Alzheimer disease

1. Mariana Velasquez Cano
Paula Andrea Pizarro Marín
DISRUPTION OF AMYLOID PLAQUES INTEGRITY AFFECTS
THE SOLUBLE OLIGOMERS CONTENT FROM ALZHEIMER
DISEASE BRAINS.
Sebastian Jimenez1,2,4., Victoria Navarro1,2,4., Javier Moyano1,2,4, Marı´a Sanchez-Mico1,2,4, Manuel Torres1,2¤, Jose Carlos Davila3,4, Marisa Vizuete1,2,4,
Antonia Gutierrez 3,4" *, Javier Vitorica 1,2,4" *
1. Departamento Bioquı´mica y Biologı´a Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain, 2. Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS)-Hospital
Universitario Virgen del Rocı´o/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain, 3. Departamento Biologı´a Celular, Gene´tica y Fisiologı´a, Facultad de Ciencias, Instituto de
Investigacio´ n Biome´ dica de Ma´ laga (IBIMA), Universidad de Ma´ laga, Ma´ laga, Spain, 4. Centro de Investigacio´ n Biome´ dica en Red sobre Enfermedades
Neurodegenerativas (CIBERNED), Madrid, Spain

2. INTRODUCTION
ALZHEIMER DISEASE
Characterized by progressive
cognitive and behavioral deficits
Common symptoms
• Memory loss
• Confusion
• Impaired judment
• Personality changes
• desorientation
Jeffrey B. Halter, Joseph G. Ouslander, Mary E. Tinetti, Stephanie Studenski, Kevin P. High, Sanjay Asthana.(2009).Hazzard's Geriatric Medicine and Gerontology, 6e.Chapter 65. Dementia Including
Alzheimer's Disease

3. ALZHEIMER DISEASE
Late onset (sporadic AD)
• >60 years
• Associated with environmental
and genetic risk
APOE4: maybe influences the
aggregation of amyloid β- peptide
Early onset (familial AD)
• <60 years
• Has been linked to mutation in
the genes for
APP
PS1
PS2
Jeffrey B. Halter, Joseph G. Ouslander, Mary E. Tinetti, Stephanie Studenski, Kevin P. High, Sanjay
Asthana.(2009).Hazzard's Geriatric Medicine and Gerontology, 6e.Chapter 65. Dementia Including Alzheimer's Disease

4. • BRAAK I- II:
TRANSENTORHINALE
PHASE
• BRAAK III-IV:
LIMBISCHE PHASE
• BRAAK V- VI:
NEOKORTIKALE PHASE
Jimenez S, Navarro V, Moyano J, Sanchez-Mico M, Torres M, et al. (2014) Disruption of Amyloid
Plaques Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE
9(12): e114041. doi:10.1371/journal.pone.0114041

5. The neuropathological hallmarks of AD
include
• Amyloid plaques
• Neurofibrillary tangles

6. AMYLOID PLAQUES
Β- AMYLOID
Is an amino-acid hydrophobic
peptide realeased from the
amyloid presursor protein APP

8. SENILE PLAQUE

9. OBJETIVE
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Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE 9(12): e114041. doi:10.1371/journal.pone.0114041
Analysed the Abeta content in the soluble fractions of the
hippocampus from human AD autopsy samples and
transgenic models in order to investigate the posible
repersussion of the homogenization protocols in the
soluble fraction preparation.

10. MATERIALES Y MÉTODOS
ANTICUERPOS
Proteínas de globulina que
reaccionan específicamente con el
antígeno que estimula su
producción
• Neutralizar toxinas y virus
• Activan el complemento
• Evitan fijación de microbios
• Capacidad catalítica
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Disruption of Amyloid Plaques Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from
Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE 9(12): e114041.
doi:10.1371/journal.pone.0114041

11. MATERIALES Y MÉTODOS
30 muestras
humanas
BTIN IDIBELL
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Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE 9(12):
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12. MATERIALES Y MÉTODOS
FRACCIONES SOLUBLES
Preparación de lisados de cerebros
humanos
Homogeneizador
Dounce en TRIS
SOBRENADANTE
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Amyloid Plaques Integrity Affects the Soluble Oligomers Content from Alzheimer
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13. MATERIALES Y MÉTODOS
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doi:10.1371/journal.pone.0114041
•Ruptura celular
•Verificación de purificación
de la proteína
•Lisis
•Homogenización
•Desintegración térmica
Extracción de proteínas

14. MATERIALES Y MÉTODOS
ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
Cuantificación de antígeno con anticuerpo
ELEMENTOS
• Fase solida
• Antígeno o anticuerpo
• Enzima
• sustrato
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15. MATERIALES Y MÉTODOS
• FASE SÓLIDA • Favorecen la adsorción
• Permiten fijación covalente
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16. MATERIALES Y MÉTODOS
• ENZIMA • Debe unirse fácilmente
• Debe tener un substrato cromogénico
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17. MATERIALES Y MÉTODOS
• SUSTRATO
• No toxico ni mutagénico
• Fácil de manipular
• Bajo costo
• Sensibilidad/ especificidad
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18. MATERIALES Y MÉTODOS
ELISA
COMPETITIVA NO COMPETITIVA

19. MATERIALES Y MÉTODOS
•Ruptura del tejido/ célula
•Separación de la fracción deseada
•Diferencia de densidad
•Presencia de algún antígeno
Fracciones

20. MATERIALES Y MÉTODOS
WESTERN BLOTT
Se utiliza para detectar proteínas especificas
en una muestra determinada mediante
electroforesis en gel

21. MATERIALES Y MÉTODOS
• Tamaño de una proteína
• confirmar la presencia de
modificaciones post-traduccionales
como la fosforilación
• comparar cuantitativamente los
niveles de proteína entre muestras.

22. MATERIALES Y MÉTODOS
PCR
(reacción de cadena polimerasa)
CICLOS REPETITIVOS
DE
• Desnaturalización
• Unión
• Extensión

23. MATERIALES Y MÉTODOS
APLICACIONES • Clonaciones de fragmentos de DNA
• Detección de células tumorales
• Detección de secuencias sin purificación
previa
• Secuencia de ácidos nucleicos
• Establecimiento de polimorfismos
• Rastreo de mutaciones

24. MATERIALES Y MÉTODOS
DIFICULTADES
• Falsos positivos por contaminación
• Costos
• Interpretación clínica puede ser
difícil

25. MATERIALES Y MÉTODOS
Se obtiene una fracción
Aislamiento de la placa amiloide

26. MATERIALES Y MÉTODOS
Nutrientes
carbohidratos
Inhibidores
Antibióticos
Factores de crecimiento
Colorantes e indicadores

27. RESULTADOS
Bajo contenido de oligomeros de abeta
soluble en pacientes con AD en la formación
hipocampal.
Se analizó el contenido de la abeta soluble
usando homogenización DOUNCE y ultra
centrifugación en BRAAK estadío V-VI y en el
control no demente BRAAK estadío II-IV.

28. RESULTADOS
FIGURA 1.B
Bajo contenido de oligomeros de abeta soluble en
pacientes con AD en la formación hipocampal.
Caracterización de las especies
abeta utilizando western blots.

29. RESULTADOS
FIGURA 1.C
Bajo contenido de oligomero s de abeta soluble en
pacientes con AD en la formación hipocampal.
Mayor contenido de proteínas (100
microgramo de fracción soluble) en
6E10 ensayo de inmunoprecipitación.

30. RESULTADOS
FIGURA 2.A
El procedimiento de homogenización largamente
determinado del contenido de las especies abeta en la
fracción soluble.
Compararon los efectos de la homogenización y zonificación a
diferentes intensidades.
Usaron la corteza cerebral de un raton transgénico con
abundantes placas abeta.
Despues de la homogenizacion el TBS, MICROSOMAL se aislaron por
centrifugacion. Y se extrajo el abeta con 2% SDS Y 4% SDS 8M urea..

31. RESULTADOS
FIGURA 2.A
El procedimiento de homogenización largamente
determinado del contenido de las especies abeta en la
fracción soluble.

32. RESULTADOS
FIGURA 2.E
El procedimiento de homogenización largamente
determinado del contenido de las especies abeta en la
fracción soluble.
Las placas fueron
aisladas por ultra
centrifugación en
sacarosa y fue
homogenizado por
DOUNCE o
zonificación.

33. RESULTADOS
FIGURA 3.A
Análisis bioquímico de los derivados de DOUNCE
en las fracciones solubles.
Se evaluó el protocolo de aislación usando (en adicion
del antibeta) anti soluble APP alfa anticuerpo, (como un
marcador del compartimeinto extraceluar), un anti ATP
SINTETASA beta (mitocondria) LC3I (CITOSOL) Y un
LC3II (marcado de vesículas autofagicas).

34. RESULTADOS
FIGURA 3.A
Análisis bioquímico de los derivados de
DOUNCE en las fracciones solubles.

35. RESULTADOS
FIGURA 3.C
Análisis bioquímico de los derivados de DOUNCE
en las fracciones solubles.
El PS1*APP muestras
corticales (12 meses)
fueron primero
homenizadas, con
DOUNCE, y ultrafugadas
en orden para eliminar
toda la abeta soluble
putativa. Lo que queda de
los granulos(contienen las
placas) fueron sujetas a un
segundo round de
homogenización usando
aunque DOUNCE O
ZONIFICACION

36. DISCUSSION
Author Review Agreement or
Disagreement
Dohler F.
et al.
¨Resported the presence of large amounts of
different soluble Abeta species, specialy of
humas AD samples.¨
Sanchez-Varo R
et al.
¨When the brain tissue is not manipulated the
abeta levels in the intereticial fluids are much
lowe than the obteined in the TBS extraccional
fraction¨.

37. DISCUSSION
Author Review Agreement or
Disagreement
Hong, S.
Et al.
¨Microdialysis showed the existence of low levels
of Abeta species¨.
¨Soluble fractions isolated using mild or strong
homenization approaches are nor representative
of the real Abeta content in the instersticial fluids,
and that only microdialysis, using large cutoff
membranes, may better represent the actual
Abeta equilibrium in the IFS (intersticial fluid)¨.
Hong, S.
Et al.

38. CONCLUSIONS
This study showed the principal objective that was to find out
how the different intensivities on the homeginazation will
permite a disruption in the amyloid plaques.
This discoveries are a new base for other investigators to
find new protocols to isolated the extracelualar soluble
fraction.

39. CONCLUSIONES
The Abeta peptide 42 increase the concentration at the same
time as the desease progression. It is important to know this,
because in future, investigations will be lead by this discovery
and will be more precise on finding the cure or the treatment
of alzheimer desease.
The difference between this study and the others might be
the brain regions that were used. It is important because all
regions are different and the acumalation of the plaques
are too.

41. Mariana Velásquez Cano

42. Thanks

43. BIBLIOGRAFIA
• Jimenez S, Navarro V, Moyano J, Sanchez-Mico M, Torres M, et al. (2014) Disruption of Amyloid Plaques Integrity Affects
the Soluble Oligomers Content from Alzheimer Disease Brains. PLoS ONE 9(12): e114041.
doi:10.1371/journal.pone.0114041
• Kim E, Barret, Scott Boitano, Susan M, Barman, Heddwen L. Brooks. “gagnon´s review of medical physiology” 24th Ed.
Charpter 15. Learning, momory, lenguaje and speech.
• Warren Levinson, MD, PhD.” Review of Medical Microbiology and Immunology”, 13Ed.