Estructura del dna bacteriano

1. Estructura del DNA
bacteriano
Por Oloarte R., Delgado B., Coyotl R., Estrada M. y Estrada S.

2. Introducción
 El ADN es una molécula
enormemente larga que no es
recta ni homogénea en toda su
longitud. Se puede curvar según
las circunstancias y además se
puede enrollar o desenrollar
respecto al modelo canónico
definido por Watson y Crick.
 La variación en la helicidad se
traduce en una tensión, tanto
positiva como negativa, que se
libera formando espirales de
doble hélice en un sentido u
otro

3. • El ADN circular cerrado es capaz de adoptar una
estructura terciaria denominada
superenrollamiento, que implica el enrollamiento del
eje de la doble hélice sobre si mismo

4. Superenrollamiento
 Es el retorcimiento o giro
sobre si misma de una hélice,
de forma que su eje no sigue
una línea recta, sino otra
héliceabrir glosario. Puesto
que la hélice de partida ya
lleva implícito un
enrollamiento, a la nueva
hélice descrita por el eje de la
primera se la llama una
"superhélice".
 Un ejemplo muy intuitivo es el
cordón del teléfono, que tiene
un enrollamiento helicoidal y
con el uso alcanza un
superenrollamiento

5. Superenrollamiento
 El superenrollamiento sólo
permanece si los extremos se
mantienen retenidos o
sujetos, pues de no ser así el
libre giro "deshace" las
superhélices.
 Tal sujeción puede ser
externa o bien debida a la
unión de ambos extremos
entre sí, de modo que la
cuerda (o la molécula de
DNA) forme un círculo (no en
el sentido geométrico, sino
en el de línea cerrada).
 En este caso la restricción de
movimiento es permanente.

6. Superenrollamiento
 En 1963 se descubrió que el DNA
bicatenario del virus de polioma existe
en forma de círculo cerrado.
 En la actualidad, se admite que ésta es
la forma típica del DNA en las bacterias.
 Además, las grandes moléculas del DNA
nuclear en los organismos superiores,
aun siendo lineales y no circulares,
forman grandes bucles retenidos
mediante proteínas, de modo que cada
bucle es bastante análogo al DNA
circular cerrado.
 Por todo ello, el DNA en las células de
todo tipo experimenta constantemente
fenómenos de superenrollamiento.

7. Topoisomerasas
Son enzimas capaces de actuar sobre
la topología del ADN, ya sea
enredándolo para permitir que se
almacene de manera más compacta o
desenredándolo para que controle la
síntesis de proteínas y para facilitar la
replicación del mismo.
Las topoisomerasas son capaces de
cortar y pegar ya sea una o dos de las
hebras de azúcar fosfato que forman
el armazón o esqueleto del ADN.
Estas
enzimas son
necesarias
debido a los
inherentes
problemas
causados
por la
configuració
n estructural
del ADN

8. Tipos de topoisomerasas
 Las topoisomerasas se clasifican en las de
tipo I, que rompen una sola hebra, y las de
tipo II, que rompen las dos hebras al mismo
tiempo.
 Las topoisomerasas I actúan realizando un
corte transitorio en una de las hebras de un
duplex de ADN superenrollado que cambia el
numero de enlace en incrementos de una
unidad y que da como resultado la relajación
del DNA superenrollado

9. Mecanismo de Acción
 Para relajar el DNA las topoisomerasas 1(a) se unen al DNA
y separan localmente las hebras complementarias; (b) a
continuación, cortan una de las hebras y se unen a los
extremos generados; © hacen pasar la hebra intacta
atreves del corte y finalmente restablecen el enlace
fosfodiester. El resultado es una estructura relajada (d).

10. Mecanismo de Acción de
Topoisomerasas II
 Las topoisomerasas II cambian el numero
de enlace del DNA uniéndose a la
molécula de DNA y pasando un segmento
de DNA a través de un corte reversible
formando en un segmento diferente de la
misma molécula de DNA.
 Las topoisomerasas II actúan fijándose a
una molécula de DNA, de tal forma que se
generan dos bucles súper enrrollados.

11. Mecanismo de accion de la Girasa
 Este se ilustra utilizando como ejemplo la conversión de
una molécula de DNA relajado en una molécula que
contiene dos superenrollamientos, uno positivo y otro
negativo (primer paso).
 El paso de un segmento de DNA a través del
superenrollamiento positivo mostrando en la parte derecha
de la figura (tercer paso) cambia el numero de enlace,
dando lugar a una molécula que contiene dos
superenrollamientos negativos.

12. Topoisomerasas tipo III
 Pueden relajar vueltas superhelicoidales sin
necesidad de una fuente de energía, tal como la
hidrolisis de ATP.
 Estas topoisomerasas pueden estar
especializadas en la resolución de los productos
encadenados de DNA circular (eslabonados) que
se generan justo antes de que se complete la
replicación de DNA
 Una clase poco usual de topoisomerasas, las
girasas inversas, se han aislado de varias
especies de arquebacterias. Estos enzimas tienen
la notable propiedad de introducir vueltas
superhelicoidales positivas en el DNA.
 El súper enrollamiento positivo podría proteger el
DNA de las condiciones desnaturalizantes de alta
temperatura y acidez del hábitat de las bacterias

13. Molécula Modelo
 Para entender mejor los conceptos y
terminología relacionados con el
superenrollamiento, emplearemos como ejemplo
una molécula bicatenaria de DNA de 104 pb
(pares de bases; es decir, la asociación de dos
hebras con 104 nucleótidos cada una).
 Si adopta la conformación más habitual, la doble
hélice de tipo B, habrá exactamente 10 vueltas
de hélice.
 Decimos que la torsión de la molécula tiene un
valor de 10 (T=10, o Tw=10, del inglés twist).

14. Ahora supongamos que flexionamos la molécula, aproximando sus
extremos para formar un círculo. Puesto que el número de vueltas de
hélice en la molécula es entero (10 en este ejemplo), los extremos de
ambas hebras quedarán correctamente alineados con posibilidad de
unirse por enlaces fosfodiéster (3' con 5' y 5' con 3'). Si se realiza esa
unión, tendremos una molécula circular cerrada.
Al ser esta molécula plana y sin tensión estructural, tiene una
conformación relajada (tiene superenrollamiento cero) (Estrictamente,
lo que es plano no es la molécula, sino la trayectoria del eje de la doble
hélice.)
Como consecuencia del cierre de la molécula, las hebras ya no se
pueden separar físicamente (por ejemplo, tirando de ellas en sentidos
contrarios), sino que están trabadas, ligadas, entrelazadas.
Concretamente, en este ejemplo están entrelazadas 10 veces, y se dice
que la molécula tiene un índice de ligazón de 10 (L=10, o Lk=10, del
inglés linking number).

15. Restricción topológica
 Un valor Lk = 0 significa que las dos hebras no están
ligadas, es posible separarlas. Cuando Lk es distinto
de cero las dos hebras están ligadas físicamente, es
decir, no se pueden separar; esto es así a pesar de
que no hay enlaces covalentes entre ellas; para
referirnos a esta unión física sin enlace covalente se
dice que hay un enlace topológico.
 En una molécula con enlace topológico sólo se
pueden separar las hebras mediante ruptura de un
enlace covalente (fosfodiéster) o, dicho de otro modo,
cortando una hebra. Lo mismo es aplicable para
cualquier proceso que cambie el valor Lk (por
ejemplo, de Lk=10 a Lk=9). Por la misma razón, la
deformación, plegamiento, etc. de las hebras, sin
cortarlas, no altera el índice de ligazon.

16. Generación de superenrollamiento
 Si, en lugar de unir los extremos de la molécula lineal tal y como
quedaron enfrentados, antes rotamos uno de ellos sobre sí
mismo, de modo que se reduzca el enrollamiento de la doble
hélice en una vuelta (la torsión es menor, Tw=9), y entonces
unimos los extremos, tendremos una molécula con sus hebras
menos entrelazadas, con menor índice de ligazón, Lk=9.
 Al mismo tiempo, los 104 pb ahora se reparten en sólo 9 vueltas
de hélice, por lo que en lugar de una vuelta cada 10,4 pb habrá
una cada 11,56 pb (=104/9) y la conformación no será ya de tipo
B.
 Esto supone una inestabilidad para la molécula, una tensión
estructural (similar a la que tiene el cable retorcido del teléfono si
intentamos aplanarlo sobre la mesa sin que forme bucles).
 La tensión se puede liberar si la molécula forma un bucle sobre sí
misma, una vuelta superhelicoidal; así recupera la torsión más
estable (Tw=10, con 10,4 pb/vuelta).
 Al número de vueltas superhelicoidales se le denomina
retorcimiento (W o Wr, del inglés writhe). En este caso, debe
considerarse de signo negativo (Wr=–1), pues suple la
disminución de torsión inicial. El giro de esta superhélice es
dextrorso, hacia la derecha, como se puede comprobar con un
modelo de cuerda

18. Topoisomerasas
 En las células, existen enzimas que catalizan este
proceso de superenrollamiento.
 Se les denomina topoisomerasas, pues convierten
unos topoisómeros en otros.
 Hay topoisomerasas de tipo I (hidrolizan un enlace
fosfodiéster en una hebra, hacen pasar la otra hebra
a través del corte y vuelven a unir los extremos de la
primera, el indice de ligazón varía en una unidad)
 Topoisomerasas tipo II (hidrolizan sendos enlaces
fosfodiéster en ambas hebras y hacen pasar otra
doble hebra a través del corte, resellando éste de
nuevo; de este modo, el índice de ligazón varía en
dos unidades de una sola vez)

19. Funciones
 Mediante el superenrollamiento, las moléculas de DNA se
compactan y ocupan un volumen inferior en varios órdenes de
magnitud.
 El superenrollamiento permite que se acerquen regiones de la
molécula alejadas en su estructura primaria, y esto es clave en
procesos como la regulación de la replicación y la transcripción.
 Del grado de compactación local conseguido depende la
regulación de la accesibilidad a la información genética y, por
consiguiente, la regulación de la expresión de los genes
(transcripción).
 Para que puedan tener lugar los procesos de replicación (copiado
del DNA) y transcripción (copiado de la información del DNA en
una molécula de RNA) es necesario que se separen las dos hebras
complementarias, lo cual supone un desenrollamiento local de la
doble hélice. Éste (mediado por proteínas específicas,
principalmente polimerasas y helicasas) provoca
sobreenrollamiento en las regiones adyacentes. Además, dificulta
el desenrollamiento adicional, necesario para la progresión de los
citados procesos a lo largo de la molécula.

21. Características del
superenrollamiento
Positivo Negativo
 Superhélice a derechas,
dextrorsa.
 Se encuentra de forma
natural en las eubacterias.
 En eucariotas es más
frecuente en las zonas
codificantes (facilita que se
abra la doble hebra para la
transcripción).
 En eucariotas,
transitoriamente por detrás
de la RNApol durante la
transcripción.
 Une preferentemente
intercalantes que
desenrollan la doble hélice
(p.ej., bromuro de etidio y
cloroquina)
 Superhélice a izquierdas,
sinistrorsa.
 Se puede encontrar en
arqueobacterias.
 En eucariotas,
transitoriamente por
delante de la RNApol
durante la transcripción
Une preferentemente
ligandos que aprietan la
doble hélice (p.ej.,
netropsina)

22.  Torsión: Tw – T
Numero o Índice de enroscamiento (Twist)
 Retorcimiento: Wr – W
Numero o Índice de retorcimiento (Writhe)
 Índice de ligazón Lk – L
Numero o Índice de enlace (Linking)

23. Agentes que modifican el
superenrollamiento
 La geometría de una molécula superenrollada se
puede ver afectada por cualquier agente que
altere la torsión intrínseca de la doble hélice. Por
ejemplo, un aumento de temperatura reduce la
torsión y un aumento de fuerza iónica puede
aumentarla.
 Otro factor importante es la presencia de los
denominados agentes intercalantes, moléculas
planas e hidrófobas que se insertan entre los
pares de bases apilados de la doble hélice, por lo
común forzando ésta a una apertura, un
desenrollamiento parcial, una reducción de la
torsión

24. Bromuro de etidio
 El sistema aromático de anillos condensados es
responsable del intercalamiento. Su unión reduce
localmente la torsión de la doble hélice en aprox. 26°,
lo que habitualmente se compensa con un aumento
del retorcimiento (superenrollamiento negativo).
 Por otro lado, la fluorescencia propia del bromuro de
etidio aumenta mucho al unirse al DNA. Por esta
razón, se utiliza habitualmente para detectar la
posición del DNA en los geles de electroforesis.

25. Cloroquina
 Se utiliza a menudo en estudios de
superenrollamiento de plásmidos.
 Además, es uno de los fármacos clásicos
para el tratamiento de la malaria, aunque
su principal mecanismo de acción no
depende de su capacidad intercalante.

26. Amsacrina
 4'-(9-acridinilamino)-3'-
metoximetanosulfonanilida
 El intercalante es el anillo de acridina; el
anillo de metanosulfonanilida se sitúa en
el surco menor.
 Es inhibidor de la topoisomerasa II.

27. Analisis Experimental
 Las diferencias de superenrollamiento de un DNA
circular suponen un volumen diferente de la
molécula, pues el superenrollamiento la compacta.
Debido a esto, se pueden detectar tales diferencias
separando los topoisómeros mediante electroforesis
en gel. Por ejemplo:
Análisis por electroforesis del
superenrollamiento de un
plásmido de 3000 pb, en gel
de agarosa al 1,75%,
revelado con bromuro de
etidio bajo luz ultravioleta.
A = plásmido intacto.
B = plásmido abierto por
corte con una endonucleasa.
C...H = plásmido tratado con
concentraciones de
topoisomerasa y tiempos
decrecientes.

28. Propiedades de las
topoisomerasas