El documento describe métodos para preservar microorganismos a corto y largo plazo. A corto plazo, los métodos incluyen transferencia directa, inmersión en aceite, congelación a -20°C y secado. A largo plazo, los métodos son ultrabajas temperaturas y liofilización. La liofilización es el método más efectivo, permitiendo almacenar microorganismos hasta 30 años.

1. Almacenamiento de
microorganismos
JUANDO

2. Métodos de preservación
Diversidad y evolución, manejo de pacientes,
investigación epidemiológica, y docencia.
• Corto tiempo=transferencia directa a subcultivos,
inmersión en aceite, congelación a -20°C, secado,
agua destilada.
• Largo tiempo= ultra-bajas temperaturas, liofilización.

3. Cortos periodos
• Transferencia directa subcultivos=
Se trata de periódicos subcultivos a medios frescos,
es el mas usado.
 Laborioso, puede comprometer el perfil
fenotípico de los m.o.
 Cada subcultivo aumenta la probabilidad de
mutaciones con cambios en el m.o.
 Las mutaciones dependen frecuencia
almacenamiento y medio usado (2-3 subcultivos)

4. Cortos periodos
• Mantenimiento del medio: ↓nutrientes↑ mutaciones ↑
grado de nutrientes ↑ mayor replicación. (agua dest., trip.
soya, medios nutritivos)
• Condiciones de almacenamiento: transferir a tubos tapa
rosca en lugares adecuados sin cambios de temperatura(5-
8°C) ↓ metabolismo ↑ viabilidad.
• Frecuencia de transferencia: cada laboratorio debe
estandarizar sus técnicas (5-10 colonias)
• Control de calidad: no es necesario en cada transferencia
pero debe hacerse periódicamente.

5. Cortos periodos
• Inmersión en aceite=
Método alternativo, añadir aceite mineral debidamente esterilizado al
m.o. hongos y bacterias pueden durar de 2-3 años. No requiere
frecuente transferencia. (mutaciones, contaminación)
• Congelación a -20°C=
Pueden ser viables por 2-3 años, formación de cristales de
hielo, fluctuación electrolítica.
• Secado=
Mohos y bacterias esporulados pueden ser secados. Suspensión 108
UFC/ml m.o inoculados en papel filtro, que se seca y se pone en viales
estériles. 4 años. CC

6. Largos periodos
Pueden ser costosos, menos laboriosos, menos
espacio, y reducen las chances de mutaciones.
• Ultra-bajas temperaturas=
Los m.o pueden mantenerse a -70°C, en
congeladores electrónicos o con nitrógeno
liquido. Chequeo y alarma son esenciales.

7. Largos periodos
• Almacenamiento de los viales: pueden ser usados
tubos de plástico (poliuretano) o vidrio
(borosilicato).
• Agentes crio-conservantes: protección durante el
proceso, almacenamiento y descongelación
(hongos, virus y bacterias)
a) Intracelular=glicerol, dimetil sulfoxido DMSO
b) Medio externo=skim milk, sorbitol, sacarosa…

8. Conservación de micobacterias
M.O Método Crio-conservante Temperatura Duración
almacenamiento
Congelación Skim milk -20°C 3-5 años
micobacterias Ultra- Skim milk -70°C ó -196°C 3-5 años
congelación
Liofilización Skim milk 4°C 16-30 años

9. Largos periodos
• Preparación del m.o para congelación: se inocula en el
medio adecuado, se incuba hasta la fase estacionaria,
centrifugar, se retira el pull y se resuspende en 2-5ml caldo,
añadir el crio-conservante, luego en la superficie del agar,
con pipeta estéril alicuotar 0,2-0,5 ml.
• Método de congelación: se recomienda congelación lenta,
1°C por minuto hasta -30°C. en NL congelar los viales -60°C
1 h antes de introducir el m.o.
• Descongelación: es el puto critico para el daño (-40°C y -
5°C) baño maría 35°C, transferir inmediatamente al medio
adecuado, cambios de presión pueden producir explosión.

10. Largos periodos
• Liofilización=
método mas efectivo para
bacterias, levaduras, esporulados y virus. Reduce el riesgo
de cristales intracelulares. Remoción del agua. ↑ gram
positivos que gram negativos. Hasta 30 años.
Espacio reducido, puede transportarse a temperatura
ambiente por largas distancias.
Combina congelación y deshidratación, primero
congelación (-60°C) y luego secado ↓ PA con aparato de
vacío.

11. • Almacenamiento de viales: se usan viales de vidrio doble o
vidrio blando previamente esterilizados. Se pone silica gel
en la parte inferior del vial exterior antes de insertar el vial
interior y se acolcha con algodón. Puede ser sellado para
mantener la presión atmosférica.
• Agentes crio-conservadores: los mas usados son skim milk
(20% v/v) y sacarosa. (24% v/v queda a 12% v/v). Skim milk
se alícuota en 5 ml y autoclava a 116°C.
• Preparación del m.o para liofilización: se requiere gran
cantidad en la fase de crecimiento o estacionaria. ATCC 108
UFC/ml a 1010 UFC/ml.

13. • Método de congelación-secado: cuando se usa la cámara, los viales con la
suspensión de m.o son colocados en una capa dentro de un recipiente de
acero inoxidable. El contenedor se pone en un congelador de bajas
temperaturas -60°C por 1 hora.
Se transfiere a la cámara que contiene hielo seco y etil solvente celular
(BECTON) y se cubre con sello hermético al vacío, conectado a reservas de
hielo seco y bombas de vacío. (30 µm Hg por 18 horas) contaminación
cruzada 0.8-3.3%
• Almacenamiento: deben etiquetarse y guardarse en orden. No se
recomienda almacenar a T° Amb, 4°C aceptable, -30 -60°C optimo.
• Reconstitución: se toman los viales de la parte superior, cubren con gaza
para evitar explosión al ingreso de aire. Se inyectan 0.1-0.4 ml de medio
enriquecido con pipeta Pasteur o jeringa, se agita y se disuelve, luego
transferir a el medio de cultivo adecuado.

15. Nuevas tecnologías
• Tarjetas FTA para almacenamiento de ADN. Largos
periodos, seguros, baratos y rápidos.
• Se impregna la tarjeta con buffer, radicales libres y proteínas
desnaturalizadoras que lisan membrana de la cell, atrapan el ADN y
protegen de la degradación.
• Viales, cristales de cerámica, crio conservación perlas
• http://www.plm-deaci.com/src/prods/18_tarjetas-fta.html

16. RESUMEN
Bacterias
Transferencias simples: algunos meses
Almacenamiento con aceite mineral: 1-2 años
Congelación a -20°C: 1-3 años
Congelación a -70°C: 1-10 años
N liq y liofilización: hasta 30 años