Este documento describe la ecología y biodiversidad de las levaduras no-Saccharomyces encontradas en uvas y mostos de vino. Se aislaron 1028 cepas de levaduras pertenecientes a 17 géneros y especies diferentes de 5 regiones vinícolas en Francia. 46 cepas se seleccionaron para caracterizar su potencial enológico a través de fermentaciones en monocultivo y análisis sensoriales de los vinos resultantes. Los resultados mostraron diferencias significativas en los perfiles aromáticos de los vinos dependiendo de

1. Levaduras no-Saccharomyces :
nuevas aplicaciones enológicas
XXVIè Congrés i la nit de l’enologia de l’ACE
Arnes, 17 – 18 Abril 2015
Arnaud DELAHERCHE
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2. Ecología de las levaduras no-Saccharomyces
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
• Uva : principal contenedor natural de las levaduras
enológicas indígenas.
• Poblaciones elevadas sobre las uvas sobre-maduradas o sobre racimos alterados
por podredumbre (ej : Botrytis) pueden alcanzar 105 et 107 UFC/g (Barata et al., 2008;
Nisiotou & Nychas, 2007).
• Evolución de las poblaciones : - Volumen de la superfície de la baya
- Disponibilidad y contenido de nutrientes
- La concentración en azúcar aumenta y la acidez
disminuye (Cadez et al., 2010; Combina et al., 2005).
• Las especies de levaduras presentes sobre la superície de las bayas son limitadas
en número.
• La densidad de las levaduras evoluciona en el curso de la maduración de la uva.
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3. Ecología de las levaduras no-Saccharomyces
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Figura 1: Población de levaduras
totales sobre bayas de uva Merlot y
de Cabernet-Sauvignon en diferentes
estadios fenológicos desde añada
2004 (Renouf, 2006).
Población total de levaduras
Figura 2: Población de levaduras
totales sobre uva tinta (Merlot y
Cabernet-Sauvignon) en función de tres
campañas (Renouf, 2006).
Población total de levaduras
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4. Ecología de las levaduras no-Saccharomyces
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• A nivel mundial, las diferentes especies de levaduras no-Saccharomyces aisladas
sobre uva o sobre mosto de uva en función de la variedad que se encontraron :
- 90 especies diferentes con 29 géneros distintos, aisladas a partir de
44 variedades de uva.
- 51 especies de levaduras N-S pertenecientes a 21 géneros distintos,
según (Renouf et al., 2007).
• Las levaduras que se aislaron a partir de uvas o mosto de vino de 6 variedades
diferentes (Merlot, Cabernet-Sauvignon, Cabernet-Franc et Petit Verdot, Sémillon
et Sauvignon Blanc), son :
Aureobasidium, Auriculibuller, Brettanomyces,
Bulleromyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces,
Hanseniaspora, Issatchenka, Kluyveromyces, Lipomyces,
Metschnikowia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula,
Sporidiobolus, Sporobolomyces, Torulaspora, Yarrowia,
Zygoascus, et Zygosaccharomyces.
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5. Ecología de las levaduras non-Saccharomyces
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• Les especies de levaduras N-S presentes en la superfície de la uva varian
notablemente durante el transcurso de la maduración. Desde el envero a la
maduración se observa: una sucesión de especies de estas levaduras.
• Hanseniaspora uvarum : especie predominante que representa entre el 50-75%
de la población leviforme total sobre uva madura (Pretorius, 2000).
Otras especies pertenecientes a los géneros Candida, Metschnikowia y Pichia
estan presentes en proporciones más bajas (Barata et al., 2012; Pretorius et al., 1999; Fleet,
1998).
• Bayas de uva dañadas : en las que hay un aumento de la concentración de azúcar
en la superfície, favorecen el desarrollo de levaduras Ascomycetos con una
elevada actividad fermentativa como Pichia spp., Candida hellenica y otras
levaduras de contaminación como Zygosaccharomyces spp.
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6. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Figura 3 : Evolución de las levaduras en el
transcurso de la FA en Blanco (A) y en Tinto (B)
(Xufre et al., 2006).
• Sucesión de especies durante los
diferentes estadios de la FA :
Un modelo de evolución similar.
Saccharomyces cerevisiae
se convierte en mayoritario.
Dinámica de las levaduras indígenas durante la FA
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7. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Dinámica de las levaduras indígenas durante la FA
Maceración pre-fermentativa : Hanseniaspora, Candida, Metschnikowia y Pichia
estan presentes en gran número (Zott et al., 2008).
Figura 4 : Evolución de las levaduras totales y N-S en
maceración pre-fermentativa y durante la FA (Zott et al., 2010).
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8. Impacto de las levaduras no-Saccharomyces sobre
las características organolépticas del vino
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• Rol potencial sobre la calidad organoléptica, dotándola de más
complejidad aromática (Kim et al., 2008; Viana et al., 2008; Ciani et al., 2010;
Comitini & Ciani, 2011; Medina et al., 2013) = pull de aromas deseable.
• Algunas levaduras pueden ser el orígen de defectos olfactivos producidos
durante la fermentación y/o durante la crianza.
- levaduras de alteración : Pichia membranifaciens,
Candida, Zygosaccharomyces et Brettanomyces, pueden producir
Compuestos como el ácido acético, fenoles, sulfuro de hidrógeno.
(Chatonnet et al., 1995; Dias et al., 2003; Suárez et al., 2007).
Es necesario estudiar y seleccionar las levaduras N-S con
características enológicas positivas.
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9. Puesta en marcha de un vasto programa de
selección de levaduras N-S
Ecole doctorale Environnements Santé
TESIS DOCTORAL
Discipline : Sciences de l’alimentation
Spécialité : Microbiologie- Œnologie
Presentada por
Mohand SADOUDI
Interés biotecnológico de las levaduras indigènas
no-Saccharomyces
Laboratoire d’accueil : Institut Jules Guyot – uB
Direction de Thèse :
R. TOURDOT-MARECHAL, Directrice de thèse -UMR PAM – équipe VAlMis
H. ALEXANDRE, co-encadrant de thèse - UMR PAM – équipe VAlMiS
S. ROUSSEAUX, co-encadrante de thèse - UMR PAM – équipe VAlMiS
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10. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Estudio de la biodiversidad y seleccion de levaduras N-S
• El OBJETIVO PRINCIPAL: Encontrar cepas de levaduras N-S con un potencial
enológico.
• Emplazamientos del estudio (Bourgogne) : Nuit Saint-Georges, Vosne Romanée,
Sancerre, Mâcon et Beaune.
Figura 5 : Protocolo de
aislamiento de las
diferentes especies de
levaduras.
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11. Estudio de la biodiversidad y seleccion de levaduras N-S
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
18s 28s5,8s
ITS1 ITS2
ITS1
ITS4
• Identificación genética de las diferentes especies de levaduras aisladas :
- PCR ITS-RFLP
- Amplificación de la región codificante por el ARNr-5,8S-ITS.
• Resultados : - 1028 cepas de levaduras pertenecientes al género
Saccharomyces y N-S fueron aisladas.
- 17 géneros y especies diferentes.
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12. Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Cepas diferentes aisladas e
identificadas
Numero %
Candida californica 05 0,5
Candida ishiwadae 02 0,2
Candida oleophila 12 1,2
Candida zemplinina 58 5,6
Cryptococcus flavescens 04 0,4
Hanseniaspora uvarum 658 64,0
Kluyveromyces thermotolerans 02 0,2
Metschnikowia aff. fructicola 03 0,3
Metschnikowia pulcherrima 02 0,2
Metschnikowia sp. 93 8,9
Metschnikowia viticola 01 0,1
Pichia fermentans 03 0,3
Pichia fluxuum 04 0,4
Pichia membranifaciens 28 2,7
Rhodotorula fijisanenesis 01 0,1
Torulaspora delbrueckii 07 0,7
Total N-S 883 85,9
Saccharomyces cerevisiae 145 14,1
Total 1028
Tabla 1: Número de cepas en función del género y especie.
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13. Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
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• Sobre 883 cepas de levaduras no-Saccharomyces aisladas, 46 cepas fueron
escogidas para una caracterización de su potencial enológico.
Cepa a probar numero
Candida californica 02
Candida ishiwadae 02
Candida oleophila 05
Candida zemplinina 10
Hanseniaspora uvarum 01
Kluyveromyces thermotolerans 02
Metschnikowia aff. fructicola 03
Metschnikowia pulcherrima 02
Metschnikowia sp. 10
Metschnikowia. viticola 01
Pichia fermentans 01
Pichia membranifaciens 05
Torulaspora delbrueckii 02
Total 46
Tabla 2 : Número unitario y numero total de cepas
escogidas para una caracterización de su potencial
enológico.
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14. Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
• Estudios de las características enológicas de las diferentes cepas :
0
20
40
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0
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5
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
PB2023 Glucose Fructose
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Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
BBMV 3FA5 glucose fructose
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Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
BBMCZ 7FA20 glucose fructose
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Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
BA1-11 glucose fructose
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0
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
BBS 2-4 glucose fructose
0
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40
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80
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0
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Sucres(g/L)
Population(Logcellulesviables/mL)
Temps (jours)
RC1-11 glucose fructose
S. cerevisiae T. delbrueckii
K. thermotolerans
P. fermentans
P. membranifaciens H. uvarum
BA
C D
E F
Figura 6 : Seguimiento de las
poblaciones viables y del consumo
de los azúcares a lo largo de la FA
de sus mono-cultivos.
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15. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • TarragonaXXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
• Estudios de las características enológicas de las diferentes cepas :
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Fruits exotiques
Banane
Pomme verte
Vernis
Pêche
MelonSucré
Acidité
Amer
Gras/Volume
Complexité
Sc
Mp
Mp-Sc
Td-Sc
a
b
a
a
a,b
a,b,c
b,c
c
a
a
a,b
b
aa a,b
b
a, b
a,b
a
b,c
b
c
a
a
c
b
b,c
c
d
a
b
a, b
b
b b
b
b
d c,d
b,c
b,c
b
b
c
**
**
**
**
**
**
**
** **
**
*
Figura 7 : Analisis sensorial de los
vinos de Sauvignon Blanc
fermentados por los mono-
cultivos.
Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
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16. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
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17. Estudio de la biodiversidad y selección de levaduras N-S
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
• En conclusión : -Cinética fermentativa monocultivo y co-cultivo con S.cerevisiae.
-Producción de aromas varietales, fermentativos y terpénicos.
-Limitación de la producción de moléculas indeseables :
compuestos azufrados y vinil-fenoles…
-Producción de biomasa.
• Las 3 cepas más adaptadas has sido las seleccionadas :
- klueroveromyces thermotolerans
- Torulaspora delbruecki
- Metschnikowia pulcherrima
• Mezclar en diferentes proporciones con el objetivo de
trabajar sobre la Bio-Protección de la vendimia.
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18. Bio-protección de la vendimia
• Sélección espécifica de levaduras no-saccharomyces del viñedo de Bourgogne :
- klueroveromyces thermotolerans
- Torulaspora delbruecki
- Metschnikowia pulcherrima
XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
• Microorganismos destinados implantarse desde los primeros minutos de la
vendimia.
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19. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Bio-protección de la vendimia
• Objetivos técnicos : - Implantarse rapidamente en el medio con levaduras N-S
« seguridad »
- Limitar el uso de SO2 en la vendimia.
- Conservar y favorecer la expresión de la microflora natural.
- Aportar más complejidad y calidad aromática.
- Nula participación en la extracción de amargores, de gustos vegetales
y en el caso de vendimia alterada de gusto de podrido.
ou
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20. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Bio-protección de la vendimia
• Ejemplo de uso : 5 g por 100 kg de uva
- Réhidratar 100 g en 1,5L de agua no-clorada y 0,5L de mosto
a 27°C y esperar 30 minutos.
- Acclimatación : Añadir 8L de mosto (préparacion de 10L en total)
- Repartir uniformemente sobre la uva 0,5 L por 100 kg de vendimia (=5 g/hL)
- Remolque de 2T de uva = 100g de Primaflora
= 10L de pie aclimatado
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21. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Bio-proteccion de la vendimia
• Objetivos técnicos : Sucesión de 3 fases de trabajo de las levaduras
Favorece la complejidad aromática
La flora nativa Primaflora Levadura
No-saccharomyces Saccharomyces
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22. XXVIè Congrés I la nit de l’enologia de l’ACE • Tarragona
Bio-protección de la vendimia
• Objetivos técnicos: No sustituye una siembra clasica con S. cerevisiae
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23. Bio-protección de la vendimia
• Conclusión : - Imprescindible el uso de levaduras N-S « seleccionadas »
- Ocupación « positiva » del ecosistema
- Limitar el uso de SO2 en vendimia
- Supone una técnica innovadora : enología moderna y en
consonancia con los gustos de los consumidores finales
- Favorece la complejidad y tipicidad aromática (vino limpio y
menos « pesado »)
- Favorece el desarrollo de la FML en vino tinto
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24. GRACIAS POR VUESTRA ATENCIÓN
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