Mat

1. Nombre de la materia: Tecnologías de recombinación genética
Nombre del alumno: PALOMO PÈREZ FERNANDO.
Grupo: 5bv1
Actividad: proyecto de bioinformática
Fechade entrega:15/06/18
Introducción

2. La proteína que elegí fue lactato deshidrogenasa que es una enzima catalizadora,
su importancia radica en que es la encargada de producir ácido láctico.
La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima que interviene en reacciones
metabólicas que conducen a la obtención de energía, y se encuentra en casi todas
las células del organismo. No obstante, las células de corazón, hígado, músculo,
riñones, pulmones y las de la sangre son las que presentan niveles más elevados
de este enzima. Las bacterias también producen LDH.
El ácido láctico es un ácido orgánico valorado por su aplicación en la industria de
alimentos, farmacéutica, química y su potencial como materia prima para la
producción de polímeros biodegradables. Por lo tanto, la producción biotecnológica
de ácido láctico ha adquirido gran importancia industrial con respecto a la síntesis
química debido a que usa materias primas renovables y es amigable con el
ambiente.
En décadas recientes las investigaciones están direccionadas a optimizar la
producción de ácido láctico con la premisa de lograr mayor productividad,
rendimientos y bajo costo.
La producción biotecnológica de ácido láctico ofrece varias ventajas como el bajo
costo de los sustratos, bajas temperaturas de producción y bajo consumo de
energía (Rojan et al. 2007).
Las recientes investigaciones están enfocadas en encontrar nuevas y efectivas
fuentes nutricionales y nuevas técnicas de fermentación encaminadas a alcanzar
altas conversiones de sustrato y altos rendimientos en ácido láctico (Sule et al.
2004).
Bacterias ácido-lácticas.
Las bacterias ácido-lácticas (BAL) son microorganismos que tienen diversas
aplicaciones, siendo una de las principales la fermentación de alimentos como la
leche, carne y vegetales para obtener productos como el yogurt, quesos,
encurtidos, embutidos, ensilados, la mantequilla, la crema de leche, el kefir y el
koumiss, etc., Según se conoce alrededor de 4 milenios. Asimismo, las BAL son de
gran utilidad en la producción de vinos y cerveza.
Las bacterias lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos representadas por
varios géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en
común. En general las BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no
móviles, anaeróbicos, microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa, catalasa y
benzidina negativas, carecen de citocromos, no reducen el nitrato a nitrito y
producen ácido láctico como el único o principal producto de la fermentación
de carbohidratos (Carr y col., 2002; Vázquez y col., 2009).

3. Además, las BAL son ácido tolerantes pudiendo crecer algunas a valores de pH tan
bajos como 3.2, otras a valores tan altos como 9.6, y la mayoría crece a pH entre 4
y 4.5, permitiéndoles sobrevivir naturalmente en medios donde otras bacterias no
aguantarían la aumentada actividad producida por los ácidos orgánicos (Carr y col.,
2002).
El ácido láctico puede ser obtenido por vía biotecnológica a partir de derivados de
recursos renovables como azúcar, melaza, lactosuero, materiales amiláceos y
lignocelulósicos, almidones, yuca, licor de maíz.
Entre las principales BAL, seleccione una ya que se menciona que es una de las
que principalmente se utilizan, esta fue Lactobacillus delbrueckii.
El gen que sintetiza esta enzima esta ubicado en la posición 80669-82672 bp de
1864998 bp del ADN circular.
Esta información fue obtenida en la página del NCBI, en formato genebank, para
poder visualizar la información de interés.

5. Primers
El primer seleccionado fue buscado en la página http://primer3.ut.ee/ , en donde se
introduce la secuencia en formato fasta, se pueden seleccionar parámetros de
búsqueda según las necesidades o características deseadas.
Viendo la direccionalidad del vector y de la secuencia se decidió usar el primero que
es AAGGAATGGGAAGACGCTCA, para esto, se tuvo que verificar que fueran
específicos para ese gen, usando la función de Blast que se encuentra en la página
de NCBI, ahí se introdujo la secuencia del primer, una ves introducido, se buscaron
organismos que compartieran las mismas secuencias.
Algo importante en los primers es su temperatura de fusión y también resulto ser la
adecuada.

6. Lo que se encontró es que si era especifico, porque esa secuencia en ningún otro
organismo se encontraba, solo era igual para el que elegimos, que es lo que se
buscaba desde un inicio.

7. Análisis Filogenético
Con el uso de la función Blast de la página de NCBI se pudieron encontrar secuencias
semejantes.
También se busco un organismo que no es de la misma familia que el gen como OTU.
OTU = UnidadTaxonómicaOperativa
Organismos con secuencias similares

8. OTU
Como en el Blast solo mostraba secuencias de organismos de la misma familia, se tuvo que
buscar el gen aparte del Blast en una búsqueda en la página de NCBI.
Los organismos de donde saque las secuencias del gen que sintetiza la lactato
deshidrogenasa fueron:
Brachyspira hyodysenteriae (OTU)
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gasseri
Lactobacillus jensenii
Lactobacillus delbrueckii

9. Con las secuencias ya en formato fasta, se trasladaron a un programa llamado
MEGA 7, tiene diversas funciones entre ellas alinear las secuencias encontradas,
como se puede observar:
Ya con esto procedí, con el programa MEGA 7 a hacer los arboles filogenéticos y
compararlos.
Arboles filogenéticos (en este caso representado en forma de cladogramas)
1.Método: Maximum Likelihood basado en el modelo Jukes-Cantor

10. 2.Metodo: Maximum Likelihood basado en el modelo Kimura 2-parameter
3.Método: Neighbor-Joining basado en el modelo de numero de diferencias.

11. 4.Metodo: Neighbor-Joining basado en el modelo p-distance
Comparaciones de los arboles filogenéticos obtenidos.
En los 4 árboles hubo una consistencia, en el OTU, siempre sale que es antecesor
los demás organismos, aun que la forma de los arboles es diferente, se puede
observar que hay una relación cercana entre el organismo que escogimos ósea
Lactobacillus delbrueckii y el Lactobacillus fermentum, se puede apreciar que son
cercanos, los arboles obtenidos tienen rasgos en común que permiten decir que
estos arboles si son fiables para hacer un estudio filogenético. En todos los
arboles obtenidos las agrupaciones son constantes.

12. Con las secuencias alineadas en el programa MEGA 7 se pudo ahorrar tiempo, ya
que da la opción de convertir las secuencias de ADN, en secuencias de
aminoácidos:
Con esta alineación de aminoácidos se prosiguió a crear arboles filogenéticos para
compararlos también con los de ADN.
Arboles filogenéticos de aminoácidos (en este caso representado en forma de
cladogramas)
1. Método: Maximum Likelihood basado en el modelo Poisson correction

13. 2. Método: Maximum Likelihood basado en el modelo Equal input.
3. Método: Neighbor-joining basado en el modelo p-distance

14. 4.Método: Minimum Evolution basado en el modelo No. of differences
Al comparar los arboles obtenidos con las secuencias de ADN y los arboles
obtenidos con las secuencias de aminoácidos, podemos decir que son iguales,
que las agrupaciones son consistentes, y que el OTU, muy probablemente si es el
antecesor de los demás organismos en el árbol filogenético, además de que estos
métodos resultaron igual de factibles para este trabajo con las secuencias
proporcionadas, ya que la finalidad de los arboles filogenéticos es buscar un
parentesco entre los organismos, si se lograron identificar parentescos
consistentes con estos métodos.

15. Estructura 3D
La función de una proteína está determinada por su compacta forma tridimensional dictada por
una secuencia única de aminoácidos codificados por el genoma. Si una proteína se deforma o
desplaza, deja de funcionar correctamente. En los seres humanos, la acumulación de
proteínas mal plegadas (misfolded) está vinculada a una serie de trastornos, incluyendo la
enfermedad de Parkinson, el cáncer y la diabetes.
"Dada la importancia de la estructura de la proteína en todos los procesos biológicos, la
capacidad de predecir con precisión la estructura de la proteína a partir de la secuencia de
datos es uno de los problemas más difíciles de la biología de hoy", dijo Jianlin Cheng, profesor
auxiliar de ciencias de la computación en la Facultad de Ingeniería de Universidad de
Missouri.
Ya que es muy importante su estructura tridimensional, para este proyecto busqué la
estructura de la proteína que escogí en la pagina de PROTEIN DATA BANK
(ttps://www.rcsb.org), en esta nos encontramos con un buscador donde podemos desde
buscar por el nombre de la proteína, hasta el nombre del autor que hizo el modelo 3D.
Ya que tenia el nombre de la proteína y el organismo de donde provenía, lo busque
de esa forma.

16. En esta búsqueda la pagina nos muestra mucha información de la proteína como
desde que método fue realizado su modelo 3D, que fue difracción de rayos X.

17. Esta pagina nos da mucha información, para conocer sus características
principales, ya que el modelo 3D determina su función.
Modelo 3D:

18. Estrategia de Clonación
Organismo elegido para la transformación: Saccharomyces cerevisiae
Vector a utilizar: pYAC4
Las levaduras son microorganismos con los que comúnmente estamos en contacto,
encontrándolas en plantas, animales e insectos, sin embargo, no es del
conocimiento de la mayoría, que estos microorganismos también se encuentran en
superficies como las cáscaras de frutas y nuestra propia piel.
Las levaduras impactan diferentes sectores comerciales que incluyen alimentos,
bebidas, farmacéuticos y enzimas industriales. En general, las levaduras tienen
efectos benéficos en la vida humana. A pesar de esto, nuestro conocimiento de las
levaduras parece estar limitado a identificarlas como una clase de hongo, utilizado
en la producción de vino, cerveza y pan, por lo que es evidente, que siendo uno de
los microorganismos de mayor importancia industrial, modelo de estudio para
enfermedades como Alzheimer, Parkinson y cáncer, y con el que estamos en
constante contacto, es necesario que conozcamos más información de este
microorganismo.
Las levaduras presentan ventajas en la producción de proteínas debido a su rápido
crecimiento y modificaciones postransduccionales. La producción de proteínas con
fines terapéuticos en levaduras, ha sido estudiada desde 1980, con la producción
de proinsulina, sin embargo, actualmente es un área con reciente auge, debido al
incremento en la demanda de las proteínas terapéuticas. Otras de las proteínas
producidas mediante levaduras son la insulina y el factor de crecimiento epidérmico.
Además de la producción de proteínas, las levaduras en su estructura celular
presentan una alta concentración de aminoácidos, péptidos, carbohidratos y sales,
que pueden ser extraídos mediante la disolución en agua, previa digestión por
enzimas. A esta disolución se le conoce como extracto de levaduras, estos extractos
presentan propiedades antioxidantes y son utilizados como saborizantes en sopas,
salsas, preparaciones de carnes, condimentos y como suplementos alimenticios en
la comida de algunos animales como aves y cerdos.
La especie más conocida y utilizada es Saccharomyces cerevisiae, su nombre
significa levadura comedora de azúcar, entre otros significados similares. De
acuerdo con diferentes autores, S. cerevisiae fue seleccionada como modelo de
estudio de laboratorio desde 1930, debido a que conserva procesos esenciales que
son llevados a cabo por las células en humanos, por lo que las observaciones de
los efectos causados por enfermedades como Alzheimer, se pueden extrapolar a
humanos.
Metodología
Ya seleccionado el organismo en el que se quiere expresar la proteína, se tiene que
descargar un vector para poderle insertar la secuencia del gen de interés, la
secuencia se busca en la página del NCBI.

20. Ya descargada la secuencia del vector en formato fasta, se introduce a un
programa, en este caso Snapgene, donde la secuencia de interés se va a insertar
en el vector.

21. Una vez introducida la secuencia en el programa, nos va a mostrar como es el
vector, y que componentes tiene, lo que nos interesa son sus promotores, sitios de
restricción, sus genes reporteros y genes selectivos que puedan estar en el vector.
Se selecciona la opción de solo mostrar sitios de corte únicos, porque no es
factible usar enzimas que corten en varios sitios cuando solo queremos que corte
en uno.
Para introducir la secuencia se selecciona la opción que tiene el programa, para
insertar un fragmento.

22. Una vez elegida la opción de insertar un fragmento se elige el que queremos
insertar, ahí nos mostrara el fragmento, para esto se va a utilizar uno ligeramente
mas grande, ya que no queremos cortar el gen que codificara la proteína de
interés.
Aquí también se deben de elegir sitios de corte únicos.
Después de visualizar el gen, debemos de elegir sitios de corte que concuerden
con los del vector, en este caso utilizaremos de diferentes nombres para el vector
y el inserto, ya que así se pueden unir, use para el vector; FspAI y AgeI, para el
inserto use; AfeI y BsrFI. Aun que no son iguales, los extremos que dejan son
compatibles entre sí, además dejan al inserto con la direccionalidad deseada.

23. Ya que el gen de interés se encontraba entre 803-1804 bp no hubo afectación al
gen.

24. Secuencia del gen LDB_RS00400 en formato fasta.
GGCAAACAGATCGTCAAGAACATTATGGACAAGTATCATGTGACCGACGTCCAGCTGGCTACTGACCCAG
CTGAGCAAGACAAGATTATCAGCGTCCGCCAGGACATGTTACCAGCCATCTTCACTGGTCGCAGCGCAGT
TATGGAAGACATGGCCGTGCCAACTTCACGCATGGCTGAGTTGGTTGACACGATCCAAGCTTTTAGCGAC
AAGTACCCGGAACTGGAAATCTTCACCGCCGGACATGCTGGCGACGGCAACCTGCACCCAACCGTTACCT
GGTCCAAGGATGCCAAGGAAATGCCTGAAAGTGTCAATATCGTCTTGCACGAAATGTTTACCAAGGCCTT
AGAACTGGGTGGAACCATCTCTGGCGAACATGCCGTAGGGATGTTGAAGAACCAATGGAACAATGTTGAA
TTGGGTGAAGACGTTGACTGGATCCAACACCAGATCAAGAGCTTGTTTGACCCAATGAACCTGCTCAATC
CAAAGCGCAAGATCGATTAAGCGGCAGCAATCAGCAAATAACATAGAAGAAAAGTGGCATAACATTCTTG
TAAGAGAGGATATTATGCCGCTTTTTGCTTAAAAAATCCGTTACTATAAACTAGCTGCAGTCAAAACATT
TTCAACTTTGTGAAAGATATTTTTTTCACTTCAAAAATCATCTTGTCCATATTGATATTTAGCGCTTTCA
TCCAAATTATATTGTTCACGTGACTGTTTTTTAGTGTTATCTTTCACCTTTTTGTGTTACTATTATCAAT
GTAAGAGCAAGAATAACGGAGGGACAATTAATGACTAAAATTTTTGCTTACGCAATTCGTGAAGATGAAA
AGCCATTCTTGAAGGAATGGGAAGACGCTCACAAGGACGTCGAAGTTGAATACACTGACAAGCTTTTGAC
CCCAGAAACTGTTGCTTTGGCAAAGGGTGCTGACGGTGTTGTTGTTTACCAACAACTTGACTACACCGCT
GAAACTCTGCAAGCTTTGGCAGACAACGGCATCACTAAGATGAGCCTGCGTAACGTTGGTGTTGACAACA
TCGACATGGCTAAGGCTAAGGAACTTGGCTTCCAAATCACCAACGTTCCAGTTTACTCACCAAACGCCAT
CGCAGAACACGCTGCTATCCAAGCTGCCCGCATCCTGCGTCAAGACAAGGCTATGGACGAAAAGGTTGCC
CGTCACGACTTGCGTTGGGCACCAACTATCGGCCGTGAAGTTCGCGACCAAGTTGTTGGTGTTATAGGTA
CTGGCCACATCGGTCAAGTCTTCATGCAAATCATGGAAGGCTTCGGCGCTAAGGTTATCGCTTACGACAT
CTTCCGCAACCCAGAATTGGAAAAGAAGGGCTACTACGTAGACTCACTTGACGACCTGTACAAGCAAGCT
GACGTTATTTCCCTGCACGTTCCTGACGTTCCAGCTAACGTTCACATGATCAACGACGAGTCAATCGCTA
AAATGAAGCAAGACGTAGTTATCGTTAACGTATCACGTGGTCCATTGGTTGACACTGACGCGGTTATCCG
TGGTTTGGACTCAGGCAAGATCTTCGGTTACGCAATGGACGTTTACGAAGGTGAAGTTGGCATCTTCAAC
GAAGACTGGGAAGGCAAGGAATTCCCAGACGCACGTTTAGCTGACTTAATCGCTCGTCCAAACGTTCTGG
TAACTCCACACACTGCTTTCTACACTACTCACGCTGTTCGCAACATGGTAGTTAAGGCCTTCGACAACAA
CCTTGAATTGGTTGAAGGCAAGGAAGCTGAAACTCCAGTTAAGGTTGGCTAATCTAGCCGCTTAGAAATC
CCTTTTTTAAAACCTACAGATTTTCTTACAACAATCTACTTAAAAATTACTTACATTACTTTACAAATAC
ATACTTTTAAACTTATCCATTAAAATCTAAAACGAAAACCCGCGGGGCCTTCTCACCCGCGGGTTTTTGC
TTGCTTATTTTTGGAGTAGAATATACTGAAAGTAACTGTAAAAGAAAAAGTGTTCGCCAATTGCAAGAAT
AAATTGAACACTTACCATAACATCTCGTAGATTTTGATGACTATCTACGCCGGTAAATGCGGTCAAGTTC
GGTGTCAAAGTACTCTTCTGGAGTCTTGTAGTTTAAGATCTTCCGAGGAAGAGAGTTGCACCATACTTCG
ATCTTAGCAATATCTTCCACACTGTACTGATCTCCTTTGGGAATATAGCGTCTGATAAGCCCGTTGTGCC
GTTCTACGCTGCCTTTATCACAGGATGTATAAGGGTGAGCGTAGTACACAAGAGTCTTGGAAACTTGCTC
AAGATCGGATAGATCTGCGAACCCAGATCCGTTGTCGGTTGTGATAGACTTAAAGATTTGATTCCATTTG
GATCCGTAGTACTCTCGAAACTTATCAAATGCCTTCATAACGCTAGCTGAGGTCTTATCCTCAATCTTGA
TCATGAAGAACTGACGCGTCTTTCGTTCGCACAGAGTAAGCAACACATCATCGTCCTTAGTCTTGTGTCC
AAGAACCAGATCGCGTTCCCAGTGACCAAAGTCCTTACGGCTTTCGATTCTAGGACTACGTTCATCGATG
CTTCGTCCCAGGAT

25. El vector resultante quedo de la siguiente forma ya con el primer previamente
seleccionado:
Los elementos de interés de este vector son:
AmpR: resistencia a ampicilina.
Tet promoter: La activación transcripcional controlada por tetraciclina es un
método de expresión génica inducible en el que la transcripción se activa o
desactiva reversiblemente en presencia del antibiótico tetraciclina o uno de sus
derivados
URA3: se utiliza a menudo en la investigación de la levadura como un "gen
marcador", es decir, un gen para etiquetar cromosomas o plásmidos.

26. TRP1: alteración genética y el análisis fenotípico en levadura.
ARS: secuencia de replicación autónoma.
CEN4: asegura una replicación estable y la precisión de la repartición del
cromosoma durante la división celular, permite la segregación
del plásmido durante la división celular.
Estrategia de inserción: Electroporación
Comprendiendo el método las etapas de:
Incubar las células de levadura en una solución que comprende LiAc de 0,01 a 1,0
M y DTT de 1 a 100 mM, y proporcionar una suspensión que comprende ADN de
vectores, ADN del inserto, las células de levadura, sorbitol de 0,1 a 10 M y CaCl2
o MgCl2 de 0,1 a 10 mM y
Electroporar la suspensión a 0,5 kV /cm a 12,5 kV/cm con una capacitancia de 10
a 50 μF.
Inventor/es: PEREZ, JENNIFER, M, BELK,Jonathan,P, HSIEH,CHUNG-MING,
BENATUIL,LORENZO.
Fecha de Publicación: 31 de diciembre de 2014.
Para verificar que la transformación si haya sido realizada, se podría cultivar en
medios con ampicilina, para que las levaduras no transformadas no crezcan ya
que tiene el gen selectivo para resistencia a ese antibiótico, y un medio con
tetraciclina para ver si el gen reportero que es el de la tetraciclina se encuentra en
los insertos.
Bibliografía
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