DETERMINACION DE LA EXPRESION DE CD73 y CD105 COMO MARCADORES DE CELULAS STEM EN PULPA DENTAL SANA HUMANA

DIVISION DE INVESTIGACIONES
UNIDAD DE INVESTIGACION BASICA ORAL
INSTITUTO U.I.B.O.

DETERMINACION DE LA EXPRESION DE CD73 y CD105 COMO
DETERMINACION DE LA EXPRESION DE CD73 y CD105 COMO
MARCADORES DE CELULAS STEM EN PULPA DENTAL SANA
MARCADORES DE CELULAS STEM EN PULPA DENTAL SANA
HUMANA
HUMANA

Juan Carlos Munévar N, Isthar Castillo, Dayanna Gómez, Catalina Torres,
Gloria Lafaurie y Jorge Forero.

Juan Carlos Munévar N
Juan Carlos Munévar

Células STEM

•Abraham Trembley
• Charles Bonnet,
• Peter Simon Pallas
• René - A Ferchault

Regeneración
Tisular
Krebsbach P, Gehron Robey P. Dental and Skeletal Stem Cells: Potential Cellular Therapeutics for Craniofacial Regeneration. Journal of Dental Education.
66(6). 766-773. 2002


TOTIPOTENCIALES
Embrionarias
PLURIPOTENCIALES
Germinales Embrionarias
MULTIPOTENCIALES
Adultas


Regeneración
Autorenovación Diferenciación funcional in vivo

Células Stem Adultas
Células Stem Adultas Células Stem
(ASC’s)
(ASC’s) Embrionarias (EC’s)
CD34-
Diferentes tipos de tejidos CD45-
CD73+
CD 105 (+)
Caracterización Marcadores moleculares
específicos STRO1 (+)
FGFR3 (+)
Mesenquima

CD34: Glicofosfoproteína transmembranal Tipo I I
CD34: Glicofosfoproteína transmembranal Tipo
Expresada en células Stem linfohematopoyéticas
Expresada en células Stem linfohematopoyéticas

CD45: Antígeno leucocitario común. Glicoproteína de superficie expresada en
CD45: Antígeno leucocitario común. Glicoproteína de superficie expresada en
leucocitos yyprogenitores hematopoyéticos
leucocitos progenitores hematopoyéticos

CD105: Glicoproteína transmembranal. Se expresa en células Stem
CD105: Glicoproteína transmembranal. Se expresa en células Stem
mesenquimales. .Actúa como proteína accesoria en la unión aaTGFβ11yyproteínas
mesenquimales Actúa como proteína accesoria en la unión TGFβ proteínas
morfogenéticas óseas.
morfogenéticas óseas.

CD73: ecto-5´nucleotidasa (ecto-5´-NT). Cataliza la desfosforilación de
CD73: ecto-5´nucleotidasa (ecto-5´-NT). Cataliza la desfosforilación de
monofosfatos nucleósidos. Se expresa en células Stem mesenquimales.
monofosfatos nucleósidos. Se expresa en células Stem mesenquimales.


precursora odontoblasto
Dentina

Célula
Stem Pluripotencial
dental osteoblasto
hueso

Multipotencial
condrocito
cartílago

M.E.C
Migración proliferación diferenciación especializada

Factores solubles / citoquinas

Determinar in vitro la presencia de células que expresan un
fenotipo Stem mesenquimal en pulpa dental humana sana
adulta por medio de citometría de flujo.


♦ Valoración clínica y radiográfica.
♦ Consentimiento informado.
♦ Recolección y procesamiento de la
muestra.
♦ Cultivo celular.
♦ Marcaje con anticuerpos
♦ Citometría de flujo.
♦ Análisis estadístico


Pulpa Dental Gelatina de Wharton Linfocitos (sangre)

Control positivo Control negativo

n = 16 CD34-/CD45- CD34+/CD45+
CD105+/CD73+ CD105-/CD73-

Cultivo celular por Gelatina de Wharton
explantes. (DMEM + Sangre Periférica
10%SFB+AB)
Extracción pulpa dental a
partir de 12 molares
CULTIVO sanos (Previo consentimiento
CONFLUENCIA CELULAR
70%
informado y aprobado por el
comité de ética de la
Universidad El Bosque). Incubación 37ºC, 5%
CO2, humedad 80%


48 mediciones
48 mediciones

Disociación enzimática Lecturade muestras
celular. (Tripsina y EDTA) CD34-PE en Citómetro de
CD45-FITC flujo:
CITOMETRIA CD73-RPE SS (90º), FS (0º, 10º)
y anticuerpos (480
Marcaje con Acs CD105-APC
conjugados a un - 620nm)
fluorocromo específico. CyAnADP DAKO
CyAnADP DAKO


• n=16: Estadística no Paramétrica.
• Kruskal Wallis.
• Mann Whitney.
• Prueba de Montecarlo
• SPSS.


A 40X
B 40X
Figura 1A. Cultivo primario de pulpa dental
Figura 1B. Células adheridas a la superficie de
humana.
cultivo presentado un morfología similar a
fibroblastos ( fibroblast-like ). Confluencia 70%.


100 µm

Morfología in vitro de las células mesenquimales aisladas de la gelatina de Wharton del
cordón umbilical humano.


Gelatina de Linfocitos de sangre
Wharton Pulpa dental
periférica

El citómetro selecciono un promedio de 15000 eventos, de los cuales un
promedio de 1520 se ajustaban a los parámetros de tamaño y complejidad
seleccionados para cada grupo de células (8.47%).


Control Negativo Control Negativo
Gelatina de Wharton pulpa dental


1400.00

1200.00 25.7%
18.6% 0.41%

1000.00
Mean of TOT73105G

800.00

600.00

Gelatina de Linfocitos de sangre Pulpa dental
400.00

Wharton periférica
200.00

Se detectó la expresión de células CD105 low /CD73+ en un 25.7% de pulpa dental
0.00

humana sana. (Fig. PD/R2), GW gelatina de Wharton estos marcadores se
en l p

expresan en un 18.6%. (Fig. GW/R2). Mientras que en sangre periférica se
Grupo
expresa en un porcentaje de 0.41% (Fig. LSP/R2).
Análisis de comparación entre grupos por el método Kruskal Wallis.


800.00

5%
0.19% 2.42%
600.00
Mean of CD45105G

400.00

200.00

Wharton periférica

La expresión de células CD105+/CD45- fue de 5 % en pulpa dental humana sana
0.00

(Fig. PD /R 11 ). E n gelatina de Wharton CD105+/CD45- representó el 0.19 % (Figura
GW l p
GW /R 11 ). En contraste con los anteriores datos en sangre periférica se encontró
Grupo
un porcentaje de 2.42 % para este fenotipo (Fig LSP /R 11 ).


7000.00

4.45% 45.7%
47.68%
6000.00

5000.00
Mean of CD73SSG

4000.00

3000.00

2000.00
Wharton 1000.00 periférica

Se detectó la expresión de células CD73+ en un 45.7% de pulpa dental humana
0.00
sana. (Fig. PD/R2), en gelatina de Wharton este marcador se expresó en un
47.68%. (Fig. GW/R2) y en sangre periférica se expreso en un porcentaje de
GW l p

Grupo
4.45% (Fig. LSP/R2)


12000.00

0.87% 23.3%
37.06% 10000.00
Mean of CD105SSG

8000.00

6000.00

4000.00

Wharton 2000.00 periférica
S e detectó la expresión de células SS/ CD105+ en 23 .3% en pulpa dental humana sana
(Fig. PD /R 9 ), e n gelatina de Wharton el porcentaje de células SS/ CD105+ fue de 37.06 %
0.00

(Figura GW /R 9 ) y e n sangre periférica la expresiónl del marcador p fue casi nula 0.87 % (Fig
GW

Grupo
LSP /R 9 )

Análisis de comparación entre grupos por el método Kruskal Wallis


17.7%
14.98%

46.5%

Wharton periférica

La expresión de células SS / CD34 fue de 17 .7% en pulpa dental humana sana
(Fig. PD /R 2 ). En cuanto a las células de gelatina de Wharton SS /CD 34 la
expresión del marcador fue de un 14.98 % (Figura GW /R 13 ). Para la muestra de
sangre periférica el porcentaje de expresión para este fenotipo fué de 46.5 %

5

7000.00

6000.00

5000.00
Mean of CCD45G

4000.00

3000.00

2000.00

1000.00

0.00

GW l p

Grupo



--Pérdida de tejidos
Pérdida de tejidos
--Disfunción de órganos
Disfunción de órganos

TERAPIAS Células
ACTUALES mesenquimatosas
autológas
 DONANTES
MORBILIDAD
1. PLURIPOTENTES 2. PROGENITORAS
MORTALIDAD
Young H y col. In vitro. 29A. 1993.

POTENCIAL
PROLIFERACION / DIFERENCIACION
Young H y col. Dev Dyn 202. 1995.


DPSC’s y SHED: Diferenciación en células neuronales,
DPSC’s y SHED: Diferenciación en células neuronales,
adipocitos, células semejantes al odontoblasto productoras de
adipocitos, células semejantes al odontoblasto productoras de
dentina. (Miura M, Robey P, Shi S, Gronthos y col 2003)*
dentina. (Miura M, Robey P, Shi S, Gronthos y col 2003)*
(Bartold y col 2006)**
(Bartold y col 2006)**

Laino G y col (2006)*** Caracterizó un grupo de células de pulpa
Laino G y col (2006)*** Caracterizó un grupo de células de pulpa
dental sana humana adulta comprometida en un linaje
dental sana humana adulta comprometida en un linaje
osteogénico: CELULAS STEM DEL ESTROMA DE PULPA
osteogénico: CELULAS STEM DEL ESTROMA DE PULPA
DENTAL.
DENTAL.

*Miura M, Gronthos S, Zhao M et al. 2003.SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. PNAS. 100:5807–5812.
**Bartold M, Shi S, Gronthos S. Stem Cells and periodontal regeneration. Periodontology 2000. 2006; 40;164-172.
***Laino G , Carinci F, Graziano A, Papaccio G. et al. In Vitro Bone Production Using Stem Cells Derived From Human Dental
Pulp. J Craniofac


 Expresión de los marcadores: CD73,
 Expresión de los marcadores: CD73,
CD90, CD105, CD106, CD146 y
CD90, CD105, CD106, CD146 y
Sociedad
Sociedad HLA-ABC, ausencia de CD34,
HLA-ABC, ausencia de CD34,
Internacional
Internacional de
de CD45 y HLA-DR.
CD45 y HLA-DR.
Terapia
Terapia Celular
Celular  Células anclaje dependientes.
 Células anclaje dependientes.
Dominici M, Le Blanc K,
Dominici M, Le Blanc K,
Mueller y col. (2002).
Mueller y col. (2002).  Diferenciación
 Diferenciación en
en osteoblastos,
osteoblastos,
adipocitos y condroblástos.
adipocitos y condroblástos.

* Dominici M, Le Blanc K, Mueller y cols. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal
stromal cells. The International Society for cellular Therapy positions statement. Cytotherapy. 2006:
8(5). 315-317.


• Aunque dentro de sus 3 parámetros la
• Aunque dentro de sus 3 parámetros la
sociedad estableció la ausencia del
sociedad estableció la ausencia del
marcador CD34:
marcador CD34:
En nuestro estudio se identificaron células
En nuestro estudio se identificaron células
de pulpa dental humana con un fenotipo
de pulpa dental humana con un fenotipo
CD73 + /CD105+low/ CD34+low /CD45-
CD73 + /CD105+low/ CD34+low /CD45-

* Dominici M, Le Blanc K, Mueller y cols. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal
stromal cells. The International Society for cellular Therapy positions statement. Cytotherapy. 2006:
8(5). 315-317.


Laino G y col (2005, 2006)* aislaron células de pulpa
Laino G y col (2005, 2006)* aislaron células de pulpa
dental con un fenotipo c-Kit+/ CD34+ STRO-1+/CD45-.
dental con un fenotipo c-Kit+/ CD34+ STRO-1+/CD45-.


 Este hallazgo coincide con un estudio de Papaccio G yy col
Este hallazgo coincide con un estudio de Papaccio G col
(junio 2007)** en el cual se logró obtener osteoblastos sobre un
(junio 2007)** en el cual se logró obtener osteoblastos sobre un
biopolímero de ácido poli-L-láctico, a partir de células de la
biopolímero de ácido poli-L-láctico, a partir de células de la
pulpa dental identificadas con un fenotipo c-Kit+/ CD34+
pulpa dental identificadas con un fenotipo c-Kit+/ CD34+

 Iohara K (2006)**indica que debido a la gran cantidad de
 Iohara K (2006) indica que debido a la gran cantidad de
irrigación e inervación que posee la pulpa dental, algunas stem
irrigación e inervación que posee la pulpa dental, algunas stem
hematopoyéticas pueden migrar al interior de este tejido y dar
hematopoyéticas pueden migrar al interior de este tejido y dar
como resultado una población heterogénea en cultivo
como resultado una población heterogénea en cultivo
* Iohara K, Zheng l , Ito M , et al. 2006. The Side Population Cells Isolated from Porcine Dental Pulp Tissue with Self-
renewal and Multipotency for Dentinogenesis, Chondrogenesis, Adipogenesis and Neurogenesis. Stem Cells. 24(11).
2493-2503

* Laino G , Carinci F, Graziano A, Papaccio G. et al. In Vitro Bone Production Using Stem Cells Derived From Human Dental Pulp. J
Craniofac Surg. 2006. 17 (3):511-515
** D'Aquino R, Cusella-De Angelis M , Laino G, Papaccio G. et al. Concave pit-containing scaffold surfaces improve stem cell-derived
osteoblast performance and lead to significant bone tissue formation. PLoS ONE. 2007 ;2. e495 Juan Carlos Munévar N

C olonias adherentes características
de otras poblaciones stem
estromales.
Nakashima M (1991)*,
Miura M y col (2003)**

Los cultivos primarios de tejido pulpar retienen m ás sus
Los cultivos primarios de tejido pulpar retienen m ás sus
fenotipos que los subcultivos, al minimizar el daño
fenotipos que los subcultivos, al minimizar el daño
durante el proceso de disgregaci ón y aumenta la
durante el proceso de disgregaci ón y aumenta la
viabilidad celular.
viabilidad celular.

*Nakashima M. 1991. Establishment of primary cultures of pulp cells from bovine permanent incisor. Arch Oral
Biol.;36(9):655-63.
**Miura M, Gronthos S, Zhao M et al. 2003.SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. PNAS. 100:5807–
5812.


• CD73 + /CD105+ low
Cultivo
Cultivo CD34+ low .
primario
primario
• Anclaje FENOTIPO
FENOTIPO
de pulpa
de pulpa
dental dependientes . STEM
STEM
dental
sana • Ausencia del MESENQUIMA
MESENQUIMA
sana
L
L
adulta
adulta marcador
humana
humana hematopoyético
CD45


Los resultados de la
Los resultados de la
expresión fenotípica
expresión fenotípica
indican similitud
indican similitud
entre las células de
entre las células de
gelatina de Wharton
gelatina de Wharton
y las de pulpa dental
y las de pulpa dental •• Las células de gelatina de
Las células de gelatina de
Wharton evidenciaron una
Wharton evidenciaron una
humana ..
humana menor expresión de los
menor expresión de los
anticuerpos en estudio
anticuerpos en estudio

Relación entre
Relación entre
control positivo y
control positivo y
muestra ..
muestra


•• Fenotipo CD34+low/CD45- en
Fenotipo CD34+low/CD45- en
células de pulpa dental:
células de pulpa dental:

nos permite diferenciarlas de
nos permite diferenciarlas de
células Stem hematopoyéticas,
células Stem hematopoyéticas,
expresan marcadores de
expresan marcadores de
superficie CD34+/CD45+.
superficie CD34+/CD45+.
Foto: Instituto UIBO. Universidad El Bosque


•• Las células MSC en el
Las células MSC en el
complejo
complejo pulpodentinal
pulpodentinal
comprenden una población
comprenden una población TEJIDO
heterogénea.
heterogénea.
CELULAS

•• Se demostr ó la presencia
Se demostr ó la presencia
de los marcadores de
de los marcadores de FACTORES SOLUBLES MATRICES SUBPOBLACIONES

c élulas Stem
c élulas Stem
mesenquimales
mesenquimales
CD73+/CD105+ low ,, y la
CD73+/CD105+ low y la ANALOGOS SINTETICOS: BIOMIMETICOS

expresi ón de los
expresi ón de los
marcadores stem
marcadores stem
hematopoy étic o y
hematopoy étic o y
Foto: Instituto UIBO. Universidad El Bosque

linfocitario adulto CD34
linfocitario adulto CD34

1) Procesamiento de la muestra ..
1) Procesamiento de la muestra
2) Enmascaramiento del antígeno ..
2) Enmascaramiento del antígeno
3) Actividad metabólica celular ..
3) Actividad metabólica celular
4) Grado de compromiso en la
4) Grado de compromiso en la
diferenciación celular.
diferenciación celular.


Las células Stem Adultas son el gran presente.
Aparentemente no generan ningún conflicto ético-legal y
proporcionan grandes logros.
Sin embargo tienen menos potencial que las Stem
embrionarias y, además…
• ¿Cuántos tipos existen?

• ¿En qué tejidos se encuentran?

• ¿Cuáles son las fuentes principales?

• ¿Qué señales regulan su proliferación y diferenciación?

• ¿Existirá algún tipo capaz de generar por sí sola cualquier órgano o
tejido?


• Ciencias básicas
• Ciencias básicas
EMBRIOGENESIS VIAS DE SEÑALIZACION

• Aplicaciones terapéuticas
• Aplicaciones terapéuticas
BIOMIMETICOS REGENERACION
TERAPIA GENICA

• Investigación clínica
• Investigación clínica
NEOPLASIAS


•• Banco de c élulas Stem de
Banco de c élulas Stem de
Colombia.
Colombia.

•• Cristhian Leyva y Edith
Cristhian Leyva y Edith
Hern ández. Equimed Ltda.
Hern ández. Equimed Ltda.


FACULTAD DE ODONTOLOGIA
DIVISION DE INVESTIGACIONES
UNIDAD DE INVESTIGACION BASICA ORAL
INSTITUTO U.I.B.O.


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