El documento describe las técnicas específicas requeridas para trabajar en un laboratorio de microbiología, incluyendo el uso de condiciones asépticas, campanas de flujo laminar y esterilización de materiales e instrumentos. Explica métodos como el calor seco, calor húmedo, vapor saturado a presión y filtración para esterilizar diferentes materiales, y destaca la importancia de prevenir contaminaciones durante el trabajo con microorganismos.

1. Para trabajar en un laboratorio de Microbiología se requieren unas técnicas específicas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones asépticas: el material e instrumental que se va a utilizar, así como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algún procedimiento de esterilización, eliminándose de ellos cualquier posible microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:

4. El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles. Los tubos o matraces deben ser tapados con algodón hidrófobo estéril o cubiertos con un capuchón metálico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estén manipulando. Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.

5. MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO Instrumentos Para Siembra de Microorganismos A.- Asa de Siembre. B.- Hilo de Siembra. C.- Pipeta de Pasteur. D.- Cayado.

6. PIPETAS A.- Pipeta automática de 0,2 - 1ml. B.- Pipeta automática de 0,02 - 0,2ml. C-- Pipeta de vidrio de 10m. D.- Pipeta de vidrio de 1ml.

7. MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIÓN

8. PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado:

9. El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc., se cierran con algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa algodón, a de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave.

10. TÉCNICAS El método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras razones porque es el más económico y el más fácil de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de calor seco o de calor húmedo . El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidación y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor húmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno responsables de la estructura tridimensional de las proteínas , haciendo que éstas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

11. La esterilización por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente. Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, espátulas, etc. Consiste en someter directamente a la acción de la llama de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este método es rápido y su eficacia es altísima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolábiles. CALOR SECO

12. Esterilización por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas (160 - 180ºC durante cerca de 2 horas ). ESTERILIZACIÓN POR AIRE CALIENTE

13. Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar líquidos (como medios de cultivo), ya que al llegar a los 100ºC comenzarían a hervir y continuarían hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de ebullición del agua a presión atmosférica, y a esta temperatura las endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en muestras en las que supiésemos que no existen endosporas, esta metodología puede implicar cambios en la concentración de los componentes del medio, a causa de la fuerte evaporación sufrida.

14. El calor húmedo también se utiliza para la destrucción de los microorganismos siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho más eficaz que el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rápidamente, al igual que las membranas celulares. Además, el vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresión, es un eficaz transmisor de calor al interior de la célula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios métodos: ebullición, vapor fluente y vapor saturado a presión: CALOR HÚMEDO

15. Ebullición: El agua hirviendo (100ºC) tiene acción limitada, ya que aplicada durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podría utilizar el baño María o baño de agua hirviente (sólo con fines de desinfección en el laboratorio), cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros métodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave. EBULLICIÓN:

16. Vapor fluente: Esta técnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior a 100ºC sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azúcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presión atmosférica, con la espita abierta , donde nunca se superan los 100ºC, y se realiza el proceso durante tres días consecutivos, dejándose a temperatura ambiente en los intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100ºC) durante 30-45 minutos destruyéndose en este proceso las formas vegetativas pero no las endosporas termorresistentes. Si éstas se encuentran presentes en la muestra germinan después del calentamiento y estas formas vegetativas serán destruidas en los siguientes ciclos. Este método de esterilización se denomina también esterilización fraccionada o tindalización . VAPOR FLUENTE

17. Célula Vegetativa Célula Esporulando Espora Germinación de la Espora Crecimiento Célula

18. Vapor saturado a presión: La esterilización por esta técnica utiliza vapor de agua saturado que se somete a una atmósfera extra de presión sobre la presión atmosférica normal, elevándose con ello el punto de ebullición del agua de 100ºC a 121ºC y consiguiéndose la destrucción de todos los microorganismos (salvo los termófilos extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es también necesaria para la destrucción de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia térmica y que pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100ºC durante horas. El vapor de agua difunde por ósmosis a través de las membranas de las esporas, coagulando su protoplasma, fenómeno que se acentúa si el vapor es saturado y a sobrepresión. Esta técnica de esterilización requiere el uso del autoclave. VAPOR SATURADO A PRESIÓN

19. Para la esterilización de materiales líquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo, soluciones de antibióticos, enzimas, vacunas, etc. o también para gases, se utiliza la filtración . En la esterilización por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtración los retira de una forma mecánica, en lugar de destruirlos.

20. La filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante, con poros lo suficientemente pequeños como para retener células microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente, los denominados filtros de membrana y están integrados por pequeñas piezas de material sintético, generalmente acetato de celulosa o policarbonato, que pueden tener poros con tamaños de 0,22 y 0,45 µm, diseñados para retener bacterias. La acción combinada de los poros, la trama del filtro y la naturaleza química del material utilizado retiene los microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan a través de la membrana con la ayuda del vacío generado, por ejemplo, con una bomba de vacío. Tanto los filtros de membrana como los equipos de filtración con los que éstos se usan deben ser esterilizados por otros métodos, generalmente el autoclave. Los virus y algunas bacterias de tamaño muy pequeño como, por ejemplo, los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales. LA FILTRACIÓN

21. MATERIALES QUE SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPOR Material textil Material de vidrio Material de goma Instrumental Quirúrgico de acero inoxidable Soluciones acuosas Todo aquel material cuyo fabricante certifique pueda ser esterilizado por vapor MATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPOR Sustancias oleosas Sustancias grasas Polvos Instrumental Quirúrgico cromado o niquelado Artículos eléctricos sin cobertura especial Todo material que no tolera la exposición al calor y a la humedad

22. MATERIALES QUE PUEDEN ESTERILIZARSE POR CALOR SECO Instrumental Quirúrgico cromado Materiales de vidrio, aluminio o porcelana Aceites, parafina, sustancias grasas, vaselina Polvos (talco) MATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR POR CALOR SECO Material textil (algodón, sedas, lino, etc.) Gomas Materiales sintéticos Todo material que se altere a la temperatura de trabajo NOTA: cuando el material a esterilizar sea mal conductor térmico (talco), deberá disponerse en capa delgada.

23. Una acción mecánica : como frotar, cepillar, lavar con agua bajo presión o uso de aire comprimido. Una acción química : detergente, detergente enzimático y agua que son usados para inhibir y eliminar a los microbios, residuo orgánico y el polvo. El calor (agua caliente) mejora las propiedades de disolución del agua, el detergente y enzimas. LA LIMPIEZA GENERALMENTE COMPRENDE: