19 aerobios

LABORATORIO
CESECCA
PROCEDIMIENTO PEE/CESECCA/MI/19
ENSAYO DE RECUENTO DE AEROBIOS TOTALES
Edición Nº 1
Fecha de emisión: Enero 2007
COPIA CONTROLADA Nº: Fecha: ...../...../.....
ASIGNADA A:
Elaborado por:
Analista – Blog. Gavrik Larrea
Firma. Fecha:
Revisado por:
Jefe Técnico – Dra. Norma Santamaría
Firma. Fecha:
Aprobado por:
Dirección General – Ing. Leonor Vizuete
Firma. Fecha:
DIFUNDIDO A (Firma, fecha)
PG0102-01
UNIVERSIDAD LAICA ELOY ALFARO DE MANABI
ESCUELA DE INGENIERIA INDUSTRIAL
CENTRO DE SERVICIOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD

UNIVERSIDAD LAICA ELOY ALFARO DE MANABÍ
ESCUELA DE INGENIERÍA INDUSTRIAL
CENTRO DE SERVICIOS PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD
“CE.SE.C.CA.”
PROCEDIMIENTO ESPECIFICO DE ENSAYO
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Fecha: Enero 2007
Edición: 01
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EDICIÓN FECHA HOJAS AFECTADAS CAUSA
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INDICE
1. OBJETO
2. ALCANCE
3. REFERENCIA
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION
3.2. DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE
4. GENERAL
4.1. PRINCIPIO
4.2. DEFINICIONES
5. DESCRIPCION
5.1. EQUIPO Y MATERIALES
5.1.1. Equipos
5.1.2. Materiales
5.1.3. Reactivos
5.2. PREPARACIÓN
5.2.1. Muestra
5.2.1.1. Tipos de muestras.
5.2.2. Preparación de soluciones
5.2.3. Preparación de equipos
5.3. PROCEDIMIENTO
5.4. TRATAMIENTO DE RESULTADOS
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD
5.6. PUNTOS CRITICOS
5.7. CONTROL DE CALIDAD
5.7.1. Blanco de reactivos
5.7.2. Exactitud
5.7.3. Repetibilidad
5.7.4. Intercomparación
5.8. CRITERIOS DE ACEPTACION
6. ANEXOS
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1. OBJETO
Describir la metodología a seguir para el recuento de aerobios totales, así como las medidas
necesarias de seguridad y de calidad.
2. ALCANCE
Este Procedimiento es de aplicación al ensayo de aerobios totales realizados a todos los alimentos
con excepción de los productos fermentados o madurados tales como yogurt, ciertos tipos de
embutidos y quesos.
3. REFERENCIA
3.1. DOCUMENTOS UTILIZADOS EN LA ELABORACION
PG/CESECCA/01 Procedimiento para la elaboración de documentos.
Bacteriological Analytical Manual. Food and Drug Administration (FDA) 8ª. Edición (1995).
3.2. DOCUMENTOS A UTILIZAR CONJUNTAMENTE
PE/MI/0201 – Formato Primario.
MC2003 – Orden de análisis.
MC2203 – Informe parcial de Ensayos.
PU/MI/0301 - Registro de esterilización.
Registro de control de ambiente.
4. GENERAL
4.1. PRINCIPIO
El número de microorganismos aerobios encontrados en alimentos es uno de los indicadores
microbiológicos de calidad más utilizado. Los resultados de este análisis permitirían:
· Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección.
· Determinar si las temperaturas aplicadas en los procesos fueron las adecuadas.
· Determinar el origen de la contaminación durante los procesos de elaboración de los alimentos.
· Verificar condiciones de almacenamiento y transporte.
· Obtener información acerca de la vida útil de los alimentos.
· Indicar alteración incipiente en ciertos alimentos.
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4.2. DEFINICIONES
ºC: grado Celsius.
%: por ciento.
cm2: centímetro cuadrado.
cm3: centímetro cúbico.
l: litro.
5. DESCRIPCION
5.1. EQUIPO Y MATERIALES
5.1.1. Equipos
· Autoclave MI-EI/09.
· Balanza semi-analítica MI-EI/15.
· Baño de agua o baño maría MI-EI/18.
· Contador de colonias MI-EI/28.
· Estufa MI-EI/35.
· Incubadora bacteriológica regulada a 37ºC ± 1ºC MI-EI/47.
· Microondas MI-EI/121.
· Plato calentador/agitador magnético MI-EI/59.
· Refrigeradora MI-EI/
5.1.2. Materiales
· Abrelatas.
· Algodón.
· Bandejas plásticas rectangulares.
· Botella de vidrio 1 l.
· Cuchillo de acero inoxidable.
· Encendedor.
· Magneto.
· Matraz erlenmeyer de vidrio de 1000 cm3 MI-MV/16.
· Espátula de acero inoxidable.
· Fundas estériles.
· Gasa.
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· Hilo.
· Lápiz graso.
· Mechero bunsen.
· Papel toalla absorbente.
· Papel kraf.
· Piseta de plástico 500 cm3.
· Placas petri de vidrio de 90 - 100 mm de diámetro.
· Pipetas de vidrio de 10 cm3 graduadas en 1 cm3 tipo A MI-MV/
· Recipiente plástico.
· Tijera de acero inoxidable.
· Vaso de precipitación de vidrio de 600ml MI-MV/114.
5.1.3. Reactivos
· Agar estándar para Recuento en Placa (Plate Count Agar) MI-RE/81.
· Agua de peptona tamponada 0,1% MI-RE/54.
· Agua destilada.
· Alcohol etílico potable al 80% MI-RE/56.
· Cloro activo 10%.
· Germidal.
5.2. PREPARACIÓN.
5.2.1. Muestra.
Todas las muestras del laboratorio CESECCA tienen una codificación que las identifica, antes,
durante y después del ensayo.
5.2.1.1. Tipos de muestras.
Productos frescos, congelados y precocidos: Desinfectar con alcohol potable al 80% todo el
empaque de la muestra. Una vez recibida la muestra se debe realizar el análisis lo más pronto
posible; en el caso de que se tenga que postergar el análisis, se debe seguir el siguiente
procedimiento: las muestras de producto congelado mantenerlas a -18º C, entre 0º y 4º C los
alimentos perecibles no congelados y por un periodo no superior a 36 horas a temperatura ambiente
las muestras no perecibles (conservas o alimentos de baja humedad). Las muestras serán trabajadas
durante todo el proceso cerca del mechero bunsen encendido y con el aire acondicionado apagado.
Abrir el empaque de la muestra con una tijera de acero inoxidable previamente desinfectada con
alcohol al 80%. Pesar 30 gramos de la muestra en una bolsa estéril codificada colocada en un vaso
de precipitación que previamente se ha tarado; cortar el producto con un cuchillo de acero
inoxidable desinfectado y flameado previamente con alcohol al 80%.
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Añadir a la bolsa estéril con la muestra, 270 cm3 de agua de peptona tamponada 0,1%; con lo que se
obtiene la dilución 101. Homogenizar la muestra con el diluyente manualmente.
En el caso de que se conozca que la muestra está muy contaminada por aerobios se debe diluir 1
cm3 de la dilución anterior (dilución 101) a un tubo que contenga 9 cm3 de agua de peptona
tamponada al 0,1% para obtener la dilución 102 y así sucesivamente obteniéndose las diluciones
necesarias. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener la funda
estéril en refrigeración.
Conservas en lata: Desinfectar la lata con alcohol etílico potable al 80%. Abrir las conservas
completamente con un abrelatas seco y desinfectado en alcohol al 80%. Pesar 30 gramos de muestra
del centro de la conserva en una bolsa estéril codificada colocada en un vaso de precipitación que
previamente se ha tarado; tomar el producto con la espátula desinfectada y flameada previamente
con alcohol al 80%.
Añadir a la bolsa estéril con la muestra 270 cm3 de agua de peptona tamponada 0,1%, con lo que se
obtiene la dilución 101. Cerrar herméticamente la funda estéril. Homogenizar la muestra con el
diluyente manualmente. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener
la funda estéril en refrigeración.
Conservas en envase de vidrio: Desinfectar el envase con alcohol etílico potable al 80%. Pesar 30
gramos de muestra del centro de la conserva en una bolsa estéril codificada colocada en un vaso de
precipitación que previamente se ha tarado; tomar el producto con la espátula desinfectada y
flameada previamente con alcohol al 80%.
Añadir a la bolsa estéril con la muestra 270 cm3 de agua de peptona tamponada 0,1%, con lo que se
obtiene la dilución 101. Cerrar herméticamente la funda estéril. Homogenizar la muestra con el
diluyente manualmente. En el caso de que no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener
la funda estéril en refrigeración.
Conservas en pouch: Desinfectar con alcohol potable al 80% todo el empaque de la muestra. Abrir
el empaque de la muestra con una tijera de acero inoxidable previamente desinfectada con alcohol
al 80%. Pesar 30 gramos de la muestra en una bolsa estéril codificada colocada en un vaso de
precipitación que previamente se ha tarado; cortar el producto con un cuchillo de acero inoxidable
desinfectado y flameado previamente con alcohol al 80%.
Añadir a la bolsa estéril con la muestra, 270 cm3 de agua de peptona tamponada 0,1%; con lo que se
obtiene la dilución 101. Homogenizar la muestra con el diluyente manualmente. En el caso de que
no se pueda trabajar la muestra inmediatamente mantener la funda estéril en refrigeración.
5.2.2. Preparación de soluciones.
Agua de peptona tamponada 0,1%.
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· Pesar 1 gramo de agua de peptona tamponada en una botella de vidrio de 1l enjuagada
previamente con agua destilada.
· Añadir agua destilada hasta completar 1000 cm3.
· Cerrar bien y agitar manualmente hasta disolver.
· Girar la tapa de la botella ¼ hacia la izquierda aproximadamente.
· Esterilizar en autoclave por 15 min a 120ºC con 18 psi.
· Enfriar a temperatura ambiente.
· Mantener en refrigeración.
Agar estándar para Recuento en Placa (Plate Count Agar).
· Pesar 18 gramos en un matraz erlenmeyer de 1000 cm3.
· Añadir 800 cm3 de agua destilada.
· Colocar en el plato caliente a la máxima temperatura y agitar totalmente, hasta llegar a
ebullición.
· Transferir el agar a matraces identificados con la letra “P” de 500 cm3 o 250 cm3 para facilitar su
manejo posterior, colocándoles tapones de gasa con algodón y una cubierta superior de papel
kraf amarrada con hilo.
· Esterilizar en autoclave por 15 min a 120ºC con 18 psi.
· Enfriar los matraces al ambiente.
· Mantener el agar en refrigeración.
Germidal (clorhexidina + cetrimide) al 10%.
· Colocar 5 cm3 de Germidal en una piseta de 500 cm3.
· Completar el volumen de 500 cm3 con agua destilada.
5.2.3. Preparación de equipos
Autoclave:
· Verificar que el nivel interno del agua se encuentre a la altura de la base metálica interna del
equipo procurando que el nivel de agua no sobrepase la superficie de la misma. Utilizar para
este propósito agua destilada.
· Verificar que el nivel de agua de la botella externa no sobrepase la marca exterior que señala el
equipo.
· Introducir los medios de cultivo o agares en las canastillas del equipo.
· Colocar dos tiras de esterilización cada una dentro de un tubo de ensayo con tapa rosca en las
dos canastillas del autoclave para verificar el funcionamiento del equipo.
· Cerrar a presión.
· Encender con el interruptor ubicado en la parte izquierda inferior del equipo.
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· Asegurarse que el dial indique una temperatura de 121ºC y tiempo de 15 minutos y presionar
ENTER.
· Apagar cuando el equipo indique END en el dial o cuando la presión interna sea 0 psi.
· Abrir el autoclave y sacar las canastillas.
· Cerrar bien las tapas de los recipientes.
· Enfriar los medios a temperatura ambiente.
· Retornar las canastillas al equipo y cerrar.
Balanza semi-analítica:
· Encender la balanza y esperar a que se estabilice.
· Verificar que se encuentre nivelada.
Baño de agua:
· Verificar que el nivel de agua destilada se encuentre por encima de la marca superior interna del
equipo.
· Encender el equipo.
· Colocar a la temperatura requerida.
Contador de colonias:
· Encender.
· Verificar que la luz del equipo esté funcionando correctamente.
Estufa:
· Encender la estufa.
· Colocar la temperatura requerida.
· Una vez alcanzada la temperatura, colocar el tiempo de utilización.
Incubadora bacteriológica:
· Mantener regulada la incubadora bacteriológica a 37 º ± 1ºC.
· Abrir las puertas de la incubadora únicamente para ingresar o retirar materiales.
Microondas:
· Colocar el tiempo y la potencia de fundición.
· Proceder a fundir.
Plato calentador/agitador magnético:
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· Encender el plato.
· Colocar la temperatura y las revoluciones requeridas.
Calibración y verificación:
· Balanza semi-analítica según procedimiento de verificación y calibración.
5.3. PROCEDIMIENTO
· Fundir el agar en el microondas con una potencia del 50%. El tiempo de fundición dependerá
del volumen de agar. Mantener el agar totalmente fundido en baño de agua a 60ºC.
· Sembrar 1 cm3 de cada dilución en placas petri estériles previamente identificadas.
· Verter en cada placa petri aproximadamente 15 cm3 de agar que se encuentre aproximadamente
a 45ºC verificando esta temperatura manualmente.
· Mezclar el inoculo con el medio fundido. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación es
la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, hacerla girar
5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivén en una dirección
que forme ángulo recto, hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las manecillas del reloj.
· Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente, para prevenir el crecimiento de
colonias invasivas por acumulación de humedad. Incubar a 37 ºC ± 1ºC durante 48 ± 2 horas
colocando las placas invertidas.
5.3.1. Recuento de colonias y registro
Luego de cumplir el período de incubación realizar la lectura de las placas, considerando lo
siguiente:
· El contaje de las colonias se realiza siempre en el área de lavado.
· Realizar el recuento utilizando un contador de colonias de campo oscuro.
· Las colonias dudosas, examinarlas con lupa de mayor aumento para diferenciarlas de materias
extrañas.
· Anotar la dilución usada y el número de colonias contadas en cada placa.
Para el reporte del recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema:
5.3.1.1. Placas normales (25 - 250 colonias):
· Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo.
· Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño.
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· Anotar el número de colonias contadas en cada placa de cada una de las diluciones.
5.3.1.2. Casos especiales
Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera:
a. Placas sobrepobladas (más de 250 colonias):
· Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC)
cuando se dispone de placas normales en otras diluciones.
· Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en sectores
de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en placa ( RPES )
por estar fuera de los límites 25 y 250.
· Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 12 cuadrados, seleccionar 6
cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos formando ángulo
recto. Contar cada cuadrado sólo una vez.
· Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro cuadrados. En ambos casos,
multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm² por el área de la placa usada,
para estimar el número de colonias por placa.
· Si hay más de 100 colonias por cm², registrar como >100 col / cm².
b. Placas con menos de 25 colonias ( < 25 colonias )
· Cuando las placas de las diluciones tienen menos de 25 colonias cada una, proceder como en el
punto 1.
c. Placas sin desarrollo de colonias
· Cuando ninguna de las placas presenta desarrollo o crecimiento de colonias se registran sin
desarrollo.
d. Crecimiento invasivo
Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos:
· El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración de un
grupo de bacterias, cuando la placa petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota analizada.
Si solamente existe una cadena, contar como una colonia. Si una o más cadenas parecieran
originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia.
· El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el agar
y el fondo de la placa petri.
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· El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del agar.
Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se origina el
crecimiento invasivo.
Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuida en el medio, las bacterias raramente
desarrollan colonias invasivas.
Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias solamente:
· Si el área invadida no excede la mitad de la placa.
· Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida.
· Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio.
5.4. TRATAMIENTO DE RESULTADOS
Los datos obtenidos de la lectura son registrados en el formato primario PE/MI/0201 y revisados
por Jefe Técnico del Laboratorio. Luego son trascritos al formato de informe parcial de ensayos
MC2204.
5.5. MEDIDAS DE SEGURIDAD
· Realizar un control de ambiente diario de aerobios totales y hongos y levaduras en las áreas de
preparación de muestras y siembra.
· Utilizar mascarilla con filtros y gafas protectoras durante la preparación del agar.
· Mantener el área de trabajo limpia y en el caso de ser necesario desinfectada con alcohol al
80%.
· Limpiar semanalmente los mesones, superficies y equipos con germidal (clorhexidina +
cetrimide) al 10%. La solución preparada solo tiene validez por 7 días.
· Mezclar cuidadosamente el agar con el inoculo.
· No sobrecalentar el agar en el microondas y vigilar el agar mientras se está fundiendo.
Limpieza de las cajas petri.
· Colocar el agar sólido en una funda plástica con la ayuda de una espátula.
· Añadir suficiente cloro disuelto con agua a la funda procurando que el agar se moje con esta
solución y cerrar bien la funda para luego desecharla.
· Las placas son sumergidas en un recipiente plástico que contiene agua, jabón neutro y cloro
hasta el siguiente día.
· Al siguiente día, lavar las placas con jabón neutro. Luego de quitar completamente el jabón de
las placas con agua potable, sumergirlas en agua destilada.
· Colocar las placas en la estufa a 120ºC hasta secarlas por completo.
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Limpieza de las pipetas.
· Sumergir las pipetas en una solución de agua jabonosa hasta el siguiente día.
· Enjuagar las pipetas con agua potable. Sumergir las pipetas manchadas en una probeta con
acetona por un momento para luego ser lavadas con jabón neutro y agua.
· Sumergir las pipetas en agua destilada.
· Colocar las pipetas en la estufa a 120ºC hasta secarlas por completo.
Limpieza de los matraces.
· Lavar los matraces con jabón neutro y agua.
· Luego de quitar completamente el jabón de las placas con agua potable, sumergir los matraces
en agua destilada.
· Secar en la estufa a 120ºC.
Esterilización del material.
· Colocar en cada una de las pipetas limpias y secas un tapón de algodón.
· Envolver las pipetas en un paquete de papel kraf e hilo en el cual se especifica el número de
pipetas de cada paquete.
· Envolver las cajas petri completamente limpias y secas en un paquete de papel kraf e hilo.
· Esterilizar en la estufa por 2 horas a 180ºC ± 2ºC.
5.6. PUNTOS CRITICOS
· Cumplir el tiempo requerido para la esterilización e incubación.
· Trabajar con material limpio y cuando sea necesario material estéril.
5.7. CONTROL DE CALIDAD
5.7.1. Blanco de reactivos
Se elabora un placa petri sin inoculo.
5.7.2. Exactitud
5.7.3. Repetibilidad
Se repetirá una muestra cada día.
5.7.4. Intercomparación
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Los informes de intercomparación deben ser analizados y revisados por el Jefe Técnico y aprobados
por el mismo. Cuando los resultados no cumplan con los criterios esperados deberán tratarse como
un trabajo no conforme y cuando este haya sido levantado buscar la posibilidad de volver a
participar en otro ensayo intercomparación.
5.8. CRITERIOS DE ACEPTACION
6. ANEXOS
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