. 4. Safranina o Fucsina: Colorantes básicos diferenciadores. Tiñen a las bacterias Gram (-).
Se dejan actuar treinta segundos y se lavan con agua. Siempre se añade esta contra tinción con
fucsina o eosina para teñir las bacterias decoloradas de color rojo y hacerlas más visibles. Se
denominan bacterias Gram positivas a aquellas que retienen la tinción azul y bacterias Gram
negativas a las que quedan decoloradas. Algunas bacterias presentan capacidad variable de tinción
de Gram y se llaman Gram variables. Bacterias Gram positivas típicas son los estafilococos que
producen forúnculos; Gram negativas representativas son la Escherichia coli de la flora intestinal o los
bacilos de la tos ferina; Gram variables son los bacilos de Koch de la tuberculosis.
Como puede verse en definitiva y una vez finalizada la tinción, las bacterias Gram (-) estarán
teñidas de un color rosáceo, y las Gram (+) de un color violeta. Esto sirve para diferenciarlas
claramente al microscopio óptico. Debe utilizarse el objetivo de inmersión. Se coloca una gota de
aceite de cedro sobre la preparación, se enfoca, preferentemente, con el micrométrico. Después de
utilizar el objetivo de inmersión debe limpiarse con xilol.
La tinción de Gram, permite la demostración de bacterias y sus características tintoriales con la tinción de Gram.
En la imagen una tinción de Gram en la que se observa la presencia de cocos gram positivos dispuestos en parejas y
cadenas (Streptococcus) y en acúmulos (Staphylococcus
aureus)
"SOMOS LO QUE HACEMOS REPETIDAMENTE. EXCELENCIA, POR LO TANTO, NO ES UN ACTO SINO
UN HABITO"
ARISTOTELES

31. Enterobacter Gram (-)