Métodos de detección y cuantificación de proteínas en biología molecular

1. MÉTODOS PARA ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS EN BIOLOGÍA
MOLECULAR

2. PROTEÍNAS
Son macromoléculas compuestas por
una o más cadenas polipeptídicas
plegadas en una forma tridimensional
característica.
Cadenas polipeptídicas: son
cadenas lineales de aminoácidos (de
longitud y secuencias variables)
enlazados por enlaces peptídicos.

3. ESTRUCTURA
La conformación tridimensional de
una proteína está determinada por la
secuencia de aminoácidos en su
estructura primaria y las
interacciones no covalentes
intramoleculares.
La función de una proteína a menudo
se deriva de su estructura
tridimensional.

4. • Determinada por la secuencia de aminoácidos en la
cadena proteica (número y orden de los aa que la forman).
Estructura primaria
• Plegamiento de la cadena polipeptídica por la formación
de puentes de hidrógeno (Ejemplos: hélices alfa y hojas
beta).
Estructura secundaria
• Arreglo tridimensional de los residuos de aminoácidos.
Estructura terciaria
• Unión de enlaces débiles (no covalentes) de varias
cadenas polipeptídicas con estructura terciaria para formar
un complejo proteico
Estructura cuaternaria

5. FUNCIONES
• Proteínas estructurales.
• Proteínas andamio.
• Proteínas catalíticas
(enzimas).
• Proteínas de transporte de
membrana.
• Proteínas regulatorias.
• Proteínas de señalización.
NOTA: Una proteína puede cumplir
mas de un tipo de función.

6. ¿QUÉ ES UN ANTICUERPO?
Los anticuerpos (también denominados
con inmunoglobulinas ) son proteínas que
forman parte del sistema inmune y circulan
por la sangre.
Se producen cuando reconocen sustancias
extrañas para el organismo.

7. ESTRUCTURA DE UN
ANTICUERPO
La estructura de un anticuerpo consiste en dos
cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, y en
su extremo existe una región hipervariable.
La región hipervariable es la que cambia de un
anticuerpo a otro, y permite tener una gran
diversidad de anticuerpos que podrán
responder a la enorme variedad de antígenos.

8. ANTÍGENO
Cualquier sustancia extraña que al entrar
en contacto con el organismos produce una
respuesta inmunitaria contra ella.
Incluyen:
• Toxinas
• Sustancias químicas
• Bacterias
• Virus
• Otras

9. EPÍTOPO (EPITOPE)
Los antígenos presentan una estructura tridimensional y a su vez una
región específica que es reconocida por los anticuerpos para su unión a este.
También se le denomina determinante antigénico.

10. INTERACCIÓN EPÍTOPO-
ANTICUERPO
El reconocimiento del antígeno por el anticuerpo tiene lugar en un locus
específico constituido por los extremos de la cadena ligera y pesada, en la
que encaja el antígeno y que permite se ponga de manifiesto toda una serie
de fuerzas que mantendrán unidos antígeno y anticuerpo.

11. Existe una variedad de anticuerpos
para cada posible antígeno, ya que
un mismo antígeno puede presentar
diferentes epítopos.

12. APLICACIONES DE LOS
ANTICUERPOS

13. TÉCNICAS BIOLOGÍA MOLECULAR

14. ELISA
El ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima (ELISA del ingles Enzyme-
Linked ImmunoSorbent Assay) es un método utilizado para detectar
cuantitativamente un antígeno en una muestra.
Se pueden analizar sustancias específicas de interés en lisados celulares,
muestras de sangre, alimentos y más.

15. La prueba se hace usando una superficie sólida a la que los anticuerpos u antigenos
se adhieren.
Se emplean anticuerpos ligados a enzimas a fin de detectar y medir la cantidad de
una sustancia en una solución (como el suero).
En la etapa final, se produce una reacción enzimática que causa un cambio de color
que puede leerse mediante el uso de una máquina especial.

16. ANTICUERPOS CONJUGADOS
Un anticuerpo conjugado es un anticuerpo monoclonal o policlonal unido a un
marcaje y utilizado para detección en una amplia gama de técnicas de
análisis. La utilidad específica de un anticuerpo secundario depende de sus
sondas conjugadas
Los anticuerpos pueden estar conjugados a un fluoróforo (por ejemplo FITC) o bien a
una enzima cromogénica (como por ejemplo la peroxidasa de rábano; horse-radish
peroxidase HRP).

17. ELISA Directo
El antígeno se une al fondo del pocillo
de la microplaca y, a continuación, se
añade un anticuerpo específico del
antígeno, conjugado a su vez a una
enzima u otra molécula que permita su
detección.
ELISA Indirecto
El antígeno se une al fondo del pocillo
de la microplaca y posteriormente se
añade un anticuerpo específico del
antígeno. A continuación se une al
primer anticuerpo un anticuerpo
secundario conjugado con una enzima
u otra molécula de detección.

18. ELISA Competitivo
Se une al fondo del pocillo de la
microplaca un antígeno de referencia.
Se añade a los pocillos la muestra más
el anticuerpo y si existe un antígeno
presente en la muestra, compite con el
antígeno de referencia por la unión al
anticuerpo
El material no unido se elimina con los
lavados.
Cuanto más antígeno hay en la muestra,
menos anticuerpo termina unido al fondo
de los pocillos a través del antígeno de
referencia y, por tanto, menos señal.

19. ELISA Tipo Sándwich
Se usan dos anticuerpos específicos de
dos epítopos diferentes presentes en el
antígeno diana.
El anticuerpo de captura se une al fondo
del pocillo de la microplaca uniéndose a
uno de los epítopos del antígeno.
El anticuerpo de detección se une a un
epítopo diferente del antígeno y está
conjugado a una enzima que permite su
detección. (Si el anticuerpo de detección
no está conjugado, entonces se necesita
un anticuerpo de detección secundario
conjugado con una enzima).

21. WESTERN BLOT (INMINOBLOT)
Esta técnica es empleada para detectar una proteína específica en una
muestra.
El método implica el uso de electroforesis en gel para separar las
proteínas de la muestra. Las proteínas separadas se transfieren del gel
a la superficie de una membrana. La membrana se expone a un
anticuerpo específico contra la proteína en estudio. La unión del
anticuerpo se detecta usando un marcador radiactivo o químico.

22. 1.- Lisis: Las células o los tejidos se tratan con un tampón de lisis y seguidamente se
degradan mecánicamente para liberar las proteínas
2.-Cuantificación: Determinar la concentración de proteínas.
3.- Condiciones reductoras y desnaturalizantes las muestras son normalmente
tratadas con agentes que rompen las estructuras tridimensionales de las proteínas
(dímeros, estructuras terciarias)

23. 4.- Electroforesis: Método que
permite separar las proteínas bajo un
campo eléctrico de acuerdo a su
movilidad electroforética.
Las proteínas se separan en función
de su talla, o peso molecular.
Las proteínas de menor tamaño
quedan menos retenidas en la matriz
del gel y por tanto migran mas
rápidamente.

24. 5.- Transferencia: Las proteínas cargadas negativamente migran hacia el polo
positivo bajo el efecto de un campo eléctrico. Se intercala una membrana entre el gel
y el electrodo positivo y las proteínas se adhieren a la membrana siguiendo la misma
disposición que en el gel.
Las membranas pueden ser de nitrocelulosa o polifluoruro de vinilideno (PVDF).

25. 6.- Inmundetección: El uso de
anticuerpos específicos
soluciona el problema
detectando únicamente la
proteína de interés

28. Densitometría
En Western Blot, se utiliza para cuantificar la cantidad de proteína que se encuentra
en una determinada banda.

30. INMUNOHISTOQUÍMICA
Método de laboratorio para el que se usan
anticuerpos a fin de determinar si hay ciertos
antígenos (marcadores) en una muestra de
tejido. Por lo general, los anticuerpos van
unidos a una enzima o un tinte fluorescente.
Cuando los anticuerpos se unen al antígeno en
la muestra de tejido, se activa la enzima o el
tinte y se observa el antígeno al microscopio.

31. El procedimiento parte de secciones de tejido
previamente fijado. Inmediatamente después se incuban
en una solución de bloqueo que satura los posibles
sitios de unión inespecífica.
Tras cada paso de unión de anticuerpos o del complejo
avidina-biotina-peroxidasa se procede a lavar los cortes
en una solución tamponada de fosfato (), en la que
también van disueltos los anticuerpos.
La reacción de la peroxidasa convierte unos sustratos,
la diaminobencidina y el peróxido de hidrógeno, en un
producto insoluble y coloreado visible con el
microscopio óptico.

34. INMUNOFLUORESCENCIA
Se basa en las propiedades de los fluorocromos. No es una inmunohistoquímica
puesto que no se produce ninguna reacción química. Los fluorocromos son
moléculas que emiten luz visible cuando se les ilumina con una determinada longitud
de onda.

36. Aunque la inmunofluorescencia se puede usar para detectar a una sola molécula
tisular, pero también para una múltiple inmunodetección (detectar dos o más
moléculas presentes en una misma célula o matriz extracelular de forma
simultánea).Esto es posible porque existe una gran variedad de fluorocromos que
son capaces de emitir luz visible tras ser excitados con diferentes longitudes de onda.
Tomando fotografías tras cada excitación y superponiendo dichas imágenes
podemos averiguar si las moléculas se expresan, por ejemplo, en la misma célula

39. UTILIDADES DEL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS
• Entendimiento de los mecanismos moleculares de procesos biológicos en
organismos sanos o en el durante el desarrollo de un padecimiento.
• Diagnóstico.
• Búsqueda e identificación de marcadores moleculares.
• Diseño e implementación de nuevas terapias.
• Desarrollo de tecnologías.