Las plaquetas median la destrucción de parásitos de malaria intraeritrocíticos y median la supervivencia a la infección. SCIENCE VOL 323 6 FEBRERO 2009 Exposicion de un artículo de revista.

1. Las plaquetas median la destrucción de
parásitos de malaria intraeritrocíticos y
median la supervivencia a la infección.
SCIENCE VOL 323 6 FEBRERO 2009
Brendan J. McMorran
Tansania, Australia.
PRESENTA:
Edgar L. Martínez Salazar.
Estudiante de Medicina
IX semestre
Universidad de Antioquia.

2. CONTENIDO
• Introducción
• Artículo
• Objetivo
• Metodología
• Resultados
• Conclusiones
• Preguntas y discusión.

3. OBJETIVO
• Explorar el papel plaquetario en el curso de la infección por
malaria en un modelo murino, P. chabaudi e Invitro usando el
cultivo de P. falciparum humano.
• HIPÓTESIS
• La primera infección por malaria mostraría una trombocitopenia
asociada a una respuesta inmune adaptativa mediada por plaquetas,
mientras que la inmunidad por malaria que se adquiere en sitios
endémicos podría estar explicada por el secuestro plaquetario a la
vasculatura y estaría asociada más a complicaciones.

4. INTRODUCCIÓN
• La inmunidad adaptativa
• Respuesta inmune innata  Limita el crecimiento del parasito
en el GR supervivencia
• Primeros años de vida parasitemia/gravedad clínica.
http://www.immunopaedia.org.za/fileadmin/gallery/Malaria/malaria4.jpg

5. INTRODUCCIÓN
• Primera barrera: GR
• Trombocitopenia P. falciparum, P. vivax y P. chabaudi.
• Trombocitopenia Gravedad y Parasitemia
• Adhesión plaquetaria  GRP
• Plaquetas  Enfermedades Infecciosas.
http://3.bp.blogspot.com/_8bm6OtHuayY/SpiBNNE06bI/AAAAAAAAANM/QqW-
D3ZjaF8/s1600-h/plaquetas_www.arauto.uminho.pt.jpg

6. INTRODUCCIÓN

7. METODOLOGÍA
Infección experimental con P. chabaudi en los
ratones.
A las cohortes se
les suministró
Recogen sangre ASA (25 mg/kg
de punción V.O.) o vehículo
cardíaca y (salino) desde el
Inocularon 100ul analizan
IV de GRP en día antes de la
ratones para infección hasta
experimento. 10 días después.
Al alcanzar 5-
15%
Parasitemia.,
fueron
cultivadas por
C57BL/6 punción
fueron retroorbital y
infectados diluidas en
con 150 ul HEM
P. chaubadi precalentado.

8. METODOLOGÍA
Cultivo de P. falciparum
Se mantuvo
Cepa de P. falciparum 3D7 parasitemia entre 1 y
10% en eritrocitos
AB+ humanos en
atmosfera de 1%
O2/5% CO2
Suplementó con:
-1X glutamax, 0.2%
- Albumax 4% combinada con suero
humano AB+
- 10 mM D-glucose, 25 μg/mg
- Gentamicina
- 6 mM HEPES
- Hipoxantina0.2 mM

9. METODOLOGÍA
Preparación de plaquetas humanas lavadas.
Plasma rico en Incubado por
Sangre Centrifugación e plaquetas es separado 15 minutos
humana Incubación 37 C° de otros componentes
sanguíneos por
centrifugación.
Las plaquetas se
Nuevamente sedimentaron (1
se Incubado 700g centrifugac
Se confirmó la Análisis sedimentaron por ión, 7 min) y se
integridad y plaquetario (1500g 7 min) 15 minutos resuspendieron
funcionalidad y en buffer de
plaquetaria resuspendiero lavado
n en buffer.

10. METODOLOGÍA
Platelet incubation with P. falciparum cultures
Un volumen
equivalente de
Buffer fue
Las plaquetas fueron adicionado en
adicionadas al cultivos de control,
parasito en 1/5 del
volumen de cultivo
final
Sincronización de
parásitos en el
estadio de trofozoito.
Y diluido en sangre
no infectada 
parasitemia de 0,5%
Las plaquetas fueron pre-tratadas con componentes inhibitorios,
antes de adicionarla a los parasitos.

11. METODOLOGÍA
Tinción TUNEL en extendido de sangre periferica
Al menos se contaron 100
Extendido de sangre
parasitos por extendido. Y fueron
identificados como fragmentos
Se incubaron las de DNA si se teñian para TUNEL.
laminas con mezcla
enzimática etiquetada
dUTP Evaluación microscópica x1000
4 h a 37°C Se incuban las laminas
por 30 minutos en la
Marca con oscuridad con biotina
anticuerpos anti-BrdU anti CD41 humano o
anti CD41 raton
Lavado

12. METODOLOGÍA
Evaluación de cinética eritroidea
• Se indujo lisis con Fenilhuidrazina.
• A los ratones se les injecto dos veces clorhidrato de
fenilhidrazina (PH) 0.06 mg/g
• En dos días consecutivos con una diferecia de 24 h
• Los animales fueron sacrificados en el día 7 despúes de la
primerea inyección y sus bazos fueron pesados.

13. METODOLOGÍA
• Immune status of Mpl-/- and C57BL/6 mice during P.
chabaudi infection.
• Mice were infected with 1x104 infected RBC, cohorts
sacrificed at indicated days post infection and analysed for T-
cells (CD3, CD3 and CD4, or CD4 and CD8 positive) and B-cells
(B220 positive) by immunostaining and flow cytometry

14. METODOLOGÍA
Citometría de flujo de GR de ratón adheridos
a plaquetas.
Citometría de flujo de GR humanos adheridos
a plaquetas.
Análisis inmunológico de ratones infectados.
Análisis de citoquinas en plasma.

15. METODOLOGÍA
• % de crecimiento parasitario/función plaquetaria
• Modelo de P. falciparum
• Incubación de las plaquetas en antagonistas específicos
• Agregamos diferentes componentes.
• Para determinar los requirimientos de ADP un importante
regulador de la actividad plaquetaria, nosotros incubamos los
cultivos de P. Falciparum+plaquetas con ADPasa, to remove
estracellular ADP from culture medium.

16. RESULTADOS
C57BL/6
(Mpl -/-) C57BL/6
10 veces menos plaquetas
P < 0.0001
P. chabaudi MUERTE
MUERTE

17. RESULTADOS
MUERTES
• 5% C57BL/6 • 20% C57BL/6
• 50% Mpl −/− • 100% de Mpl −/−

18. RESULTADOS
• El número de plaquetas disminuyó concomitantemente con la
aparición de parásitos en la circulación periférica en ambos
grupos.
C57BL/6 (Mpl -/-)

19. RESULTADOS
La cinética eritropoyetica

20. RESULTADOS
• Durante la inducción de lisis experimental tampoco se
observaron cambios en la cinetica eritrocitaria entre las cepas.
• Solución salina.
• Clorhidrato de fenilhidrazina.

21. RESULTADOS

22. RESULTADOS
• ASA Inhibe Cicloxigenasa 1 y 2  Disminución de
tromboxano A2 Disminución de activación plaquetaria
• BAJA AGREGACIÓN
http://static.tantasalute.it/625X0/www/tantasalute/it/img/aspirina-compresse.jpg

23. RESULTADOS

24. RESULTADOS
Relación de cultivos P. falciparum/plaquetas
• Inhibición concentración dependiente.

25. Reducción en esquizontes maduros en 5 horas
y nuevos anillos en 21 a 29 horas

26. RESULTADOS
• La activación plaquetaria mediada por ADP es mediada por
dos receptores metabothrophicpuronergic, P2Y1 y P2Y12. El
antagonismo de P2Y1 abolio la actividad destructiva de la
plaqueta sobre el parasito, pero no ocurrio al bloquear P2Y12.

27. RESULTADOS
1. Adenilciclasa activa
PGE1Suprime actividad
plaquetaria Suprime función
inhibitora del crecimiento
2. La exposición a NO tuvo un efecto
parecido.
3. Crecimiento parasitario normal
plaquetas y ADPasa.
4. La activación plaquetaria mediada
por ADP es mediada por dos
receptores. El antagonismo de
P2Y1 abolio la actividad destructiva
de la plaqueta sobre el parasito,
pero no ocurrio al bloquear P2Y12.

28. RESULTADOS
• AspirinaP. chabaudi en los ratones Previno la inhibición
del crecimiento parasitario mediado por plaquetas
• Aproximación clínica:
• Voluntario donador de plaquetastomo aspirina oral 2 veces al dia
(4,2mg/kg) por una semana antes de donar la sangre para la
purificación de plaquetas.
• Estas plaquetas fueron incapaces de inhibir el crecimiento de P.
falciparum

29. RESULTADOS
• Ratones infectados  Plaquetas unidas a GRP

30. RESULTADOS
• El CD41 (Ag plaquetario) en la superficie de GRP sirvio como
un marcador de la adhesión plaquetaria.
• Los GRP se marcaron 3 veces más para CD41 comparado a los
GR no parasitados.
¿?

31. RESULTADOS
• Humanos infectados: El numero de GRP unido a plaquetas
humanas fue dos veces y los GRP marcados con CD41 fueron
el doble.
DOBLE
DOBLE

32. RESULTADOS
Etapa tardía de infección:
• Estadio de anillo: Flecha verde, teñidos solo con Hoechst.
• Merozoitos extracelulares: Se tiñen con TUNEL Y Hoeschst Anticipa que el
merozoito morira.

33. RESULTADOS
• En los ratones con bajas parasitemias (día 7), la coloración de
parasitos intraeritrociticos con TUNEL fue evidente, indicativo
de la muerte de parasitos intraeritrociticos.

34. RESULTADOS
• Se observaron 2 veces más muertes de parásitos
intraeritrociticos en ratones C57BL/6 que en Mpl -/-.
DOBLE

35. RESULTADOS
• Diferencia entre las parasitemias de las dos cepas durante el
tiempo, mostrandose más altas en los días 9 y 10 para Mpl-/-.

36. RESULTADOS
• Parasitos intracelulares coloreados con TUNEL fueron tambien
observados en cultivos de P. falciparum.
3 veces

37. marcado NO marcado

38. CONCLUSIONES
• Las plaquetas median inihbición del crecimiento de cultivos de Plasmodium falciparum en GR
• La mayoría de los parasitos observados durante la inhibición del crecimiento parasitario mediado por
plaquetas fueron trofozoitos y esquizontes maduros. La reducción en esquizontes maduros en 5 horas y
nuevos anillos en 21 a 29 horas sugiere que las plaquetas estuvieron inibiendo el desarrollo de
maduración de los parasitos.
• El crecimiento de P. falciparum es inhibido por plaquetas en una concentracion dependiente y
mecanismo de activación-dependiente, que requiere ADP y activación a través del receptor P2Y1.
• La inhibición farmacológica de la función plaquetaria incrementa la suceptibilidad a la infección por
malaria en los ratones aunque otros efectos indirectos de la aspirina no pueden ser excluidos.
• El mantenimiento de concentraciones altas intracelulares de ADM y GMP son mecanismos claves en
suprimir la activación plaquetaria.
• La aspirina puede ser potencialmente peligrosa en infecciones por malaria.
• Las plaquetas se unen selectivamente a los GRP.
• La desstrucción del parasito mediada por plaquetas, tiene impacto en la parasitemia, lo que resulta en
parasitemia mayores para ratones Mpl -/- , lo que puede explicar su mayor suceptibilidad.
• El mayor numero de parastios intraeritrociticos muertos en presencia de un numero normal de plaquetas
in vitro e invivo implica que las plaquetas destruyen directamente los parasitos de malaria.
• La alta mortalidad en los ratones deficientes en plaquetas y la destrucción directa de P. falciparum por
plaquetas humanas indica que las plaquetas son importantes en el control de la infección por malaria. La
trombocitopenia ocurre tempranamente en la infección en ambos humanos y ratones, antes de las
formas graves de la enfermedad se desarrollen. Por lo tanto la principal efecto protector de las plaquetas
podría ser en la fase temprana de la enfermedad. La modulación del crecimiento del parasito por
plaquetas podría amortiguar la tasa de crecimiento del parasito y permitir el desarrollo de la respuesta
inmune adaptativa. Este hallazgo es adicional al papel bien establecido de las plaquetas en la malaria
cerebral. Nosotros hemos mostrado que la inhibición de la activación plaquetaria deroga el efecto
protector, lo cual puede explicar el efecto deleterio de la aspirina puede tener en el desenlace de la
malaria.