El documento describe los principales tipos de ensayo inmunoenzimático ELISA y la técnica de Western blot. ELISA incluye ELISA directo, indirecto, sandwich y competitivo. Western blot implica electroforesis de proteínas, transferencia a membrana, inmunotinción con anticuerpos primarios y secundarios, y detección de las bandas mediante quimioluminiscencia, fluorescencia o colorimetría.

1. ELISA

2. Es el acrónimo de
Enzyme-Liked
Immunosorbent
Assay
Se basa en el uso de Ags o AC marcados con una enzima, de
forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática
Al estar uno de los componentes marcado con una
enzima e insolubilizado sobre un pocillo la reacción Ag-Ac
quedará inmovilizada y será fácilmente revelada
mediante la adición de un sustrato específico que al
actuar, la enzima producirá un color observable o
cuantificable mediante el uso de un espectofotómetro o
un colorímetro

3. FASES DE UN ENSAYO ELISA
Unión del AG o AC a
los pocillos
Addición de la muestra
problema
Unión del AG o AC
específicos al Ag o AC
tapizado
lavado
lavado
Addición del AC
secundario marcado
con una enzima
Addición del sustrato de
la enzima
La enzima convierte el
sustrato

4. TIPOS DE ELISA

5. ELISA DIRECTO
permite la detección del antígeno con un anticuerpo primario unido
a una enzima.
Pasos:
• Recubrir la superficie de la placa con la muestra;
• Incubación de la placa con el anticuerpo primario conjugado con
enzima;
• Lavado para la eliminación de anticuerpos no unidos de la placa;
• Adición del sustrato requerido por la reacción enzimática;
• Detección de las señales producidas desde la placa..
Enzimas: HRP (peroxidasa de rábano picante) y fosfatasa alcalina.
sustratos de HRP: OPD (dihidrocloruro de o-fenilendiamina), TMB (3, 3 ', 5, 5'-
tetrametilbencidina) y ABTS (2, 2'-Azinobis [3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico] -
diamonio sal).
Sustrato de la fosfatasa alcalina es PNPP (fosfato de p-nitrofenilo, sal disódica).

6. ELISA INDIRECTO
Utiliza dos anticuerpos para la detección: anticuerpo
primario y secundario
Pasos:
1. Recubrir la superficie de la placa con la muestra;
2. Incubación de la placa con el anticuerpo primario;
3. Lavado para eliminar los anticuerpos no unidos de la placa;
4. Incubación de la placa con el anticuerpo secundario conjugado con
la enzima de detección;
5. Lavado para eliminar los anticuerpos no unidos de la placa;
6. Adición del sustrato requerido por la reacción enzimática;
7. Detección de las señales producidas desde la placa..
el anticuerpo secundario es principalmente un anticuerpo
policlonal, anti-especie.

7. ELISA sandwich
el antígeno queda inmovilizado entre dos anticuerpos, uno de captura y otro
de detección también conocidos como pares de anticuerpos, que se unirán a
dos epítopos distintos de un mismo antígeno.
1º El anticuerpo de captura se inmoviliza sobre la placa
2º Se añade la muestra que contiene el antígeno de interés que se unirá al
anticuerpo de captura
3º Se añade el anticuerpo de detección que se unirá al antígeno unido a su
vez al anticuerpo de captura.
4º En caso de que el anticuerpo de detección vaya conjugado a una enzima,
procederemos directamente con el 5º paso. En caso contrario, será necesario
añadir un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al
anticuerpo de detección.
5º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una
señal visible que permitirá la detección y/o cuantificación del antígeno de
interés

8. ELISA COMPETITIVO
Se utiliza generalmente para detectar y/o cuantificar antígenos presentes en muy bajas cantidades.
• 1º El antígeno de referencia se inmoviliza sobre la placa.
• 2º Por otro lado, un exceso de anticuerpo primario sin marcar se incuba con la muestra que contiene el antígeno de
interés, dando lugar a la formación de complejos antígeno-anticuerpo
• 3º Se añade la mezcla antígeno-anticuerpo a la placa, donde el antígeno de referencia competirá con el antígeno de la
muestra por unirse al anticuerpo
• 4º Se lava la placa eliminando los complejos antígeno-anticuerpo solubles
• 5º Se añade a la placa un anticuerpo secundario marcado con una enzima que se unirá al anticuerpo primario anclado
al antígeno de referencia.
• 6º Se añade el sustrato que al reaccionar con la enzima proporcionará una señal visible que será inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno de interés presente en la muestra.

10. Lectura e interpretación
de los resultados

11. Western blot

12. • es una técnica de laboratorio utilizado para detectar una
proteína específica en una muestra de sangre o tejido
• El método implica el uso de electroforesis en gel para
separar las proteínas de la muestra. Las proteínas
separadas se transfieren del gel a la superficie de una
membrana. La membrana se expone a un anticuerpo
específico contra la proteína en estudio. La unión del
anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o
químico.

13. • Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el
estudio de proteínas. Este método permite la detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad del
Western Blot se logra mediante el uso de un anticuerpo que reconoce
y se une a un epítopo único de la proteína de interés.

14. Pasos
1.Preparación de la muestra
2.Electroforesis
3.Transferencia a una
membrana
4.Inmunotinción
5.Detección de las bandas

15. 1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Extracción de las proteínas de las muestras biológicas mediante
disrupción mecánica o química

16. mayoría de los Western blot requieren de proteínas desnaturalizadas
dodecilsulfato de sodio (SDS): es un agente desnaturalizante que ayuda a descomponer
la proteína en su estructura de aminoácidos, y también recubre la proteína con cargas
negativas en una proporción de masa uniforme.
beta-mercaptoetanol o ditiotreitol (DTT): son agentes reductores que rompen sus
enlaces sulfuro, y también descomponen la proteína en una estructura lineal de
aminoácidos primarios

17. 2. electroforesis
• El tipo de electroforesis más comúnmente usado en Western Blot es el abreviado
SDS-PAGE.
SDS es el agente desnaturalizante que se agrega al tampón durante este
procedimiento.
PAGE significa electroforesis en gel de poliacrilamida
La estructura del gel puede controlarse
alterando el porcentaje de acrilamida. Al
aumentar el porcentaje total de
acrilamida, los poros de la matriz del gel
se vuelven más estrechos, un porcentaje
de acrilamida más bajo resulta en poros
más grandes de la matriz del gel

18. Las muestras se cargan en los pocillos del gel
mediante una pipeta. Normalmente se cargan de
20 a 40 µg de proteína total por carril.
Una vez finalizada la carga, el gel se somete a un
campo eléctrico generado por una fuente de
alimentación.
El tampón utilizado durante la electroforesis,
contiene Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor
electricidad) y SDS (mantiene las proteínas
cargadas negativamente).
El progreso en el gel se monitoriza observando el
frente coloreado por el colorante presente en el
tampón de carga y la posición de los marcadores
de tamaño siempre que estos estén teñidos

19. 3. TRANSFERENCIA
El principio de la transferencia es similar a la
electroforesis, ya que se “transfiere” del gel las
proteínas cargadas negativamente hacia un
polo positivo dentro de un campo eléctrico.
Para esto el gel se coloca adyacente a una
membrana porosa, y este sándwich de
membrana y gel se agrega a un casete de
transferencia con la membrana más cercana
al polo positivo.
• La membrana de PVDF, ofrece una mayor resistencia mecánica, resistencia la SDS y una mayor unión que la nitrocelulosa.
• La membrana de nitrocelulosa tiene la ventaja de proporcionar un menor ruido de fondo y que no requieren un pretratamiento con metanol

20. 4. INMUNOTINCIÓN
se usan anticuerpos específicos para
que solo se visualice la proteína diana
1° bloquear el espacio vacío en la
membrana con una proteína neutral.
Para esto se incuba con la albúmina
de suero bovino (BSA).
el BSA se une a la membrana para
cubrir los espacios libres, para que el
anticuerpo no se adhiera a estas
áreas más adelante.

21. • 2° Después del proceso de bloqueo, la membrana se incuba con el anticuerpo
primario, se pueden utilizar, tanto anticuerpos primarios monoclonales como
policlonales. Un periodo de incubación de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente, pero también es posible una incubación a 4ºC durante toda la noche.
• 3° La membrana debe lavarse para eliminar cualquier anticuerpo residual. Entre 3-5
lavados con TBST es suficiente durante aproximadamente 10 minutos cada lavado.
• 4° la membrana se tratará con el anticuerpo secundario que se conjuga con una
molécula que se puede visualizar fácilmente durante aproximadamente 1 hora a
temperatura ambiente.
• 5° se debe lavar la membrana a fondo para eliminar el anticuerpo secundario

22. 5. DETECCIÓN
Hay tres tipos de detección que
se usan comúnmente en el
Western Blot:
• Quimioluminiscencia
• Fluorescencia
• Colorimetría

23. Quimioluminiscencia:
Los métodos de detección de quimioluminiscencia utilizan
comúnmente anticuerpos secundarios conjugados con
peroxidasa (HRP). La reacción entre el enzima cataliza una
reacción con un sustrato para producir una señal luminiscente
que se captura en la película o captada de forma digital
utilizando una cámara CCD.

24. Fluorescencia
El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo, que cuando es
excitad emite luz. La luz emitida, se detecta mediante un
dispositivo capaz de medir la fluorescencia o mediante una
cámara CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su análisis.

25. Colorimetría
• Los métodos colorimétricos utilizan un anticuerpo secundario
que ha sido conjugado previamente a un enzima (peroxidasa o
fosfatasa alcalina). La reacción de la enzima con el sustrato
produce un producto insoluble que es visible en la membrana.
La cantidad de colorante convertido es proporcional a la
cantidad en la muestra. La intensidad de la tinción puede ser
medida por espectrofotometría o por un densitómetro.