1. ESPECTROMETRÍA DE MASA
IVON LOPEZ
Algunas aplicaciones de la
Espectrometría de Masa
en biología y biomedicina

2. Espectrometría de Masa
• La Espectrometría de Masa es una técnica que
permite determinar la masa de moléculas por
medio de la medida de la relación masa/carga
(m/z).
• La medida de masas moleculares involucra la
producción, separación y detección de iones
moleculares en fase gaseosa.
• Cada molé cula puede originar iones moleculares
con distinto número de cargas ( y distintas m/z).
• La masa molecular es una propiedad física
fundamental e inalterable de la materia……

3. Bioespectrometría
• Aplicación de la Espectrometría de Masa al
estudio de bio-moléculas: identificación,
niveles, modificaciones.
• Incluye la combinación de herramientas de la
Bioquímica (cromatografía, electroforesis,
bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre
otras) con la Espectrometría de Masa.

4. Espectrometría de masa y Biología
Las medidas de masa de péptidos y proteínas
(...y de otras macromoléculas) eran
extremadamente difíciles de realizar hasta fines
de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos
métodos para producir iones en fase gaseosa:

5. Espectrometría de masa:
Espectrómetro de masa MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF
(Applied Biosystems Voyager DE-PRO) (Applied Biosystems 4800 Analizer)

6. 4000 Series MALDI TOF/TOF™ Analyzer Training
Analizador de masa
L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera
que los iones más livianos reciben una mayor aceleración .
Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas
mayores. La medida del “tiempo de vuelo” de cada uno se puede usar
para calcular su masa. © 2007 Applera Corporation and MDS Inc.
6

7. Espectro de masa de péptidos generados por digestión con tripsina “in
gel” de una proteína de membrana
Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

8. Elemento Masa %
1
H 1.0078 99.985
2
H 2.0141 0.015
12
C 12.0000 98.90
13
C 13.0034 1.10
14
N 14.0031 99.634
15
N 15.0001 0.366
16
O 15.9949 99.762
17
O 16.9991 0.038
18
O 17.9992 0.200
31
P 30.9738 100.00
32
S 31.9721 95.02
33
S 32.9715 0.75
34
S 33.9679 4.21
36
S 35.9671 0.02
79
Br 78.9183 50.69
81
Br 80.9163 49.31

9. Resolución en MALDI-TOF
Voyager Spec #1=>BC=>RSM10000=>MC=>MC=>MC[BP = 1672.8, 3222]
1672.917
1672.92 3222.3
100
90
80
70
60
% Intensity
50
40
Modo lineal
30
Resolucion: 2467
20 (FWHM)
10
0 0
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)
Voyager Spec #1=>BC=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 1672.9, 16255]
1672.918 1.6E+4
100
90
80
70
60
% Intensity
50
Modo reflector
40
Resolucion:8500
30
20
(FWHM)
10
0 0
1655.0 1662.2 1669.4 1676.6 1683.8 1691.0
Mass (m/z)

12. CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR
ESPECTROMETRÍA DE MASA
• Identificación de proteínas
– comparación correlativa en una base de datos de
secuencias
• Control de calidad
– proteínas recombinantes, reacciones de modificación
• Modificaciones postraduccionales
– fosforilación, glicosilación, metilación, etc.
• Niveles de expresión
– métodos cuantitativos

13. Identificación de proteínas
1000
m/z (m/z)
1500
Mass
2000
Extracción de péptidos
y análisis de masas
Separación en gel 2D
Selección de la muestra
Tratamiento con una enzima proteolítica
Búsqueda en banco de datos

14. Identificación de proteínas por MALDI-TOF
• Proteína aislada
• Proteína identificada por la masa de los péptidos
(PMF), generados por un método específico:
– Enzimático o químico
• Para su identificación, la secuencia de la
proteína debe estar en una base de datos
• La identificación es probabilística: según criterios
estadísticos

15. Identificación de Proteínas de Células Huésped en
materia prima del Factor G-CSF
Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF
36 A
29
24
20
B
14
B
A

16. ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE
PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA
Proteína
Enzima
Mezcla de péptidos
Espectrómetro de masa
Alternativamente,
Masa de los péptidos
secuenciación de
cada péptido
Búsqueda en bancos de datos;
Verificación de secuencia y
Identificación de la proteína detección de modificaciones
postraduccionales .…
MS/MS

17. • Modelo: Voyager DE-PRO (Applied Biosystems, USA).
• Datos técnicos: • Posibilidades de operación:
- Laser de nitrógeno (λ 337 nm) - Modo lineal
- Voltaje de aceleración: hasta ± 25 kV - Modo reflector
- Tubo de vuelo: 1.3 m (modo lineal); 2.0 m (modo reflector) - "Delay extraction" (DE)
- Sistema alto vacío: 2 bombas turbo-moleculares (10 -8 - "Post Source Decay“ (PSD)
Torr) - "Collision-Induced Dissociation“ (CID)
- Rango de masa: 500 Da hasta > 400 kDa
- Exactitud de masa : hasta 0.002% (20 ppm)
- Sensibilidad (péptidos): subpicomolar