Presentació Agrovin

1. Ignacio Belda
Antonio Santos
Eva Navascués
Levaduras No-Saccharomyces como fuente
de enzimas de interés enológico.
XXVI Congrés Anual de l’Associació Catalana d’Enòlegs

2. • Etapas iniciales: Hanseniaspora (50%- 75%), Candida y otras levaduras
No-Saccharomyces
• Etapas intermedias: Metschnikowia, Torulaspora y Pichia
• Etapas finales: Predominio de Saccharomyces cerevisiae, más tolerante
al etanol
Microbiología en Fermentaciones espontáneas
Kurtzman y Fell. Elsevier Science (Amsterdam, 1998).
Jolly et al., 2014. FEMS Yeast Research 14, 215–237.
No-Saccharomyces
S. cerevisiae
Más de 40 especies diferentes de levadura

3. • Etapas iniciales: Hanseniaspora (50%- 75%), Candida y otras levaduras
No-Saccharomyces
• Etapas intermedias: Metschnikowia, Torulaspora y Pichia
• Etapas finales: Predominio de Saccharomyces cerevisiae, más tolerante
al etanol
Microbiología en Fermentaciones espontáneas
Kurtzman y Fell. Elsevier Science (Amsterdam, 1998).
Jolly et al., 2014. FEMS Yeast Research 14, 215–237.
No-Saccharomyces
S. cerevisiae
Más de 40 especies diferentes de levadura
Diferentes grados de implantación e
influencia en el proceso de fermentación.

4. Grado alcohólico (%)
Kloeckera
Hanseniospora
Candida
Metschnikowia
Pichia
Zygosaccharomyces
Torulaspora
Saccharomyces spp.
Saccharomyces spp.
S. cerevisiae
0
3 6 9
12
Efecto de la inoculación de
Saccharomyces cerevisiae
Pretorius., 2000. Yeast 16: 675-729.
Belda et al., 2015. Applied Microbiology and Biotechnology 99, 1911-1922

5. Grado alcohólico (%)0
3 6 9
12
Efecto de la inoculación de
Saccharomyces cerevisiae
S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e
Reducción de la diversidad
microbiana
Eliminación de la actividad
biológica colateral
Pretorius., 2000. Yeast 16: 675-729.
Belda et al., 2015. Applied Microbiology and Biotechnology 99, 1911-1922

6. Falta de control sobre la
microbiota prefermentativa
Grado alcohólico (%)0
3 6 9
12
S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e
Reducción de la diversidad
microbiana
Eliminación de la actividad
biológica colateral
Maceración
prefermentativa
Problema
Prácticas enológicas con repercusión
microbiológica

7. Producción de etanol
y otros alcoholes y
ésteres
Incremento de
compuestos aromáticos
Liberación de enzimas
hidrolíticas
Ugliano et al., 2006. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 6322-6331.
Loscos et al., 2007. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 6674-6684.
Influencia de las levaduras en la calidad
del vino

8. Producción de etanol
y otros alcoholes y
ésteres
Incremento de
compuestos aromáticos
Liberación de enzimas
hidrolíticas
Potencial aplicación de
no-Saccharomyces
Ugliano et al., 2006. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54, 6322-6331.
Loscos et al., 2007. Journal of Agricultural and Food Chemistry 55, 6674-6684.
Influencia de las levaduras en la calidad
del vino

9. Dominantes en las primeras etapas fermentativas y tradicionalmente asociadas a
diversos inconvenientes (incremento de acido acético y otras desviaciones
sensoriales).
Elevado potencial enzimático:
Actividades glicosidasas Aromas terpénicos
β-liasa Aromas tiólicos
Proteasa Inestabilidad proteica
Especies con interés enológico:
Kloeckera apiculata
Torulaspora delbrueckii
Kluyveromyces thermotolerans
Metschnikowia pulcherrima
Levaduras “no-Saccharomyces”
Pectinasas
- Filtrabilidad
- Liberación de aromas y
compuestos fenólicos
Jolly et al., 2003. South African Journal of Enology and Viticulture 24, 55-62.
Cordente et al., 2012. Applied Microbiology and Biotechnology 96, 601–618.

10. Screening metabólico de alto
rendimiento para la caracterización de
levaduras no-Saccharomyces y su
incidencia sobre la calidad del vino

11. Muestreo: origen de las levaduras
• 762 levaduras aisladas y caracterizadas
• Vendimias 2012-2014
Orígenes:
- D.O. Ribera del Duero (Tempranillo,
Cabernet Sauvignon y Merlot)
- D.O. Tierra de León (Prieto Picudo)
- D.O. Rueda (Verdejo)

12. 50%
12%
12%
7%
5%
4%
3%2%1%
<1%
Hanseniaspora uvarum
Metschnikowia pulcherrima
Lachancea thermotolerans
Hanseniaspora clermontiae
Metschnikowia fruticola
Aureobasidium pullulans
Metschnikowia viticola
Cryptococcus amylolentus
Hanseniaspora osmophila
Saccharomyces cerevisiae
Torulaspora delbrueckii
Wickerhamomyces anomalus
Kluyveromyces marxianus
Meyerozyma guilliermondii
Rhodotorula glutinis
Zygosaccharomyces bailii
Estudio poblacional
(3 D.O., 3 vendimias, 5 variedades de uva)
762 levaduras
16 especies

13. Estudio enzimático de alto rendimiento
β-glucosidasa
β-xilosidasa
α-L-arabinofuranosidasa
β-liasa
Proteasa
Pectinasa
Celulasa
Revelación de compuestos aromáticos
Mejora de propiedades sensoriales y tecnológicas
762
levaduras

14. Estudio enzimático de alto rendimiento
β-glucosidasa
β-xilosidasa
α-L-arabinofuranosidasa
β-liasa
Proteasa
Pectinasa
Celulasa
Revelación de compuestos aromáticos
Mejora de propiedades sensoriales y tecnológicas
762
levaduras
Desarrollo de
métodos de
screening
masivo

15. 0
100
200
300
400
500
600
700
NS-EM-1
NS-EM-3
NS-EM-5
NS-EM-7
NS-EM-9
NS-EM-11
NS-EM-13
NS-EM-15
NS-EM-17
NS-EM-19
NS-EM-21
NS-EM-23
NS-EM-25
NS-EM-27
NS-EM-29
NS-EM-31
NS-EM-33
NS-EM-35
NS-EM-37
NS-EM-39
NS-EM-41
NS-EM-43
NS-EM-45
NS-EM-47
NS-EM-49
NS-EM-51
NS-EM-53
NS-EM-55
NS-EM-57
NS-EM-59
NS-EM-61
NS-EM-63
NS-EM-65
NS-EM-67
NS-EM-69
NS-EM-71
NS-EM-73
NS-EM-75
NS-EM-77
NS-EM-79
NS-EM-81
NS-EM-83
NS-EM-85
NS-EM-87
NS-EM-89
NS-EM-91
NS-EM-93
NS-EM-95
NS-EM-97
NS-EM-99
NS-G-61(C+)
Enzima15Agrovin(C+)
β-D-xilosidasa
Estudio de actividades enzimáticas
Unidadesdeabsorbancia
Efecto de tratamientos agresivos en campo
Finca A Finca B Finca C Finca D
Observación de variabilidad poblacional

16. 0
100
200
300
400
500
600
700
NS-EM-1
NS-EM-3
NS-EM-5
NS-EM-7
NS-EM-9
NS-EM-11
NS-EM-13
NS-EM-15
NS-EM-17
NS-EM-19
NS-EM-21
NS-EM-23
NS-EM-25
NS-EM-27
NS-EM-29
NS-EM-31
NS-EM-33
NS-EM-35
NS-EM-37
NS-EM-39
NS-EM-41
NS-EM-43
NS-EM-45
NS-EM-47
NS-EM-49
NS-EM-51
NS-EM-53
NS-EM-55
NS-EM-57
NS-EM-59
NS-EM-61
NS-EM-63
NS-EM-65
NS-EM-67
NS-EM-69
NS-EM-71
NS-EM-73
NS-EM-75
NS-EM-77
NS-EM-79
NS-EM-81
NS-EM-83
NS-EM-85
NS-EM-87
NS-EM-89
NS-EM-91
NS-EM-93
NS-EM-95
NS-EM-97
NS-EM-99
NS-G-61(C+)
Enzima15Agrovin(C+)
β-D-xilosidasa
Finca con tratamiento fitosanitario
Estudio de actividades enzimáticas
Unidadesdeabsorbancia
Efecto de tratamientos agresivos en campo
Finca A Finca B Finca C Finca D

17. Estudio filo-funcional
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
Hanseniaspora
uvarum
Metschnikowia
pulcherrima
Lachancea
thermotolerans
Hanseniaspora
clermontiae
Metschnikowia
fruticola
Aureobasidium
pullulans
Identificación
molecular de las
especies de
levadura
Caracterización
enzimática

18. Estudio filo-funcional
Identificación
molecular de las
especies de
levadura
Caracterización
enzimática

19. Estudio filo-funcional
A. pullulans
C. amylolentus
H. clermontiae
H. osmophila
H. uvarum
K. marxianus
L. thermotolerans
M. fruticola
M. pulcherrima
M. viticola
M. guilliermondii
R. glutinis
S. cerevisiae
T. delbrueckii
W. anomalus
Z. bailii

20. Estudio filo-funcional
A. pullulans
C. amylolentus
H. clermontiae
H. osmophila
H. uvarum
K. marxianus
L. thermotolerans
M. fruticola
M. pulcherrima
M. viticola
M. guilliermondii
R. glutinis
S. cerevisiae
T. delbrueckii
W. anomalus
Z. bailii
↑ abundancia

21. Estudio filo-funcional
A. pullulans
↓ abundancia
K. marxianus
M. fruticola
M. pulcherrima
M. viticola
T. delbrueckii

22. Objetivo
Desarrollo de nuevos productos basados en un exhaustivo conocimiento
sobre sus propiedades
Investigación dirigida a la industria

23. Revelación de aromas tiólicos
con Torulaspora delbrueckii
• Cultivo líquido
• Sin rehidratación
• Dosis 20 ml/Hl
• Certificación ecológica
(SOHISCERT)

24. T. delbrueckii
Actividad β-liasa de T. delbrueckii

25. T. delbrueckii
Actividad β-liasa de T. delbrueckii
Aplicación en bodega de una cepa
seleccionada en base a sus
propiedades enzimáticas

26. Incremento sensorial en variedades neutras
mediante revelación de aromas tiólicos
Condiciones de la
experiencia
Mosto flotado variedad Airén
Volumen: 7000 l
Temperatura 16ºC
990
1000
1010
1020
1030
1040
1050
1060
1070
1080
1090
0
2
4
6
8
10
12
Millones(UFC/ml)
Td 10 exp 6 ufc/ml Sc 1o exp 6 ufc/ml densidad
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 días
T. delbrueckii S. cerevisiae Densidad
Inoculación secuencial (SQ) de T. delbrueckii + S. cerevisiae
Seguimiento de las poblaciones

27. Caracterización del perfil aromático y análisis sensorial
T. delbrueckii + espontánea
Inoculación secuencial de T. delbrueckii
Inoculación simultánea de T. delbrueckii
Fermentación con S. cerevisiae

28. Caracterización del perfil aromático y análisis sensorial
TD
SQ
SM
Sc
↑ Revelación de
compuestos tiólicos
T. delbrueckii + espontánea
Inoculación secuencial de T. delbrueckii
Inoculación simultánea de T. delbrueckii
Fermentación con S. cerevisiae

29. Producción de manoproteínas
Manoproteínas en vino:
- Incremento de la estructura en boca de los
vinos
- Aumento dulzor y redondez
- Complejidad y persistencia aromática
- Disminución de la astringencia
Contenido en manoproteínas.
Equiv. manano mg/l
T. delbrueckii + espontánea
Inoculación secuencial de T. delbrueckii
Inoculación simultánea de T. delbrueckii
Fermentación con S. cerevisiae

30. Selección racional de levaduras con
actividad pectinolítica y su influencia
en aspectos tecnológicos y sensoriales
de vinos

31. Actividad pectinolítica
A. pullulans
M. pulcherrima
L. thermotolerans
++
+
-

32. Actividad pectinolítica en levaduras
Levaduras:
Aureobasidium pullulans (++)
Metschnikowia pulcherrima (+)
Kluyveromyces thermotolerans (-)
Saccharomyces cerevisiae (-)
Enzimas:
Enozym Lux (Control ++)
Enovin Clar (Control +)
Con maceración prefermentativa
12ºC (48h para levaduras; 4h para enzimas)
25ºC (temperatura de fermentación)
Sin maceración prefermentativa
25ºC (temperatura de fermentación)
Pectinasa
IC
Antocianos
FiltrabilidadTurbidez
IPT
+ S. cerevisiae

33. 0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
IC
ab a b b b b
Con maceración
prefermentativa
0
0,05
0,1
0,15
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
IC
ab ab a a b b
Resultados en laboratorio
Sin maceración
prefermentativa
+ Sc + Sc + Sc + Sc
14
12
10
8
6
15
10
5
0
UnidadesAbs
UnidadesAbs

34. 0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
IC
ab a b b b b
Con maceración
prefermentativa
0
0,05
0,1
0,15
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
IC
ab ab a a b b
Resultados en laboratorio
Sin maceración
prefermentativa
↑ Intensidad de Color
con M. pulcherrima con
maceración
prefermentativa
+ Sc + Sc + Sc + Sc
14
12
10
8
6
15
10
5
0
UnidadesAbs
UnidadesAbs
 15 %

35. 0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
IC
ab a b b b b
Con maceración
prefermentativa
0
0,05
0,1
0,15
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
IC
ab ab a a b b
Resultados en laboratorio
Sin maceración
prefermentativa
+ Sc + Sc + Sc + Sc
14
12
10
8
6
15
10
5
0
Pérdida de acción sin
maceración
prefermentativa
UnidadesAbs
UnidadesAbs
 15 %

36. 0,65
0,7
0,75
0,8
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
IPT
ab a ab b ab b
0,3
0,35
0,4
0,45
0,5
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
Antocianos
a a a a aa *
Con maceración prefermentativa
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
IPT
ab ab ab a c bc
0,3
0,4
0,5
0,6
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
Antocianos
a bc bcd d cab
Resultados en laboratorio
Sin maceración prefermentativa
↑ del contenido en polifenoles en presencia de M.
pulcherrima
+ Sc + Sc + Sc + Sc
+ Sc + Sc + Sc + Sc
50
45
40
35
30
60
50
40
30
100
80
60
40
20
0
80
75
70
65
UnidadesAbs
UnidadesAbs
UnidadesAbs
UnidadesAbs
 14 %
 10 %

37. 0
50
100
150
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
Filtrabilidad
c bc a d bb
0
20
40
60
Ap12 Mp12 Kt12 Sc12 Clar12 Lux12
Turbidez
b c a cd cdd
Con maceración prefermentativa
0
50
100
150
200
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
Filtrabilidad
bc bc a c db
0
10
20
30
40
50
Ap25 Mp25 Kt25 Sc25 Clar25 Lux25
Turbidez
c c b c ca
Resultados en laboratorio
Sin maceración prefermentativa
↓ Turbidez y tiempo de retención de los vinos con
no-Saccharomyces
+ Sc + Sc
+ Sc + Sc + Sc + Sc
+ Sc + Sc
Seg/mL
Seg/mL
NTU
NTU
 57 %
 34 %

38. Ensayos industriales
700 Kg de uva Tempranillo
7 ensayos:
Mp+Sc1
Mp+Sc2
Mp+Sc3
Mp
Sc1
Sc2
Sc3
Intensidad de Color
La actividad pectinolítica de M. pulcherrima
incide sobre parámetros como IC, IPT o la
Turbidez de los vinos

39. Ensayos industriales
700 Kg de uva Tempranillo
7 ensayos:
Mp+Sc1
Mp+Sc2
Mp+Sc3
Mp
Sc1
Sc2
Sc3
Intensidad de ColorÍndice de Polifenoles Totales
La actividad pectinolítica de M. pulcherrima
incide sobre parámetros como IC, IPT o la
Turbidez de los vinos

40. Ensayos industriales
700 Kg de uva Tempranillo
7 ensayos:
Mp+Sc1
Mp+Sc2
Mp+Sc3
Mp
Sc1
Sc2
Sc3
Intensidad de ColorÍndice de Polifenoles Totales
La actividad pectinolítica de M. pulcherrima
incide sobre parámetros como IC, IPT o la
Turbidez de los vinos

41. Conclusiones
• La implantación en el mercado de cepas de levaduras no-
Saccharomyces requiere un conocimiento exhaustivo sobre su
metabolismo y repuesta en bodega.
• El uso de levaduras no-Saccharomyces ha de realizarse de
forma racional con objetivos concretos de mejora de la
calidad sensorial de los vinos en base a sus propiedades
metabólicas.
• En un entorno de alta especialización tecnológica, el
desarrollo de nuevos productos y procesos en enología
requiere, cada vez mas, de una interacción dinámica entre la
industria y los centros de investigación.

42. Moltes Gràcies
Equipo investigador:
Antonio Santos
Eva Navascués
Ignacio Belda
Domingo Marquina
Javier Ruiz
Alejandro Alonso