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Métodos de conservación de
microorganismos
División: Químico - Biológicas
Materia: Ingeniería de las fermentaciones
Grupo: 10IBT1
Alumnos:
 Aguilar González David Alejandro
 Castillo Nava Alan Omar
 Domínguez Lora Luis
 García Moncada Elizabeth
 Gutiérrez Sandoval María Teresa
 Linares Soledad Daniela Lilian
 Ramírez Sánchez Jesús
Introducción: ¿Qué debemos saber?
• Microorganismos  Materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos,
vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de
solventes y reactivos, entre otras aplicaciones.
El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido
la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes
permanezcan estables.
Características que deben cumplir los métodos de conservación
• El cultivo a preservar debe ser puro, evitando que se produzcan contaminaciones
durante el proceso de conservación.
• Durante el tiempo de conservación deben sobrevivir al menos el 70-80% de las
células y que estas células permanezcan genéticamente estables.
Criterios para la elección del método
Deben considerarse:
• Viabilidad y pureza de las cepas.
• Cambios poblacionales y genéticos.
• Número y valor de los cultivos.
• Costo, suministro y transporte de cepas.
• Frecuencia del uso de los cultivos.
• Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, por sus siglas en
inglés), enuncia que por seguridad y para minimizar la probabilidad de
pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2
procedimientos diferentes.
Comprobación de viabilidad de las cepas
• Objetivo: Reducir el ritmo
metabólico de los organismos por
retención de nutrientes, agua y
oxígeno; por reducción de la
temperatura de conservación; o por
combinación de ambos.
• Se agrupan en tres grandes
grupos:
• Métodos a largo y corto plazo y
métodos alternativos.
• Garantizan la estabilidad genética.
• Son los más utilizados en microorganismos que han sido
sujetos a manipulaciones genéticas.
• Permiten evaluar medicamentos con alto potencial
genotóxico y carcinogénico
• Test de Ames, (cepas his de Salmonella typhimurium),
caracterizadas a nivel genético-molecular, evalúa el
crecimiento de bacterias que hayan experimentado
reversiones.
• Entre estos métodos se encuentran la congelación y la
liofilización.
Congelación
Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector (y se guardan a
temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al
no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento.
Factores que influyen en el método:
• Edad de las células: células maduras del inicio de la fase estacionaria
• Velocidad en la congelación y descongelación: Conviene poner las células a 37ºC
• Temperatura de almacenamiento: tubos cerrados o sellados, que contengan las células
microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido (–195ºC), o bien en la fase gaseosa del nitrógeno
líquido, con una temperatura de (–140ºC) .En el mercado existen variados tipos de armarios
congeladores, de los cuales los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de
–70ºC.
• Empleo de agentes crioprotectores: glicerol, a una concentración del 15 al 20%, dimetilsulfóxido,
la leche descremada y carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, sucrosa, entre otros).
Congelación
Liofilización
• Es una técnica de sublimación al vacío (eliminación del agua de una sustancia
congelada por sublimación del hielo bajo vacío)
• Los productos de liofilización son higroscópicos y deben protegerse de la
humedad durante el almacenamiento.
• Lioprotector (generalmente sacarosa)
• Los cultivos liofilizados se almacenan en la oscuridad a 4 ° C en refrigeradores.
• Viabilidad: Durante más de 20 años.
• Es muy ventajoso ya que solo se requiere un mínimo espacio de
almacenamiento para preservar.
Liofilización
Factores que influyen en la liofilización
• 1. Tipo de microorganismo: Algunos no resisten el método.
• 2. Concentración celular : Suspensiones celulares de bacterias [108-109
células/ml] y un poco inferior para hongos filamentosos y levaduras.
• 3. Temperatura durante la sublimación: > - 50°C
• 4. Grado de deshidratación alcanzado
• 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo
• 6. Condiciones de almacenamiento: 20°C y sin bajar de los 0ºC, en oscuridad
Liofilizador
Almacenamiento en suelo estéril
• Se aplica principalmente para la preservación de microorganismos
esporulantes: Fusarium, Penicillium, Alternaria, Rhizopus, entre otros.
• Implica la inoculación de 1 ml de suspensión de esporas en el suelo y
la incubación a temperatura ambiente durante 4-5 días.
• El período de crecimiento inicial permite que el hongo use la
humedad disponible y que se vuelva inactivo gradualmente.
• Las ampolletas se almacenan en el refrigerador.
• Viabilidad: Alrededor de 70-80 años.
Almacenamiento en suelo estéril
Almacenamiento en aceite mineral o parafina líquida
• Se vierte parafina líquida estéril sobre el cultivo inclinado de microorganismos y
se almacena en posición vertical a temperatura ambiente.
• También se pueden mantener cubriendo las inclinaciones de agar con aceite
mineral estéril que se almacena a temperatura ambiente o preferiblemente a 0-5
° C.
• Limita el acceso de oxígeno, reduciendo el metabolismo y el crecimiento del
microorganismo, así como el secado celular.
• Período de conservación: Azotobacter y Mycobacterium es de 7-10 años, para
Bacillus es de 8-12 años.
Almacenamiento en suspensión salina
• El cultivo bacteriano se conserva en
una concentración de sal al 1% en
tubos con tapa de rosca para evitar la
evaporación.
• Los tubos se almacenan a temperatura
ambiente.
• Cuando sea necesario, la transferencia
se realiza en Agar Slant.
Criopreservación
• Congelación en nitrógeno líquido (-196
° C) o en estado gaseoso (-150 ° C).
• Los moo’s se congelan en presencia de
agentes estabilizadores como el glicerol
o el dimetilsulfóxido (DMSO) que
previenen el daño celular debido a la
formación de cristales de hielo y
promueven la supervivencia celular .
• Viabilidad: 10-30 años sin sufrir
cambios en sus características.
Criopreservación
Inmersión en agua destilada
• Método económico y de bajo mantenimiento para almacenar cultivos de hongos que
espurulan.
• Temperatura: 20 ° C,
• Viabilidad: hasta 2-10 años dependiendo de la especie.
• Implica inocular las inclinaciones de agar con cultivos de hongos y luego incubarlos a 25 ° C
durante varias semanas para inducir la esporulación.
• Se agrega agua destilada estéril (6-7 ml) asépticamente al cultivo, y la superficie del cultivo se
raspa suavemente con una pipeta para producir una espora y una suspensión de micelio.
• Se mantiene en un vial de vidrio estéril a 25 ° C y para recuperar un cultivo, se extraen 200-
300 µl de la suspensión del vial y se colocan en medio fresco.
Almacenamiento en gel de sílice
Almacenamiento en gel de sílice
• Los mo’s se pueden almacenar en polvo de gel de sílice a baja
temperatura durante un período de 1 a 2 años.
• Desecación rápida a baja temperatura, lo que permite que la célula
permanezca viable durante un largo período de tiempo.
• Algunas de las especies que se conservan en gel de sílice anhidro son:
Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans, Pseudomonas
denitrificans, Escherichia coli, entre otros.
• No se pueden emplear otros métodos debido a:
• Carecer de los equipos necesarios.
• La cepa no resiste los tratamientos de la conservación por otros
métodos.
• Las cepas contienen construcciones genéticas especificas o
características especiales que se utilicen para medir el efecto de
toxicológico de un fármaco.
• Se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos
métodos.
Transferencia periódica o subcultivo
• La cepa microbiana  Cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido.
• Excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan provocando envejecimiento y
muerte celulares.
• Es el peor método para conseguir la estabilidad genética, (alternancia de generaciones).
• Es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras, de varias
maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de
algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son
anaerobios facultativos y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC.
• Se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril para evitar en la medida la
desecación del medio de cultivo,.
• Los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último,
• La contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del
tiempo.

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Métodos de conservación de microorganismos.pptx

  • 1. Métodos de conservación de microorganismos División: Químico - Biológicas Materia: Ingeniería de las fermentaciones Grupo: 10IBT1 Alumnos:  Aguilar González David Alejandro  Castillo Nava Alan Omar  Domínguez Lora Luis  García Moncada Elizabeth  Gutiérrez Sandoval María Teresa  Linares Soledad Daniela Lilian  Ramírez Sánchez Jesús
  • 2. Introducción: ¿Qué debemos saber? • Microorganismos  Materiales esenciales de trabajo en la obtención de medicamentos (antibióticos, vitaminas y aminoácidos), elaboración de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricación de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biológicos en la biotecnología y la protección medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que las propiedades que los hacen importantes permanezcan estables.
  • 3. Características que deben cumplir los métodos de conservación • El cultivo a preservar debe ser puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación. • Durante el tiempo de conservación deben sobrevivir al menos el 70-80% de las células y que estas células permanezcan genéticamente estables.
  • 4. Criterios para la elección del método Deben considerarse: • Viabilidad y pureza de las cepas. • Cambios poblacionales y genéticos. • Número y valor de los cultivos. • Costo, suministro y transporte de cepas. • Frecuencia del uso de los cultivos. • Federación Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC, por sus siglas en inglés), enuncia que por seguridad y para minimizar la probabilidad de pérdida de las cepas, cada una debe ser mantenida por al menos 2 procedimientos diferentes.
  • 6. • Objetivo: Reducir el ritmo metabólico de los organismos por retención de nutrientes, agua y oxígeno; por reducción de la temperatura de conservación; o por combinación de ambos. • Se agrupan en tres grandes grupos: • Métodos a largo y corto plazo y métodos alternativos.
  • 7. • Garantizan la estabilidad genética. • Son los más utilizados en microorganismos que han sido sujetos a manipulaciones genéticas. • Permiten evaluar medicamentos con alto potencial genotóxico y carcinogénico • Test de Ames, (cepas his de Salmonella typhimurium), caracterizadas a nivel genético-molecular, evalúa el crecimiento de bacterias que hayan experimentado reversiones. • Entre estos métodos se encuentran la congelación y la liofilización.
  • 8. Congelación Se congelan las células en suspensión en un líquido con un agente crioprotector (y se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centígrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al no disponer las células de agua en forma líquida, no hay crecimiento. Factores que influyen en el método: • Edad de las células: células maduras del inicio de la fase estacionaria • Velocidad en la congelación y descongelación: Conviene poner las células a 37ºC • Temperatura de almacenamiento: tubos cerrados o sellados, que contengan las células microbianas, sumergidos en nitrógeno líquido (–195ºC), o bien en la fase gaseosa del nitrógeno líquido, con una temperatura de (–140ºC) .En el mercado existen variados tipos de armarios congeladores, de los cuales los más aconsejables son los que alcanzan temperaturas por debajo de –70ºC. • Empleo de agentes crioprotectores: glicerol, a una concentración del 15 al 20%, dimetilsulfóxido, la leche descremada y carbohidratos (glucosa, lactosa, sacarosa, inositol, sucrosa, entre otros).
  • 10. Liofilización • Es una técnica de sublimación al vacío (eliminación del agua de una sustancia congelada por sublimación del hielo bajo vacío) • Los productos de liofilización son higroscópicos y deben protegerse de la humedad durante el almacenamiento. • Lioprotector (generalmente sacarosa) • Los cultivos liofilizados se almacenan en la oscuridad a 4 ° C en refrigeradores. • Viabilidad: Durante más de 20 años. • Es muy ventajoso ya que solo se requiere un mínimo espacio de almacenamiento para preservar.
  • 12. Factores que influyen en la liofilización • 1. Tipo de microorganismo: Algunos no resisten el método. • 2. Concentración celular : Suspensiones celulares de bacterias [108-109 células/ml] y un poco inferior para hongos filamentosos y levaduras. • 3. Temperatura durante la sublimación: > - 50°C • 4. Grado de deshidratación alcanzado • 5. Atmósfera de oxígeno en el tubo • 6. Condiciones de almacenamiento: 20°C y sin bajar de los 0ºC, en oscuridad
  • 14. Almacenamiento en suelo estéril • Se aplica principalmente para la preservación de microorganismos esporulantes: Fusarium, Penicillium, Alternaria, Rhizopus, entre otros. • Implica la inoculación de 1 ml de suspensión de esporas en el suelo y la incubación a temperatura ambiente durante 4-5 días. • El período de crecimiento inicial permite que el hongo use la humedad disponible y que se vuelva inactivo gradualmente. • Las ampolletas se almacenan en el refrigerador. • Viabilidad: Alrededor de 70-80 años.
  • 16. Almacenamiento en aceite mineral o parafina líquida • Se vierte parafina líquida estéril sobre el cultivo inclinado de microorganismos y se almacena en posición vertical a temperatura ambiente. • También se pueden mantener cubriendo las inclinaciones de agar con aceite mineral estéril que se almacena a temperatura ambiente o preferiblemente a 0-5 ° C. • Limita el acceso de oxígeno, reduciendo el metabolismo y el crecimiento del microorganismo, así como el secado celular. • Período de conservación: Azotobacter y Mycobacterium es de 7-10 años, para Bacillus es de 8-12 años.
  • 17. Almacenamiento en suspensión salina • El cultivo bacteriano se conserva en una concentración de sal al 1% en tubos con tapa de rosca para evitar la evaporación. • Los tubos se almacenan a temperatura ambiente. • Cuando sea necesario, la transferencia se realiza en Agar Slant.
  • 18. Criopreservación • Congelación en nitrógeno líquido (-196 ° C) o en estado gaseoso (-150 ° C). • Los moo’s se congelan en presencia de agentes estabilizadores como el glicerol o el dimetilsulfóxido (DMSO) que previenen el daño celular debido a la formación de cristales de hielo y promueven la supervivencia celular . • Viabilidad: 10-30 años sin sufrir cambios en sus características.
  • 20. Inmersión en agua destilada • Método económico y de bajo mantenimiento para almacenar cultivos de hongos que espurulan. • Temperatura: 20 ° C, • Viabilidad: hasta 2-10 años dependiendo de la especie. • Implica inocular las inclinaciones de agar con cultivos de hongos y luego incubarlos a 25 ° C durante varias semanas para inducir la esporulación. • Se agrega agua destilada estéril (6-7 ml) asépticamente al cultivo, y la superficie del cultivo se raspa suavemente con una pipeta para producir una espora y una suspensión de micelio. • Se mantiene en un vial de vidrio estéril a 25 ° C y para recuperar un cultivo, se extraen 200- 300 µl de la suspensión del vial y se colocan en medio fresco.
  • 21. Almacenamiento en gel de sílice
  • 22. Almacenamiento en gel de sílice • Los mo’s se pueden almacenar en polvo de gel de sílice a baja temperatura durante un período de 1 a 2 años. • Desecación rápida a baja temperatura, lo que permite que la célula permanezca viable durante un largo período de tiempo. • Algunas de las especies que se conservan en gel de sílice anhidro son: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans, Pseudomonas denitrificans, Escherichia coli, entre otros.
  • 23. • No se pueden emplear otros métodos debido a: • Carecer de los equipos necesarios. • La cepa no resiste los tratamientos de la conservación por otros métodos. • Las cepas contienen construcciones genéticas especificas o características especiales que se utilicen para medir el efecto de toxicológico de un fármaco. • Se recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos métodos.
  • 24. Transferencia periódica o subcultivo • La cepa microbiana  Cultivo activo en el medio de cultivo en el que ha crecido. • Excretan productos tóxicos del metabolismo que se acumulan provocando envejecimiento y muerte celulares. • Es el peor método para conseguir la estabilidad genética, (alternancia de generaciones). • Es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar los periodos entre dos resiembras, de varias maneras como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inóculo; rebajando la proporción de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los microorganismos que son anaerobios facultativos y almacenando los cultivos a 4ºC-8ºC. • Se suele recubrir el crecimiento con una capa de aceite mineral estéril para evitar en la medida la desecación del medio de cultivo,. • Los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente cerrados. Por último, • La contaminación de los cultivos resulta más fácil al tener que manejar los tubos a lo largo del tiempo.