JUNE PRESENTATION

1. PRESENTA: M. en C. Claudia Edith Bailón Soto.
Clase de Instrumentación analítica.
Durango, Dgo., 1° de junio de 2010.

2.  El entendimiento definitivo de la molécula
de DNA f(secuencia nucleotídica).
 Función de un gen/forma deducida
 Ejm. Secuencias deducidas vs secuencias
de genes con funciones conocidas.

3.  Secuenciación nucleotídica de un
fragmento de DNA:
Dos opciones
Proc. Químico Proc. Enzimático
por Alan Maxam por Fred Sanger, o
y Walter Gilbert. “dideoxinucleótido”

4.  Por hidrólisis química excesiva, _-_ implica
degradación química de un segmento.
 Escisión parcial en 5 rx´s químicas por
separado, f(base).
 Hebra de DNA marcada en el extremo 5´
con 32P “primers” de oligonucleótidos para
generar productos de cadena radio-
marcada terminal que pueden detectarse
en geles de secuenciación por auto-
radiografía (Maxam & Gilbert, 1977-1980).

5.  Preparación de secuenciación química
con marcaje terminal.
  Las rx´s de escisión generan 5
poblaciones de moléculas radio-marcadas
extendidas a partir de un punto común
(terminal marcada radiactivamente) al sitio
de escisión química.
 Cada población  mezcla de moléculas,
longitudes determinadas por localización
de base particular a lo largo del DNA.

6.  Poblaciones analizadas, electroforesis
en geles de poliacrilamida. Moléculas
terminales marcadas se detectan por
autoradiografía.
 Método con pocos cambios inicio.
2 etapas 1.-
Tipo de
 Rx´s de escisión
base
2.- Remoción de
*Enlaces fosfodiester su azúcar Modificación química
5´y 3´ en la base modificada
son troceados

7.  Modificaciones químicas usadas.
BASE MODIFICACIÓN ESPECÍFICA
G Metilación con N7 con metil-sulfato, pH=8 C8-C9
susceptible a escisión por base.
A+G Piperidina pH=2 debilita enl. glicosídicos de Ad y Gua al
+++N-N en anillos de purina _-_despurinización.
C+T Hidrazina abre el anillo de pirimidina que se recicla en
forma de 5 miembros susceptible a remoción.
C En presencia de NaCl 1.5M sólo citosina reacciona con
hydrazina.
A>C Con NaOH al 1.2N y a90°C escisión más fuerte en A y
una más débil en C.

8.  Otra manera del alcanzar el objetivo:
  incluír [a-32P]dNTPs en reacciones de
secuenciación cíclica (al usar PCR y
primers terminales marcados).
 Desventaja:
 Producción de geles menos
ordenados y con respaldos altos, por lo
tanto, ( recomendación).

9. Conjunto de bandas se pueden leer a partir de la imagen del gel.
3´ 2´
Didesoxinucleótido: molécula hecha por el
hombre (-OH), en los carbonos 2´y 3´del residuo
de ribosa (Sanger % Coulson, 1978).

10.  Durante la replicación del DNA, un
nucleósido trifosfato se une por su grupo
5´a-fosfato con el grupo 3´hidroxil del
último nucleótido.
5´
3´ 2´

11.  Cuando llega un didesoxinucleótido al final-----
--- síntesis de DNA se detiene porque ya no se
puede formar un enlace fosfodiester.
dNTP
Desoxirribo-
nucleósido Se
trifosfato bloquea
Se detiene la síntesis la síntesis
de DNA

12.  La terminación de la síntesis del DNA en
fragmentos truncados de diferente tamaño
es la característica quintaesencial del
método de secuenciación del dideso-
xinucleótido; pero, otras condiciones son
necesarias también.
PRIMER
P OH
CGTAGCTTA-
123456789
CADENA DE
TEMPLETE

13.  1.- Implica el recocido(calor/frio) de un
oligonucleótido sintético (17-24mer) a un
segmento predeterminado de una
hebra del vector clonante cerca del sitio
de inserción del DNA clonado.
 El oligonucleótido actúa como
secuenciador primario al proveer el
3´OH para el inicio de la síntesis de DNA.

14.  2.-La muestra de DNA primaria es dividida
en 4 tubos de reacción por separado.
Cada tubo contiene 4
desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP), de los cuales, uno es radiomarcado,
a uno de así como uno de los 4
didesoxinucleótidos (ddATP, ddCTP, ddGTP
y ddTTP).
 [c]ddATP en cada tubo de reacción es
ajustada cuidadosamente para
incorporarla a la mezcla de cadenas
crecientes en todo sitio posible.

15.  Condición experimental alcanzada en
cada tubo de reacción.
 _-_ después de la síntesis enzimática de
DNA con DNA polimerasa, cada tubo
contendrá un juego único de
oligonucleótidos que incluyen la
secuencia primaria.

16.  Las reacciones de síntesis se detienen al
adicionar formamida (impide pareo de
bases).
 Las moléculas de DNA son separadas por
electroforesis en gel de poliacrilamida*
separación de piezas de DNA de diferente
tamaño.
 La auto-radiografía del gel muestra los
fragmentos de DNA radiomarcardos
producidos durante sint. Enzimática.

17.  La secuencia de un segmento de la pieza
clonada de DNA se determina al notar el
orden de las bandas, tan preciso como sea
posible, desde la base hacia la cima de la
autradgr.
 Pueden resolverse alrededor de 250-350
bandas.
 Normalmente, la secuencia primaria se
posiciona entre los 10 y 20 nucleótidos
alejados del sitio de inserción del DNA
clonado.
 Investigador: identificación precisa del 1er
nucleótido del DNA clonado.

19.  Ventaja:
 Al usar los ddNTPs análogos a las bases
en rx´s intéticas por separado, se
pueden generar 4 poblaciones de
oligonucleótidos que terminan en
posiciones diferentes en la hebra
templete.
 _-_ el Sanger, fue el método de elección
al secuenciar DNA, antes de otras más
novedosas.