candida albicans

1. Laura V. Ceballos Naranjo
María Antonia Correa Saavedra
Tercer semestre

2. CANDIDA ALBICANS
Family:
Debaryomycetaceae
Genus: Candida
Species: albicans
Dimorphic fungus that grows both as yeast and filamentous cells and
one of the few species of the Candida that cause the
infection candidiasis in humans
C. albicans is a common member of human gut flora and is detectable in
the gastrointestinal tract in 40% of healthy adults

3. INTRODUCTION
CANDIDA ALBICANS
It is usually a commensal organism, but can
become pathogenic in immunocompetent
individuals under a variety of conditions.
Overgrowth of the fungus results
(candidosis)
Candidiasis is often observed
in immunocompromised individuals,
including HIV-infected patients

4. INTRODUCTION
Heat Shock proteins
Heat shock proteins (HSPs) are proteins found in plant and animal cells
They originally were described in relation to heat shock but are now known to be
induced by a wide variety of stresses, including exposure to cold, UV light, wound
healing, tissue remodeling or biotic stresses
HSPs are essential components contributing to cellular
homeostasis under optimal and detrimental growth
conditions in prokaryotic and eukaryotic cells

5. INTRODUCTION
Heat Shock proteins
They are responsible for protein folding, assembly, translocation, and degradation
during ordinary cellular growth and development
HSPs also function in the stabilization of proteins and assist protein refolding under
stress conditions
Many chaperones, but by no means all, are heat shock proteins because the
tendency to aggregate increases as proteins are denatured by stress
Heat-shock proteins are named according to their molecular weight. For
example, Hsp60, Hsp70 and Hsp90 (kDa)

6. INTRODUCTION

7.  HSP90
ATP-dependent molecular chaperone which is essential in eukaryotes
Hsp 90 assists other proteins to fold properly, stabilizes proteins against heat stress,
and aids in protein degradation
It affects numerous physiological processes
such as signal transduction, intracellular
transport, protein degradation and also
stabilizes a number of proteins required for
tumor growth, whence it became an interesting
target for cancer therapy

10. Hsp90 and C. albicans
The chaperone Hsp90
orchestrates
regulatory circuitry
governing fungal
morphogenesis, drug
resistance, and
virulence
Sgt1 physically
interacts with Hsp90,
and that it governs C.
albicans
morphogenesis and
drug resistance
Genetic depletion of
Sgt1 phenocopies
depletion of Hsp90,
inducing yeast to
filament
morphogenesis and
invasive growth.
global regulator of
morphogenesis and
drug resistance,
providing a new
target for treatment
of life-threatening
fungal infections

11. Objective
The purposes of this study were to assess the expression
of Hsp90 gene in clinical and control isolates of C.
albicans obtained from different geographical regions
(Malaysia and Iran), different temperatures (25ºC, 37ºC
and 42ºC) and mice with candidiasis.

12. Métodos

13. Aislamientos fúngicos
 Objetivo: Evaluar la expresión del gen Hsp90 en
pacientes de Irán y Malasia que padecen candidiasis
sistémica Vs. pacientes sanos.
 El estudio grupo estaba formado por 32 pacientes (16
varones y 16 mujeres) y 16 individuos de control
emparejados por sexo y edad (16 varones y 16
mujeres).
 Media de edad: 35.9 años (pacientes entre 18 y 60
años).

14. Aislamientos fúngicos
 Los aislados clínicos se obtuvieron de la sangre de
pacientes inmunocomprometidos con candidiasis
sistémica, que representan los factores de riesgo tales
como:
 cáncer, diabetes mellitus, antibióticos y tratamientos con
esteroides.
 Los aislamientos de control fueron tomados de la piel
de las personas que eran inmunocompetentes.
El protocolo de estudio fue aprobado por los comités de ética de
University of Malaya Medical Center (UMMC), Malasia y la Universidad
de Tehran University of Medical Sciences, Irán. Un consentimiento
informado, se obtuvo de todos los sujetos antes de entrar en el
estudio.

15. Aislamientos fúngicos
1
• Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas
• Cultivo de células de levadura en SDA a 37ºC durante 24 horas
2
• Identificación de levaduras basada en:
Prueba de germen de tubo, CRHOM agar, test de B-glucosidasa, test de ureasa, cornmeal
Tween-80 para la producción de clamidosporas, fermetación de azúcares y pruebas de
asimilación utilizando Rap ID Rap ID Yeast Plus System.
3
• Las células de Candida se cultivaron en SDA durante la noche a 25 ° C, y después se
transfirieron a sabouraud dextrose broth (SDB) en dos tubos diferentes en un baño de
agua con agitación a 110 oscilaciones por minuto a 25 ° C y 42 ° C por 45 min.
Después de la incubación, las células de Cándida fueron cosechadas por
centrifugación a 3000 × g para el paso subsiguiente.

16. Evaluación de la expresión
del gen Hsp90 en ratones
 Obejetivo: Investigar y comprender la expresión del
gen Hsp90 haciendo un comparativo entre humanos y
ratones; estos últimos proporcioando un modelo in
vivo.
 48 ratones hembra BALB / C de 6 semanas de edad
(25-30 g) se compraron en el Razi Institute, Karaj, Irán.
 8 aislados clínicos y 8 cepas de control de C. albicans
(4 cepas de Malasia y 4 de Irán c/u) fueron
seleccionados en este estudio
 Se consideraron tres ratones para cada aislamiento.

17. Evaluación de la expresión
del gen Hsp90 en ratones
Las levaduras se
cultivaron en SDA y
se incubaron a 37ºC
durante 24 h.
Las colonias de levadura
se retiraron y se lavaron
dos veces con PBS.
La suspensión de
levadura se ajustó
aproximadamente a 500 ×
103 células / ml usando
un hemocitómetro.
Los ratones fueron
infectados por
inoculación de 0,1 ml
de suspensión de C.
albicans a través de
la vena caudal.
Luego de 3 días, los
ratones fueron
anestesiados con
cloroformo para retirarles
los riñones.
El tejido se trituró en
suero fisiológico y 0,2 ml
del filtrado se cultivaron
en SDA a 37ºC durante
24 h.
Las células de
Candida fueron
cosechadas a partir
de medios de SDA.
Evaluación de la
expresión del gen Hsp90
mediante
RT-PCR.
Experimentos realizados
en base a la Ética de la
Investigación Veterinaria
y este estudio fue
aprobado sobre la
protección de la SPCA.
*PBS: Solución salina tamponada con fosfato; SCPA Sociedad de Protección
contra la Crueldad Animal.

18. PCR qRT
 Objetivo: Amplificación del RNA a través de la síntesis
previa de su cDNA (DNA copia), utilizando una
transcriptasa inversa, siguiendo varios ciclos de PCR
convecional.
 Los aislados de C. albicans se utilizaron para el
aislamiento del ARN total según el protocolo del kit
seleccionado para el experimento (RNeasy Mini kit,
Qiagen, Hilden, Alemania).

19. PCR qRT
1
• Tres microgramos de ARN se trataron con DNasa I basándose en el protocolo Quanti Tect
Reverse Transcription Qiagen Company (Hilden, Alemania)
• Se utilizaron para la síntesis de ADNc utilizando el Taq Man Reverse Transcription kit.
2
• La qRT-PCR se realizó en un volumen total de reacción de 25 l incluyendo PCR Master
Mix 12,5 l power SYBR Green ®, 1 l de cebador directo (400 nM), 1 l de cebador inverso (
400 nm), 5 l de ADN complementario (300 ng) como plantilla y 5,5 l de agua doblemente
destilada en Micro Amp óptica de placas de 96 pocillos en un ABI 7300 Real-Time-PCR
instrument.
3
• Las condiciones fueron las siguientes; ciclo 1 se repitió 40 veces: 95 ° C durante 10 min,
95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 min y el ciclo 2 que representa el nivel de disociación
se llevó a cabo una vez: 95 ° C durante 15 s, 60 °C por 15s, 95°C por 15s.

20. PCR qRT
1
• Para mostrar las bandas de cDNA de los genes de la Hsp90 y el rRNA 18S,
los productos de la PCR fueron puestos en gel de agarosa al 1.5% (w/v).
• Una escala de 1 kb de AND fue utilizada como marcador durante este
procedimiento.
2
• Los datos para el gen Hsp90 se calcularon y se expresaron como una
regulación en comparación con el gen rRNA 18S de referencia para cada
condición de prueba, utilizando el método de la curva estándar de
cuantificación.
3
• Las secuencias de los cebadores de genes de referencia se obtuvieron del
estudio de Manolakaki et al. (Tabla 1)
• El ensayo de QRT-PCR se realizó de forma independiente por triplicado.

21. PCR qRT

22. Análisis estadístico
 Objetivo: Comparar la diferencia en los valores de la
expresión del gen Hsp90 medias de entre los grupos
analizados. Las diferencias se consideraron
significativas a P-valor <0,05.
 El análisis de los datos se realizó utilizando el paquete
estadístico para Ciencias Sociales (SPSS, versión 17,
Chicago, IL, EE.UU.). Las pruebas t independiente y U
de Mann-Whitney fueron las seleccionadas.

23. Resultados

24. Resultados

27. Discussion
Authors What they said Agree/Disagree
Swoboda et al. Candida Hsp90 gene was heat
shock inducible and its expression
was strongly induced at higher
temperature, such as 45°C (about
nine folds), but a change in
temperature to 37°C had lower
effect on the level of Hsp90 mRNA.
Agree
O’Connor,
Essmann &
Larsen et al.
The expression of Hsp90 gene was
increased under treatment with 39°C
and 17-β-estradiol up to 50% and
75%, respectively.
Agree

28. Discussion
Authors What they said Agree/Disagree
Shapiro et al. A medium induction of Hsp was
observed with changes in
temperature from 30°C to 37°C or
exposure to serum at 30°C, but a
higher stimulation was seen in
response to the combination of
serum and elevated temperature.
Agree
Carper, Duffy &
Gerner and
LaFayette et al.
Demonstrated the existence of
differences in the expression of C.
albicans Hsp90 gene between in
vitro (37°C) and in vivo (mice body)
in both systemic and non-systemic
isolates.
Agree

29. Discussion
Authors What they said Agree/Disagree
Jenkins,
Schultz &
Matin et al.
The oxidative stress responses were
the most important factors in the
development of experimental
systemic infections.
Agree
Enjalbert et al. Reported a reduction in virulence of
C. albicans by compromising of
Hsp90 function or expression in mice
with systemic candidiasis.
Agree
Hodgetts et al. The over-expression of Hsp90 gene
in S. cervisiae increased the
virulence of this fungus and therefore
Hsp90 appears to be a virulence
factor of C. albicans .
Agree

30. Conclusions
1. Based on this study, it was possible to find out that hsp90 is not only
expressed at high temperatures but also under stress conditions that can
lead the gene expression encoding hsp90 in C. albicans.
2. Authors could confirm that hsp90 gene expression in C. albicans is
different in several geographical locations and with different temperatures.
With this finding it was possible to conclude that both, genetics and
environmental changes, play an important role in the expression of this
gene.
3. C. albicans has high adaptability even in different races, geography, pH,
nutrient availability and temperature because it can change its gene
expression in response to all these variables; although a previous study
showed that candidiasis is predominant in black populations by a 4: 1ratio.
4. This study compared the hsp90 expression in Malaysian and Iranian
patients and it found that gene expression was greater at higher
temperatures, which means hps90 gene expression in C. albicans can be
induced by heat shock.

32. Cmaptools

33. Bibliografría
Martínez L., Vargas N., Mejía L., Osorio F., Ramírez S. (2015). Biología Molecular,
Medellín: Editorial Universidad Pontificia Bolivariana.
Crunkhorn S. Fungal infection: Protecting from Candida albicans. Nat Rev Drug
Discov. 2016 ;15(9):604
Jabra-Rizk MA, Kong EF, Tsui C, Nguyen MH, Clancy CJ, Fidel PL Jr, et al. Candida
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Park C-J, Seo Y-S. Heat Shock Proteins: A Review of the Molecular Chaperones for
Plant Immunity. The Plant Pathology Journal. 2015;31(4):323-333.
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