XVII CONGRESO INSTITUCIONAL DE INVESTIGACIONES. UNIVERSIDAD EL BOSQUE. COLOMBIA

1. Criopreservación de células STEM de pulpa
dental humana (DPSCs)
GRUPO UNIDAD DE INVESTIGACIÓN BÁSICA ORAL U.I.B.O.
Munévar Niño JC, Jiménez T, Tamayo MC, Dorta D, Gómez
A, Rodríguez L, Velandia C, Forero J.
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
XVII Congreso Institucional de Investigaciones.
Bogotá, Octubre 27 2010
REGENERACIÓN TISULAR
Gutiérrez Collazos N,

2. REGENERACION TISULAR & ODONTOLOGIA
REGENERATIVA
Interés en las células Stem debido a
su enorme potencial terapéutico in vivo

3. Existe un interés científico generado por las aplicaciones terapéuticas
de células Stem mesenquimales adultas en el ser humano debido a:
Lesiones irreversibles
de órganos y tejidos
Los productos de Ingeniería Tisular se basan en biomateriales novedosos que
integran células Stem capaces de auto-renovarse o bien de diferenciarse en tipos
celulares específicos. (neuronas, osteoblastos, condrocitos, queratinocitos)
Thirumala S, Goebel W. S, Woods E. Clinical grade adult stem cell banking. Organogenesis. 5: 3. 143 – 54. 2009
Síndromes
Enfermedades
crónicas
Neoplasias
Trauma
INJERTOS DE HUESO HUMANO DISEÑADOS
ANATOMICAMENTE POR INGENIERIA

4. • Auto renovación in vitro / in vivo
• Adherentes in vitro
• Potencial de diferenciación in vivo
• Reserva celular in vivo
FRIEDENSTEIN A.J y col/1974
Friedenstein AJ, Deriglasova UF, Kulagina NN, Panasuk AF, Rudakowa SF, Luria EA, Ruadkow IA: Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the
in vitro colony assay method. Exp Hematol 1974, 2:83-92
Células Stem
Adultas
Mesenquimales
 Medula ósea
 Tejido adiposo
 Sangre periférica
 Sangre de Cordón Umbilical
 Gelatina de Wharton
 Placenta
 Periostio
 Ligamento periodontal
 DPSCs
 SHEDs
 SCAPs
 iPS
Propiedades

5. Gronthos S. J Dent Res. 2002; 81 (8): 531-5 y Iohara K J Dent Res. 2004; 83(8):590-5.
Caracterización
del fenotipo
Expresión de
marcadores
CD105+, CD73+,
CD34-, CD45-
SHED
SCAPs
PDLSCs
iPS
Desarrollar
óptimos métodos
de cultivo ,
expansión y
criopreservacion
DPSCs
Gronthos S, Brahim J, Li W, Fisher LW, Cherman N, Booyde A, et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. J Dent Res. 2002;
81 (8): 531-5
Iohara K. Dentin regeneration by dental pulp stem cell therapy with recombinant human bone morphogenetic protein 2. J Dent Res. 2004;
83(8):590-5.

6. INTRODUCCIÓN
Optimizar la seguridad y el control de calidad de los métodos empleados
in vitro con las células Stem para aplicaciones terapéuticas in vivo.
Brandon Perry, Dan Zhou, Xiaohua Wu. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derivded
mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering: Part C. Volume 14, Number 2, 2008.
CRIOPRESERVACION
La criopreservación es el proceso de congelamiento de las células con
el fin de reducir su actividad metabólica y mantenerlas a temperaturas
reducidas durante tiempos prolongados, preservando al mismo tiempo
su VIABILIDAD, FENOTIPO Y POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN.

7. Evaluar la viabilidad y fenotipo de células
Stem de pulpa dental humana sometidas a 2
métodos de criopreservación en 3 tiempos
diferentes.

8. Pacientes
18- 31 años
48 dientes
sanos
Premolares y
molares
erupcionados
Sistémicamente sanos
Cultivo
Células
CD105+
Consentimiento informado
Comité Institucional de Ética
en Investigación
Estudio Experimental in vitro

9. Sección del diente
a nivel UAC
Procedimientos realizados
en la Clínica el Bosque
Luego de la exodoncia se
sumergió el diente en
NaOCl 5% y solución
salina

10. DMEM suplementado SFB 10%
1. TRANSPORTE DE LA MUESTRA 2. DISGREGACION DE LA PULPA DENTAL
Mecánica Enzimática
Cámara de Neubauer
3. VIABILIDAD CELULAR
Células CD105+
MILTENYI MiniMACS
4. SEPARACIÓN MAGNETICA

11. NH Stem cell
media
MILTENYI
Biotec
5. Expansión in vitro CD105+
Incubación 37°C,
Atmósfera húmeda
5% de CO2, 70%
confluencia celular
Papaccio et
al/2006
Kamath
Fischer
Scientific
6. CRIOPRESERVACION
P≤0.05
Test T Student U Mann Whitney
7. ANALISIS ESTADISTICO
Control -
fibroblastos
Control +
C.U.H.

12. Protocolos de criopreservación
Método de Papaccio y col/2006
Método de Kamath, A.
(SC Protocol Sheet: 00007 Thermo Fisher Scientific.
Cellular engineering technologies, Inc.)
Desprenden las DPSCs de la monocapa con EDTA 0.02%
en PBS
Retiro de monocapa se lava con PBS 10ml/75cm2
Conteo celular en hemocitometro Se agrega 5 ml de solución de Tripsina 0,5%
(SH30042.01) Thermo Scientific HyClone
Se deposita la suspensión celular en solución de
criopreservacion DMSO 10% en SFB
Incubación enzimática a 37ºC por 5 minutos
Se deposita la suspensión celular en un criovial 4ºC
durante 2hrs, luego a -70ºC por 16 hrs,
Se agrega 5ml NH CFU-F y se centrifuga a 200rpm por 10
minutos
Finalmente -196ºC en nitrógeno líquido hasta el proceso
de descongelación
Conteo celular en hemocitometro
Se deposita la suspensión celular en solución de
criopreservación DMSO 10%, SFB 70% y 20% NH CFU-F
en nitrógeno líquido -196oC

13. PROTOCOLO DE DESCONGELACIÓN
Retiro de criovial DPSCs que
se encontraba a
-196ºC en tanques de
nitrógeno liquido
Se deposito el criovial
al baño maría bajo
agitación moderada
Bajo la cabina de flujo laminar
se abrió cada criovial para
transferir el contenido en tubos
Falcon de 15 ml
Se agregó 10 ml de solución
de descongelamiento
precalentada a la suspensión
celular obtenida.
La solución de descongelamiento consiste en 80% de Suero Fetal Bovino y 20% de NH Expansion Medium. Se
centrifugó a 200 g durante 10 minutos la suspensión celular obtenida.
Se retiró el sobrenadante para resuspender el pellet en 5 ml de medio de cultivo NH Expansion Medium y así realizar
la incubación de los anticuerpos para evaluar viabilidad y fenotipo de las DPSCs mediante citometría de flujo.

14. CITOMETRÍA DE FLUJO
EVALUACIÓN DE LA PRESERVACIÓN DEL FENOTIPO Y VIABILIDAD POST CRIOPRESERVACIÓN
(FACS CANTO II Becton & Dickinson)
Evaluación de la viabilidad mediante
exclusión de 7-AAD (7 Amino-actinomicina D)
Fenotipo CD105+/CD73+/CD34-/CD45- de la
suspensión de células DPSCs sometidas a 2
procesos distintos de criopreservación en 3
tiempos diferentes.
Marcaje fue leído en citómetro de flujo en U.I.B.O. reportando cada dato
como porcentaje para cada marcador en cada condición.

15. DATOS DESCRIPTIVOS DE OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
VARIABLES PROMEDIO*/ FRECUENCIA DS* / %**
Edad del paciente* n= 20 21 años +5.39 años*
Tiempo de obtención de la muestra* 78` + 47.02`*
Tiempo de procesamiento de la muestra* 197` + 41.91`*
Tipo de diente
Premolares 13 27%**
3ºs molares erupcionados 30 62,5%**
3ºs molares incluidos 5 10,4%**
Total de dientes 48 100%
*DS / **%

16. Microscopia De Contraste De Fase
Expansión in vitro
Morfología in vitro de células Stem de
pulpa dental. 40x
Unidades Formadora de Colonias
(DPSCs). 10x
Morfología in vitro de fibroblastos
de la pulpa dental humana.
10 x
MSC de Cordón Umbilical in vitro.
10x

17. Citometría de flujo
Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación
Evaluación Viabilidad De Células Stem De Pulpa Dental Humana postcriopreservación

18. Inmunofenotipificación
0.0%
10.0%
20.0%
30.0%
40.0%
50.0%
60.0%
70.0%
80.0%
90.0%
100.0%
PORCENTAJEEXPRESIÓN
MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL
FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN
PAPACCIO
24 HORAS
7 DIAS
1 MES
Porcentaje De Expresión De Marcadores de DPSCs Mediante Citometría De Flujo
0.0%
10.0%
20.0%
30.0%
40.0%
50.0%
60.0%
70.0%
80.0%
90.0%
100.0%
PORCENTAJEEXPRESIÓN
MARCADORES CELULAS STEM MESENQUIMALES PULPA DENTAL
FENOTIPO POST CRIOPRESERVACIÓN
KAMATH
24 HORAS
7 DIAS
1 MES
94.9%
97.3%
99.9%
98.1%
Fenotipo De Células Stem De Pulpa Dental Humana Por Citometría De Flujo
p≤0.05 p≤0.05

19. Zhang W, Walboomers XF, Shi S, Fan M, Jansen JA. Multilineage differentiation potential of stem cells derived from human
dental pulp after cryopreservation. Tissue Eng. 2006 Oct; 12(10):2813-23.
Estudios recientes describen métodos de caracterización,
aislamiento y cultivo celular de DPSCs, pero no analizan factores
relevantes sobre la efectividad de la criopreservación, como los
presentados en este estudio
Gronthos et al/2000. PNAS Miura et al/2003. PNAS.
Papaccio et al/2006.
J Cell Physiol.
Iohara et al/ 2006.
Stem Cells.
Perry et al/2008.
Tissue Eng Methods.
Woods et al/ 2009.
Cryobiology

20. Woods EJ, Perry BC, Hockema J, Larson L, Zhou D, Goebe W, et al. Optimized cryopreservation method for human dental
pulp-derived stem cells and their tissues. Elseiver. Cryobiology. 2009; 59(2): 150-157.
Woods y col/2009
Cryobiology
Nuestro estudio
1 semana, 1 mes,
6 meses
1 día, 1 semana,
1 mes
TIEMPO DE CRIOPRESERVACIÓN
Estudio original e interesante para la biología de las DPSCs, es la primera vez
que se comparan dos métodos de criopreservación reportados en la
literatura científica mundial:
El método de Papaccio y el método de Kamath.
DISCUSIÓN

21. DISCUSIÓN
METODOLOGÍA
Disgregación mecánica /
enzimática, procedimiento previo a
la criopreservación semejante al
empleado por Perry et al/2008.
Seo et al/2005, criopreservación
realizada directamente sin antes
disgregar el tejido.
Seo BM., Miura M, Sonoyama W, Coppe C, Stanyon R, Shi S, et al. Recovery of Stem Cells from Cryopreserved
Periodontal Ligament. J Dent Res. 2005; 84(10): 907-912.

22. DISCUSIÓN
La Disgregación enzimática posiblemente afecte los resultados, Woods et
al/2009, quienes reportan en su estudio que es probable que el tejido
pulpar digerido comprometa la integridad de la superficie de las
membranas celulares.
La disociación enzimática produce stress
en las membranas y potencialmente
pueden predisponer a crio lesiones leves.
Papaccio G, Graziano A, d'Aquino R, Graziano MF, Pirozzi G, Menditti D, De Rosa A, Carinci F, Laino G. J Cell Physiol.
Long-term cryopreserva-tion of dental pulp stem cells (SBP-DPSCs) and their differentiated osteoblasts: a cell source
for tissue repair. 2006 Aug; 208(2):319-25.

23. DISCUSIÓN
CULTIVO CELULAR
En nuestro estudio DPSCs presentaron morfología
estrellada, diámetro mayor al de los fibroblastos,
núcleo esférico definido y no se observaron
refringentes.
Polisetty et al/2008, las células cultivadas tienen la
capacidad para la formación de CFU que puede
aumentar o disminuir con los números de pasajes.
En algunos pozos se observó la formación de
Unidades Formadoras de Colonias (CFU-F)
Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Mol Vis.
2008; 14: 431-442.

24. Nuestroestudio
•CITOMETRIA DE FLUJO
• Viabilidad exclusión 7-AAD
• Fenotipo D105+/CD73+/CD34-
/CD45-
• 2 métodos de
criopreservación en 3 tiempos.
Temmermanetal/2010
• Evalúa la viabilidad de
fibroblastos de pulpa dental
humana de acuerdo al
porcentaje de confluencia
alcanzado en el primer
pasaje.
• No evalúan el fenotipo
celular con sus respectivos
marcadores.
Viabilidad y Fenotipo
La criopreservación podría modificar la configuración espacial de la proteína
de membrana celular comprometiendo su detección por citometría de flujo o
bien quizás afecta su estadio de diferenciación celular.
Temmerman L, Beele H, Dermaut LR, Van Maele G, De Pauw GA. Influence of cryopreservation on the pulpal tissue of immature third molars in vitro.
Cell Tissue Bank. 2010 Aug;11(3):281-9.

25. Las células Stem mesenquimales aisladas de pulpa dental, pueden ser
criopreservadas manteniendo la viabilidad celular y sus propiedades
biológicas, lo que genera posibilidades para la creación de un banco
de células Stem de pulpa dental (DPSC).
Los resultados demuestran que según el método de congelación
empleado se modifica la expresión de los marcadores que
caracterizan el fenotipo de las DPSCs.

26. Emplear marcadores específicos (STRO-1, CD 146,, CD105,
CD73, CD90, CD34, CD45) que caractericen el fenotipo de las
DPSCs establecidos por las sociedades científicas de células
Stem para un próximo estudio.
Usar reactivos humanos libres de proteína animal para
cultivar, expandir y criopreservar células Stem
mesenquimales de pulpa dental para futuras aplicaciones
terapéuticas en la práctica clínica odontológica.

27. Evaluar a largos tiempos de criopreservación ( ≥1año)
con mayores criterios de evaluación.
Evaluar el potencial de regeneración in vivo
(animales) después de la criopreservación de DPSCs

28. ¡GRACIAS UIBO!
Agradecimientos
Dra. Andrea Villegas
Dr. Carlos Terán
Dr. Jorge Gruber
Residentes II año
Endodoncia