La utilización de medios de cultivo y la tinción de Gram

1. CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NO. 128
Práctica 2. Utilización de medios de cultivo y técnicas de tinción.
Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de Microorganismos con base a las normas.
Integrantes: González Pizarro Lesly, Hernández Espinoza Nayelli, Hernández Holguín Alan, Herrera López
Hassel, Jiménez Cota Fabiola, Lagunas Jaime Itzel, Lira Torres Vanessa, Mata Toledo Lucero, Meléndez
Morales Araceli.
Facilitadora: Ing. Acosta Jessica.
Fecha: Inició el 28 de Septiembre de 2014; terminó el 8 de Octubre de 2014.
Introducción
Un medio de cultivo es una solución que contiene los
nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en
condiciones físicas óptimas, permite el crecimiento
de los microorganismos. Entre las condiciones
generales que se deben considerar para cultivar
microorganismos están: disponibilidad de nutrientes
adecuados, consistencia adecuada del medio,
presencia o ausencia de gases (como el oxígeno),
condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental ,
pH, temperatura y esterilidad del medio.
La tinción es una técnica en la que se utilizan
diferentes colorantes, que son captados por las
estructuras de los microorganismos que se observan
al microscopio, siendo cada estructura a fin a un tipo
determinado de colorante, por lo que se pigmentan
de diferente color y se pueden diferenciar e
identificar.
La tinción de Gram sirve para identificar las bacterias
Gram positivas o Gram negativas.
Los colorantes tiñen la pared de las bacterias de
color morado y, tras unos minutos, se realiza un
lavado del colorante. Después de eso puede que el
colorante permanezca en la pared bacteriana o que
se haya ido. En el primer caso se habla de Gram
positivas y, en el segundo, la pared tendría un color
rosado, y se habla de Gram negativas.
En esta ocasión se empleó el agar nutritivo y el EMB
para cultivar Escherichia coli. Tomando muestra y
observándola con ayuda de la tinción de Gram.
Resumen
En primer lugar, el material se esterilizó. Luego, se
preparó un medio nutritivo y un medio EMB en una
cantidad de 400 ml cada uno.
Estos fueron esterilizados junto con las placas de
Petri necesarias. En este caso, los microorganismos
se cultivaron a partir de heces. Una vez que se
obtuvo la muestra, se disolvió en agua y se sembró
sobre tres placas de Petri con medio EMB (eosina y
azul de metileno) y en otras cuatro placas de Petri
con medio nutritivo.
Los medios de cultivo se incubaron durante 3 días,
cuando se decidió trabajar con ellos, se colocaron
tres mecheros Bunsen en forma de triángulo y se
mantuvo el fuego regulada para evitar la entrada de
agentes contaminantes al medio de cultivo.
Se observó que crecieron diferentes tipos de
bacterias, incluyendo varios tipos de hongos (que
indican la contaminación del medio de cultivo), a
pesar de esto, era inició el análisis de la morfología
de la colonia. En los medios nutritivos crecieron un
promedio de 240-2232 colonias y en los medios de
EMB no era posible contar las colonias, porque éstas
no crecieron correctamente. En los medios de EMB,
crecieron algunos hongos de diferentes colores
(verde y naranja) y estos eran difíciles de contar.
Las colonias en los medios nutritivos tenían una
superficie convexa, era punteada e irregular, y su
borde era redondo.
Después de eso, se realizó la tinción de Gram. Para
ello, una pequeña muestra de cada cultivo fue
colocada sobre un portaobjetos con una gota de
agua. Luego, la muestra fue fijada mediante un
mechero Bunsen. La tinción se realizó con 1 gota de
diferentes sustancias: cristal violeta, yodo-lugol ,
alcohol-cetona y safranina. Después, se colocó una
gota de aceite de inmersión y un cubreobjetos
rápidamente, para hacerla visible en el microscopio.
En la mayoría de las muestras, se observaron
bacterias Gram negativas.

2. Abstract
First, the material was sterilized. Then, a Nutritious
medium and a EMB medium was prepared in an
amount of 400ml each one.
Those were sterilized together with the necessary
Petri dishes. In this case the microorganisms were
cultured from feces. Once the sample was obtained,
this was dissolved in water and streaked on three
Petri dishes with medium EMB (Eosin and Methylene
Blue) a culture and in other 4 Petri dishes with
medium Nutritious.
The culture media were incubated for 3 days, when
it was decided work with them, were placed three
bunsen burners in form of triangle and was
maintained the fire regulated to prevent the entry of
contamination agents to the culture media.
It was noted that grew different types of bacteria
including several types of fungus (which indicated
contamination of the culture medium), despite this,
was began the colony morphology analysis. In the
Nutritious media grew an average of 240-2232
colonies and in the EMB media wasn't possibly count
the colonies, because these don't grew properly. In
the EMB media, grew some fungus of different colors
(green and orange) and these were difficult to count.
The colonies in the Nutritious media had a convex
surface, was punctate and irregular, and its edge was
round.
After that, was performed the staining Gram. To do
this, a small sample of each culture was placed on a
slide with a drop of water. Then, was set using a
bunsen burner. Then, the staining was performed
with 1 drop of different substances: crystal violet ,
iodine-Lugol, alcohol-ketone and safranin. After, was
placed a drop of immersion oil and a coversl ip
quickly, to make it visible in the microscope. In the
most samples, were observed Gram negative
bacteria.
Materiales y métodos
Materiales
 Cajas Petri
 Espátula
 Balanza
 Asas de platino
 Mechero de Bunsen
 Matraz Erlenmeyer
 Heces fecales
 Agar nutritivo
 Agar EMB
 Porta objetos
 Cubre objetos
 Microscopio
 Mangueras de látex
 Capsula de porcelana
 H2O
 Vidrio de reloj
 Agitador
 Cristal Violeta
 Yodo-Lugol
 Alcohol-Cetona
 Aceite de inmersión
 Safranina
Métodos
Técnicas de Vaciado
En este método se vierte en un matraz Erlenmeyer
un Agar nutritivo y en otro un agar EMB mezclándolo
con un poco de agua, luego se coloca al fuego del
mechero de Bunsen y se agita hasta conseguir una
tonalidad amarilla cristalina (en el caso del agar
nutritivo) y una morada (en el caso del agar EMB). Al
obtener este color, se cubren los matraces y se dejan
reposar. Luego, deben de ser colocados junto con
las placas Petri (previamente envueltas) en una olla
de presión para esterilizar el material. Una vez ya
esterilizados, los agares son vertidos sobre cada
placa Petri (40 ml por cada placa) con cuidado y
dentro de un triángulo de mecheros de Bunsen.
Métodos de estriado
Luego de vaciar los agares, es necesario dejar que
estos se cuajen en las placas. Cuando ya estén
solidificadas, en un vidrio de reloj se vierte una
muestra de heces fecales, mezclándolas con un
poco de agua. Luego se toma una gota de la muestra
de heces con las asas de platino y sobre el medio de
cultivo se comienza a estriar de manera continua
(primero se levanta un poco la tapa y se hace un
estriado, luego se gira 90° la placa y se realiza otro
estriado, y así sucesivamente). Después de estriar
todas las placas, están deben de ser colocadas en
las placas.

3. Morfología de colonias
Una vez que aparecen las colonias en los medios de
cultivos, es necesario hacer un análisis acerca de la
morfología de colonias, que consiste en contar las
colonias presentes e ir tomando en cuenta cada uno
de sus aspectos tales como la forma, borde,
superficie, color, numero de colonias etc.
Tinción Gram
En este método, se coloca en un portaobjetos una
gota de agua destilada, luego se toma una muestra
de cualquier colonia existente en el agar y se dejaba
secar por un tiempo. Una vez seca debe de ser fijada
pasado la muestra por encima del mechero de
bunsen. Después se le agrega 1 gota de cristal
violeta y se deja reposar por 1 min. Luego de esto se
enjuagaba muy bien para poder verter 1 gota de
Iodo-Lugol dejándolo reposar por 1 min. Se vuelve a
enjuagar y se vierte 1 gota de alcohol-cetona
dejando reposar por 30 segundos y se vuelve a
enjuagar, después se agrega 1 gota de safranina, se
espera 30 segundos y se enjuaga. Por último se le
agrega 1 gota de aceite de inmersión a la muestra y
se cubre con un cubreobjetos para poder verlo en un
microscopio a 100X y realizar el análisis de la
morfología de las bacterias presentes en los cultivos.
Resultados
Al realizar toda la esterilización necesaria en los
instrumentos y siguiendo los requerimientos de la
práctica, los resultados se dieron conformé los días,
ya que el cultivar agares no quiere decir que estos
tendrán reacciones de una hora a otra, si no, estos
necesitan de al menos 2 días para lograr ver sus
resultados, los efectos y/o reacciones que tuvieron.
Por ejemplo, en los agares nutritivos se observó que
estos, junto con los desechos fecales, poseen cocos
y bacilos que solo son visibles con la ayuda de un
microscopio y de una tinción, en este caso la tinción
de Gram, entonces en ello se captó toda su
morfología como fue que uno llego a tomar una
superficie plana convexa, con una forma puntiforme
de color blanco-amarillento, con un borde redondo y
al menos 240 colonias en él. Como ya se había
mencionado a su vez este en este agar nutritivo
llegaron a crecer cocos y bacilos. Aunque en otros
agares no se logró captar nada ya que al no estriarse
bien crecen hongos de gran tamaño y esto llega a
afectar lo que se quiere determinar, que serían los
estreptococos.
Morfología de cultivos
MEDIO FORMA COLOR SUPERFI
Nutriti
vo 1
Puntif orme Blanco Plana Redondeado 240
Nutriti
vo 2
Puntif orme Blanco Conv exa Redondeado
Morfología de bacterias
Conclusiones
CIE
BORDE COLONIAS
González Pizarro Lesly: Al momento de estar
desarrollando esta práctica, se obtuvieron diversos
conocimientos, desde la preparación de un agar,
como se debe vaciar correctamente el agar a la
placa, los métodos de estriados para poder obtener
un crecimiento de colonias esparcidas y que sean
posibles de contar a simple vista, obteniendo
diferentes resultados en cuanto a los números de
120
Nutriti
vo 3
Puntif orme Blanco Conv exa Redondeado 114
Nutriti
vo 4
Puntif orme Blanco
amarillento
Plana Redondeado 2232
EMB 1 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grupos
grandes de
colonias)
Irregular Verde
metálico
Plana Indef inido 1
EMB 2 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grupos
grandes de
colonias)
Irregular
Verde
metálico
Plana Indef inido 1
EMB 3 Irregular Morado Conv exa Redondeado (Grandes
grupos de
colonias)
Irregular
Verde
metálico
Plana Indef inido 2
Medio Color de
la
colonia
Forma
de la
bacteria
Tipo de
bacteria
Nutritivo
1
Blanco Bacilos Gram positiva
Nutritivo
2
Blanco Bacilos Gram positiva
Nutritivo
3
Blanco Bacilos Gram positiva
Nutritivo
4
Blanco
amarillento
Cocos Gram positiva

4. colonias, y a el crecimiento de ellas, ya que en
diversas placas crecieron bacterias y hongos no
deseados esto por el mal desarrollo de la práctica.
Por mi parte el medio de cultivo con el que estuve
trabajando, el método de estriado fue bueno, sin
embargo falta más practica ya que debido a que el
estriado fue demasiado esparcido en las orillas de la
práctica, crecieron miles de colonias muy pequeñas,
dando como resultado 2232 colonias, después de
terminar el conteo, se prosiguió con la morfología de
las bacterias y por último se terminó de nuevo con la
esterilización de las placas para poder eliminar las
bacterias y retirar el agar.
Hernández Espinoza Nayelli: Se puede concluir
que ay que tener mucho cuidado con los cultivos
bacterianos , un medio de cultivo es un desarrol lo
microbiano, dándonos cuenta que se pueden
desarrollar hongos, bacterias de todo tipo , forma,
tamaño etc..
Como ya hemos experimentado las bacterias se
encuentran en todos lados y no se ven a simple vista
ni fácilmente, y el crear nuevos hábitos de higiene.
La higiene es un factor muy importante tanto para el
que hace la práctica como para los materiales e
instrumentos que se vallan a utilizar ya que estos
deben estar muy bien esterilizados y el preparar los
agares con cuidado y precaución.
Hernández Holguín Alan: La utilización de los
medios de cultivo es esencial en la microbiología, ya
que, por medio de estos es posible observar las
características de los cultivos y la morfología que
presentan diversos tipos de bacterias, así como
realizar análisis que permitan identificar diversos
tipos de microorganismos. También es importante
conocer las medidas de seguridad y los
procedimientos necesarios para preparar medios de
cultivo y utilizarlos para generar colonias de
bacterias, ya que si no se siguen las normas
apropiadas, no se llegaran a los resultados
deseados y pueden producirse problemas de salud
debido al mal manejo de los medios. En conclusión,
es necesario ser cuidadosos, conocer y seguir los
procedimientos adecuados, y tomar medidas de
seguridad al momento de emplear medios de cultivo
para evitar accidentes y evitar la propagación de
bacterias patógenas presentes en los cultivos.
Herrera López Hassel: Llego a la conclusión de que
el agar nutritivo fue un buen medio para cultivar
bacterias de estreptococos y que el método de
sembrado por estriado facilita el conteo de colonias
y que la técnica de tinción Gram auxiliar en la
identificación de bacterias.
Jiménez Cota Fabiola: Mi conclusión respecto a
esta práctica seria que al ver los métodos y
procedimientos que se realizan para hacer un agar o
medio de cultivo son cosas muy extraordinarias
porque el ver y saber cómo se prepara un agar no es
algo muy usual, ver qué tipo de consistencia toma y
la manera de estriar con heces fecales y observar lo
que sucede en ello, observar cuantas colonias
produce sus formas, colores que hasta en ellos
vimos que producían hongos, también el saber que
de tan poca muestra se pueden conseguir miles de
colonias que nunca imaginarias, ya por ultimo
observar las tinciones que se realizan para poder
observar que tipos de bacterias obtuviste en tu
muestra, e nuestro caso obtuvimos Gram positivas
ya que las diferenciábamos por su tonalidad que se
veía al observarlas en un microscopio a 100X.
Lagunas Jaime Itzel:
Lira Torres Vanessa: Un medio de cultivo es un
conjunto de nutrientes de crecimiento que propicia
un desarrollo microbiano. Claro está que existen
diversos tipos de medio de cultivo y en este caso el
utilizado fue solido ya que como cualquier otro tipo
de medio de cultivó es importante reconocer los
estreptococos que pueden crecer en ellos y así
poder determinar lo que son y por su puesto ver
cómo están conformados y así saber si son Gram
positivos o Gram negativos.
De igual manera la esterilización es uno de los
puntos más importantes que se debe resaltar ya que
si no se tiene un buen uso de ello, los medios de
cultivo no tendrían un desarrollo como el que se
desea obtener, debido a que los instrumentos y/o
materiales están contaminados y eso afectaría a la
práctica, también es uno de los principales pasos
para llegar realizar un buen agar aparte de saber
estriar de una manera adecuada.

5. Mata Toledo Lucero: Esta práctica nos ayudó a
preparar un medio de cultivo, identificar los
diferentes tipos de bacterias que pueden crecer en
cada medio de cultivo y a diferenciar entre las Gram
positivas y Gram negativas.
Esto es de gran importancia en nuestro aprendizaje
como Laboratoristas químicos, y tiene como finalidad
enseñarnos lo que debemos hacer al momento de
cultivar una bacteria de una manera segura y eficaz.
Debemos tomar en cuenta las medidas de seguridad
necesarias para evitar infecciones ya que las
bacterias que crezcan pueden ser muy dañinas para
nuestra salud. Al final obtuvimos buenos resultados,
no los esperados ya que crecieron algunas bacterias
no deseadas pero de igual forma esto nos dejó una
gran enseñanza de acuerdo a lo que hicimos durante
el tiempo estimado de la práctica.
Meléndez Morales Araceli: Durante la práctica
pudimos observar que en las en condiciones físicas
óptimas, permite el crecimiento de los
microorganismos los medios de cultivo, es un tema
muy interesante que nos permite observar la vida de
microorganismos que obviamente no podemos ver si
no es a través de un microscopio, además de
preparar el medio de cultivo, realizamos el estriado
en forma t para sembrar las bacterias de la E. coli de
la manera adecuada, después nuestros medios de
cultivo en las cajas Petri con nuestro estriado ya
realizado fueron guardadas en la incubadora
después de unos días pudimos observar nuestras
colonias de bacterias ya realizadas, después de
contar e identificar nuestras bacterias realizamos la
esterilización de nuestras cajas Petri y luego el
lavado para secar y luego secar y entregar, fue una
práctica que nos otorgó conocimientos nuevos.
Discusión
En esta práctica, se desarrollaron diversos
conocimientos, se aprendió a preparar los medios de
cultivo y a como esterilizarlos junto con los
instrumentos que se ocuparon en el proceso,
después de entender y poner en proceso la
esterilización se estuvo estudiando la morfología de
las colonias que crecieron a partir de la muestra de
excremento de un perro. Creciendo así diferentes
bacterias y hongos que se desarrollaron al momento
de introducir el medio de cultivo en la incubadora,
durante aproximadamente 72 horas. Se llevaron a
cabo la tinción de Gram a partir de una pequeña
muestra de cada uno de los medios de cultivo, para
poder llegar a la determinación exacta de la
morfología de bacterias determinando si eran Gram
positivas y Gram negativas. Al final se cumplió el
objetivo de la práctica, el cual era aprender a
emplear los medios de cultivo correctamente, los
métodos de vaciado, las técnicas de estriado y
determinar correctamente la morfología de colonias
y bacterias.
Bibliografía
 FACULTAD DE AGROINDUSTRIAS. (2006).
Trabajo Práctico Nº 4 Medios de Cultivo.
12/10/2014, de Universidad Nacional del Nordeste.
Sitio web:
http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf
Anexos
Cultivos
Un cultivo es un método para la multiplicación de
microorganismos, tales como bacterias, hongos y
parásitos, en el que se prepara un medio óptimo para
favorecer el proceso deseado. Un cultivo es
empleado como un método fundamental para el
estudio de las bacterias y otros microorganismos que
causan enfermedades en medicina humana y
veterinaria.
Un microorganismo se puede sembrar en un medio
líquido o en la superficie de un medio sólido de agar.
Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes
que van, desde azúcares simples hasta sustancias
complejas como la sangre o el extracto de caldo de
carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana
a partir de una muestra formada por muchos tipos de
bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido
donde las células que se multiplican no cambian de
localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada
bacteria individual genera por escisión binaria una
colonia macroscópica compuesta por decenas de
millones de células similares a la original. Si esta
colonia individual se siembra a su vez en un nuevo
medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de
bacteria.
La principal diferencia entre un medio de cultivo
sólido y uno líquido es que el medio de cultivo sólido

6. contiene un 1,5–2% de agar-agar, mientras que el
medio líquido no contiene agar-agar.
Los diferentes medios y técnicas de cultivo son
Esenciales en un laboratorio de microbiología de un
hospital, pues sirven para identificar las bacterias
causantes de las enfermedades infecciosas y los
antibióticos a los que son sensibles esas bacterias.
Los cultivos suelen usarse en medicina para
determinar la presencia de agentes patógenos en
fluidos corporales (como por ejemplo la sangre o la
orina).
Uno de los sistemas más importantes para la
identificación de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales
preparadas en el laboratorio. El material alimenticio
en el que crecen los microorganismos es el Medio de
Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el
Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de
cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en
un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de
condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presión de oxígeno adecuado, así como
un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio
de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayoría de las bacterias patógenas requieren
nutrientes complejos similares en composición a los
líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la
base de muchos medios de cultivo es una infusión
de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán
otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificarte muy empleado
para la preparación de medios de cultivo. Se licúa
completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de
las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en él.
La Gelatina es otro agente solidificarte pero se
emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuación.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran
numerosos materiales de enriquecimiento como
hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis,
etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos
motivos fundamentales: para incrementar el valor
nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentación de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre completa se
añaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
También se añaden colorantes que actúan como
indicadores para detectar, por ejemplo, la formación
de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como
indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en
pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría
de las bacterias Gram-positivas).