Actividad citotóxica de aril iminas

1. Estudio de la embriotoxicidad, citotoxicidad y
perfil predictivo de bioseguridad de PhAR-HEA
Universidad Autónoma de Sinaloa
Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Maestría en Ciencias Biomédicas
Presentación de avances mes de mayo
Que presenta
Lic. BG. Sonia Leticia Ramírez Varela
Directores de tesis:
Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martinez
Dra. Geovanna Nallely Quiñonez Bastidas
Mayo, 2023

2. Dolor neuropático
Prevalencia mundial del 7-10%
México: 700,000
>50 años: 41.5%
Mujeres: 48.3% Hombres: 33.6%
Antidepresivos
● Amitriptilina
● Duloxetina
Antiepilépticos
● Gabapentina
● Pregabalina • Somnolencia
• Malestar estomacal
• Insuficiencia renal
• Infarto al miocardio
• Tolerancia al compuesto
• Interacciones farmacológicas
• Adicción
Diseño de nuevos
fármacos

3. ((Z)-18-(2-hidroxietilamino)-18-oxooctadecano-9-en-
7-il) 2-fenilacetato (PhAR-HEA)
Evaluación toxicológica
Martini y col., 2011 ;Montero y col., 2019; Quiñonez-Bastidas y col., 2020.
(R,Z)-18-((1S,4S)-5-metil-2,5-
díazabicilo[2.2.1]heptano-2il)-18-
oxooctadecano-9-en-7-il fenilacetato
(PhAR-DBH-Me)
3
PhAR-HEA

4. Potenciales fármacos
Síntesis de PhAR-HEA
2

5. Potenciales fármacos
Diseño experimental in silico
2
ADMETLab

6. Potenciales fármacos
Elaboración de la base de datos
2
ADMETLab
Excel

7. Potenciales fármacos
Diseño experimental in vitro
2

8. Potenciales fármacos
Diseño experimental in ovo
2

9. Potenciales fármacos
Cambios en el protocolo
2
• Ajuste de formato
• Redacción de
justificación
• Se añadió
bibliografía APA 7
• Se mejoró la
redacción del
texto acorde al
título del proyecto

10. Potenciales fármacos
Tratamientos para el dolor neuropático
Montero y col., 2019
2
Interacciones
farmacológicas
Riesgo de
adicción
Tolerancia al
compuesto
Inicio de acción
lento
Antidepresivos
● Amitriptilina
● Duloxetina
Antiepilépticos
● Gabapentina
● Pregabalina

11. Potenciales fármacos
Desarrollo de nuevos fármacos
Martini y col., 2011 ;Montero y col., 2019; Quiñonez-Bastidas y col., 2020. 2
● Eficacia elevada
● Mínimos efectos
secundarios
● Capacidad analgésica
equiparable
Amidas diazabicíclicas

12. Potenciales fármacos
Importancia de la evaluación preclínica en el desarrollo de
nuevos fármacos
Objetivo:
Evaluación riesgo-beneficio
● Especie o línea celular
seleccionada.
● Dosis o concentración.
● Tiempo de exposición.
Selección del tipo de ensayo
Gámez y Más, 2007. 3

13. Antecedentes
Plataformas bioinformáticas
predictivo ADMET
(in silico)
Determinación de toxicidad
(in vivo e in vitro)
Evaluación
Toxicológica
-Aguda
-Sub aguda
-Crónica
-Especial
Evaluación
Farmacocinética
-Absorción
-Distribución
-Metabolismo
-Eliminación
Evaluación
Farmacodinámica
-Interacción
molecular
-Concentración
plasmática
Estudios
preclínicos
Relevancia de estudios toxicológicos en etapa preclínica
Marovac, 2001; Kar y Roy, 2012. 4

14. Potenciales fármacos
Evaluación toxicológica in silico
Reducen costos de investigación
Mecanismo de acción
Diseñar nuevas estructuras químicas
Ventajas
Seguridad + Calidad
Alonso y col., 2009; Saldivar-González y col., 2017. 5
Plataformas bioinformáticas
ADMETLab

15. Evaluaciones toxicológicas in vitro e in vivo
Prueba de
toxicidad
Tiempo de
exposición
Evalúa
Dosis única
24 horas
El rango de dosis mínima segura y dosis letal; toxicidad aguda (Gámez y Más,
2007).
Dosis repetidas
Días a años
Proporciona datos básicos sobre la respuesta ante el compuesto y el nivel de
efecto adverso (EFSA, 2011).
Análisis subagudo
2-4 semanas
Identifica alteraciones clínicas en el modelo animal y si es reversible cualquier
daño adverso (Denny y Stewart, 2017).
Análisis subcrónico
13 semanas
Proporciona información sobre toxicología y toxicocinética de la molécula en
modelo animal (Denny y Stewart, 2017).
Análisis crónico
6-12 meses
Es útil para observar los posibles escenarios que podría generar el tratamiento
en humanos (Denny y Stewart, 2017).
Toxicología especial Depende del
modelo utilizado
Estudio de citotoxicidad in vitro sobre líneas celulares, órganos aislados,
microorganismos o cultivos primarios (Escobar y col., 2010).
6

16. Determinación de citotoxicidad en eritrocitos humanos
Gámez y Más, 2007. 7
Deficiencia en el
transporte de oxígeno
Hemoglobina liberada
Sustancia nociva / adversa
Toxicida
d

17. Determinación de la embriotoxicidad en embriones Gallus
gallus
Díaz y col., 2020. 7
Evaluar la toxicidad de sustancia en etapas
tempranas del desarrollo embrionario.
- Rápido desarrollo embrionario
- Bajo costo
- Los resultados pueden ser utilizados por
organizaciones reguladoras para
establecer límites de seguridad
- Alternativa a ensayos en animales más
grandes

18. Potenciales fármacos
Evaluaciones toxicológicas en conjunto, análisis in silico e
in vitro
Predictivo de bioseguridad Actividad citotóxica
Evaluación de moléculas
con actividad biológica,
candidatas a fármacos
8
ADMETLab
Extractos de plantas
● Polifenoles (Veciana y col., 2014)
● Quercitinas (Swain y col., 2022)

19. Justificación Justificación
13
Actividad antialodínica Potencial fármaco
Estudios preclínicos
Evaluación de toxicidad
in vitro e in ovo
ADMETLab
PhAR-HEA

20. El PhAR-HEA presentará embriotoxicidad y citotoxicidad baja o
nula en embriones Gallus gallus y en células eritrocitarias
humanas, así como determinar los criterios predictivos de
biodisponibilidad y toxicidad mediante plataformas
bioinformáticas.
Hipótesis
14

21. Evaluar del PhAR-HEA la actividad embriotóxica en embriones Gallus gallus
y citotóxica en células eritrocitarias humanas, así como determinar los
criterios predictivos de biodisponibilidad y toxicidad mediante plataformas
bioinformáticas.
Objetivo general
15

22. 1. Realizar un análisis predictivo del perfil ADMET y criterios de Lipinski de
PhAR-HEA.
2. Determinar el efecto citotóxico del PhAR-HEA en eritrocitos humanos.
3. Determinar el efecto del PhAR-HEA sobre el desarrollo de embriones
Gallus gallus.
Objetivos específicos
15

23. Diseño experimental
15

24. Materiales y métodos
16

25. Lugar de trabajo
Laboratorio de Investigación en Farmacia,
Farmacobiología y Toxicobiología
17

26. Evaluación in silico de
PhAR-HEA
Perfil predictivo de
bioseguridad
Metodología
Algoritmos de aprendizaje automático:
Bosque aleatorio de soporte (SVM)
k vecinos más cercanos (kNN).
Accede a 5 modelos predictivos:
XLOGP3, WLOGP, MLOGP, SILICOS-
IT e iLOGP.
18

27. Diseño experimental in silico de PhAR-HEA
Perfil predictivo de bioseguridad
UPP
BHE
Criterios de
Lipinski
T ½
DR
PPAR-
gamma
FCT
ERA
Interacción
CYP450
Absorción
Gastrointestinal
PAINS
Sustrato GP-P Brenk p53
Ht
TR
TOAR
Cg
TA
Cg no
Gt
TAmes Cg Gt
SwissADME/ADMETLab ADMETLab
BHE: Barrera hematoencefálica
UPP: Unión a proteínas plasmáticas
Ht: Hepatotoxicidad
TR: Toxicidad respiratoria
T ½ : Tiempo de vida media
Cg: Carcinogenicidad
DR: Depuración renal
TAmes: Toxicidad Ames
TA: Toxicidad aguda
TOAR: Toxicidad oral aguda en ratas
PPAR-gamma: Receptor gamma activado
por proliferador de peroxisoma;
FCT: Factor de choque térmico
ERA: Elementos de respuesta antioxidante
p53: supresor tumoral p53 19

28. Diseño experimental in vitro de PhAR-HEA
Evaluación de actividad citotóxica
Exposición de eritrocitos humanos
al tratamiento
Determinación de la actividad
citotóxica
Porcentaje de la actividad citotóxica
H2O destilada
(control
positivo)
1
CH3COOH
(Vehículo al
99.8%)
Aril iminas
(0.01, 0.1, 1, 5
y 10 mg/mL)
NaCl (control
negativo al
0.9%)
20

29. Los experimentos in vitro se realizarán por triplicado.
Comparación de medias ± desviación estándar
mediante análisis de varianza de una vía y prueba post
hoc de Dunnet.
Diferencia significativa p < 0.05.
Análisis estadístico
21

30. Resultados y
discusión
22

31. ¡GRACIAS POR
SU ATENCIÓN!
37

32. 32
Vehículo Diluye
Daña eritrocitos
humanos
Metanol puro Si Si
Metanol 1/10 Si Si
Metanol 1/100 Si Si
Metanol 1/1000 Si Si
Metanol + Ácido acético glacial
50/50
precipita Si
Ácido acético glacial puro Si No
Ácido acético 1/10 No No
Vehículos analizados

33. Evaluación in vitro
Evaluar la actividad
citotóxica
Exposición de
eritrocitos humanos al
tratamiento
H₂O (Control
positivo)
Aril iminas (0.01,
0.1, 1, 5 y 10
mg/mL)
CH 3 COOH
(Vehículo, 99.8%)
NaCl (control
negativo al 0.9%)
Tratamientos
Tratamiento 450 μl
Eritrocitos humanos 50 μl
Volumen final: 500 μl
Alícuotas de 200 μl
2000 rpm 10 min
Incubar 1h
60 μl
550 nm
Absorbancias de los tratamientos
Porcentaje de citotoxicidad
100 x abs del tratamiento Aril imina/ abs control positivo
Análisis estadístico
Comparación de medias ± desviación estándar
mediante análisis de varianza de una vía y prueba
post hoc de Dunnet
Diferencia significativa p < 0.05.

34. Determinación de citotoxicidad en eritrocitos humanos
Ensayo de hemólisis
líquida
Ensayo in vitro
Medio cuantitativo
Hemoglobina liberada (540 nm)
Actividad citotóxica
% Citotoxicidad =
Abs compuesto
Abs control lisis
● 100
Rowe y Welch, 1994 34

35. 35
Criterios de Lipinski