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Actividades contra el cáncer y de inducción de apoptosis por metabolitos microbianos
 Los problemas de toxicidad sistémica y la resistencia a
los fármacos en la quimioterapia del cáncer instan al
continuo descubrimiento de nuevos agentes contra el
cáncer.
 Se han estudiado metabolitos microbianos específicos
contra el cáncer.

 Los 4 extractos más potentes que exhiciben inhibición
del crecimiento más fuerte a cada tipo de célula
cancerosa fueron seleccionados para estudiar más a
fondo.
 Cambios morfológicos celulares, tales como el
encogimiento celular, pierdida de la superficie de
contacto y la formación de ampollas se observaron en
todas las células cancerosas tratadas.
La unión del ADN con el colorante de tinción demostró
condensación nuclear y la fragmentación. División del
ADN cromosómico detectado como patrón de escalera
de ADN por electroforesis en gel incluyó la activación
celular de la actividad de la caspasa-3, un sello distintivo
de la apoptosis, se observó en todas las líneas celulares
de cáncer tratados.
En este estudio, se intentó encontrar una nueva fuente
de agente anticanceroso natural de bajo o no tóxico
producido por los microorganismos aislados a partir de
diversas fuentes y sus extractos de cultivo utilizado para
la detección de la citotoxicidad específica para líneas
celulares de cáncer.
Actividades contra el cáncer y de inducción de apoptosis por metabolitos microbianos
 Aislamiento de Microorganismos y Preparación del Extracto Crudo:
Las bacterias y levaduras se aislaron de las muestras recogidas de los
suelos contaminados de aceite, agua, materiales vegetales y muestras
clínicas.
 Líneas Celulares y Condiciones de Cultivo: Cáncer de cuello uterino
(HeLa), cáncer de hígado (HepG2) cáncer de mama (MCF-7), la leucemia
monocítica (U937) y de riñón de mono (Vero). Todas las células fueron
suplementados con 10% de suero bovino fetal y 100 U / ml de penicilinaestreptomicina y se incubaron a 37 º C y 5% de CO 2. Toda la sangre se
toma de 3 sujetos individuales sanos y las células mononucleares de
sangre periférica (PBMC).
 Ensayo de Citotoxicidad: Células de suspensión de línea celular (células
MCF-7, HepG2, HeLa, U937, células Vero y PBMC) fueron sembradas en
pocillos de una placa de 96 pocillos. El ensayo de citotoxicidad se
determinó mediante MTT (bromuro de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5difeniltetrazolio). Cada tratamiento se ensayó por triplicado. Se
realizaron tres preparaciones independientes de los extractos crudos y
ensayos de MTT. La doxorrubicina y 0,01% de etanol (vehículo de
control) se utilizaron como controles positivos y negativos,
respectivamente.
 Morfología de la Apoptosis, Observación de la Muerte Celular:
Después del tratamiento de las células con o sin extractos crudos
microbianos para 48 horas, los medios se eliminaron y se lavaron 3 veces
con PBS. Las células se observaron a continuación underphase contraste
microscopio invertido. Para el experimento de tinción del ADN, se
añadieron 50 l de 100 g / ml de Hoechst 33342, se incubó a 37 º C durante
10 min y se examina bajo microscopio invertido de fluorescencia a
longitudes de onda de emisión de 461 nm.
 Ensayo de Escalera del ADN: Las células de cáncer en 10 6 células x 3
fueron tratados con los extractos en concentraciones que indujeron a
70% de citotoxicidad y se incubaron a 37 º C, 5% de CO2 durante 24 horas.
Las células se recogieron y se lisaron con tampón de lisis durante 10 min.
También se examinaron las células normales tratados con los extractos
microbianos potentes a 500 g / ml. Las células cancerosas no tratadas y
la apoptosis de las células positivas se extrajeron y se ejecutan en
paralelo.
 Ensayo de Actividad de Caspasa 3:
 La actividad de la caspasa-3 fue ensayada mediante CaspACE ™
sistema de ensayo, colorimétrico (Biovision, EE.UU.). 3 x
10 6 células de las células cancerosas o células normales tratadas
con o sin los extractos a 37 º C, 5% de CO 2 durante 24 horas eran
precipitado mediante centrifugación y se resuspendieron con
tampón de lisis.

 El control se preparó mediante la adición de 1 l de 1 mM Z-VADFMK (inhibidor de pan-caspasa) a la muestra de células tratadas
con los extractos.
 El análisis estadístico entre el tratamiento con y sin inhibidor se
determinó mediante la prueba t de Student pareada de dos
colas, con valores de p <0,05 se consideró como diferencia
significativa.
Actividades contra el cáncer y de inducción de apoptosis por metabolitos microbianos
 Un total de 394 microorganismos de bacterias y levaduras se aislaron a
partir de varias fuentes, incluyendo los suelos contaminados con
petróleo, materiales de plantas, el agua y muestras clínicas. El medio
basal de aceite líquido que se utiliza generalmente para la producción
de biosurfactante en nuestro laboratorio se utilizó para el cultivo
microbiano.
 La actividad citotóxica de los extractos crudos microbianas se
determinó contra establecidos cuatro líneas celulares de cáncer; MCF7, HepG2, HeLa y células U937 y células Vero como un representante
de la línea normal de las células.
 Se seleccionaron los extractos de células que mostraban más alta
citotoxicidad para cada tipo de célula cancerosa. A través de esta
prueba de detección, treinta y cinco extractos representa el 8,9% del
total de muestras analizadas mostró el efecto citotóxico y la mayoría
de estas muestras se obtuvieron a partir de los cultivos bacterianos (31
de 35 aislamientos). De éstos, 20 muestras mostraron citotoxicidad
específicamente a las líneas celulares de cáncer (5% del total de
muestras).
 Los valores de CI50 de estos extractos contra líneas celulares de
cáncer estaban en el rango de 21 a 438 g / ml, mientras que el
crecimiento de la línea celular normal no canceroso (Vero) no se
inhibió significativamente por 500 g / ml de cada extracto de
células.

 Se seleccionaron los extractos más potentes que exhiben el CI
más bajo 50 (21-79 g / ml) a cada línea celular de cáncer para
estudiar más a fondo.
 Los 26s y 16s rRNA secuencias de los análisis de estas cepas
sugirieron que Ys102, B92, B151 y B100 pertenecen a Candida
tropicalis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y
Bacillus sp., Respectivamente.
 La doxorrubicina, un fármaco contra el cáncer comercial, mostró
IC 50 contra líneas celulares de cáncer en 0,66 a 2,5 g / ml y 25,7
g / ml a células normales, mientras que el tratamiento de células
normales con 1,000 g / ml de extractos microbianos mostraron
ningún efecto antiproliferativo significativa (valor de p de 0,05).
 Las células normales y cancerosas tratadas con 0,01% de etanol
(vehículo de control) no tuvieron ningún efecto citotóxico para todas
las células cancerosas y células normales probados.
Efecto Morfológico de Extractos de Células en las
Células Cancerosas
 Para la caracterización preliminar de la citotoxicidad inducida
por los extractos microbianos en las células cancerosas, se
examinaron primero los cambios en la morfología celular
inducidos por el tratamiento con un microscopio de contraste de
fase.
 En todas las líneas celulares de cáncer, el redondeo celular, la
contracción hasta celular, formación de ampollas en la
membrana y la pérdida de la adhesión celular, inducida por los
extractos microbianos. Estos cambios celulares son las
características de la inducción de la muerte celular apoptótica.
 Para caracterizar mejor la muerte celular inducida por los
extractos microbianos, morfología nuclear se determinó
mediante la tinción con el colorante de unión a ADN
Hoechst33342, en presencia y ausencia de los extractos crudos
microbianas.
 Los resultados revelaron que todos estos extractos de células
indujo la condensación nuclear y la fragmentación celular en
cuerpos apoptóticos, las distintas características de proceso
de apoptosis, en todos los tipos de células cancerosas. Por lo
tanto, se sugirió que el modo de muerte celular provocada por
extracto microbiana podría ser el proceso de la apoptosis, que
es reconocido como una nueva estrategia para la
identificación de medicamentos contra el cáncer.
 En contraste, ninguna célula anormalidad morfológica y la
fragmentación del ADN de las células normales tratados con
todos los extractos a 500 mg / ml se observó sugirieron efecto
de estos extractos no tóxico para las células normales.
 Resultado demuestra claramente que el crudo microbiana extrae la
apoptosis inducida tal como se detecta por las características de la
apoptosis, la fragmentación del ADN y la activación de caspasa-3 en
diversas células de cáncer que parecen tener en cuenta para la
actividad anti-proliferativa determinada por el ensayo MTT.
 Las respuestas citotóxicas de las células cancerosas a todos los
extractos eran dependiente de la dosis. Además, los extractos
mostraron la especificidad para tipos de células cancerosas.
 En células normales, no se observó ninguna actividad antiproliferativa incluso a 12-50 veces la concentración de los productos
microbianos se utilizaron.
 No sólo el efecto citotóxico específico para las células de cáncer que
les hizo como un buen candidato para el desarrollo como agente
antitumoral, sino también el preliminares demostraron la inducción
de apoptosis en las células cancerosas.
CONCLUSIÓN
 La utilización de los productos de fermentación
microbiana como agentes contra el cáncer es un
implemento ventaja de la producción de
compuestos bioactivos como su capacidad para
controlar las condiciones en las escalas de
laboratorio e industriales. Sin embargo, nuevas
investigaciones sobre la estructura y mecanismo
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Actividades contra el cáncer y de inducción de apoptosis por metabolitos microbianos

  • 2.  Los problemas de toxicidad sistémica y la resistencia a los fármacos en la quimioterapia del cáncer instan al continuo descubrimiento de nuevos agentes contra el cáncer.  Se han estudiado metabolitos microbianos específicos contra el cáncer.  Los 4 extractos más potentes que exhiciben inhibición del crecimiento más fuerte a cada tipo de célula cancerosa fueron seleccionados para estudiar más a fondo.  Cambios morfológicos celulares, tales como el encogimiento celular, pierdida de la superficie de contacto y la formación de ampollas se observaron en todas las células cancerosas tratadas.
  • 3. La unión del ADN con el colorante de tinción demostró condensación nuclear y la fragmentación. División del ADN cromosómico detectado como patrón de escalera de ADN por electroforesis en gel incluyó la activación celular de la actividad de la caspasa-3, un sello distintivo de la apoptosis, se observó en todas las líneas celulares de cáncer tratados. En este estudio, se intentó encontrar una nueva fuente de agente anticanceroso natural de bajo o no tóxico producido por los microorganismos aislados a partir de diversas fuentes y sus extractos de cultivo utilizado para la detección de la citotoxicidad específica para líneas celulares de cáncer.
  • 5.  Aislamiento de Microorganismos y Preparación del Extracto Crudo: Las bacterias y levaduras se aislaron de las muestras recogidas de los suelos contaminados de aceite, agua, materiales vegetales y muestras clínicas.  Líneas Celulares y Condiciones de Cultivo: Cáncer de cuello uterino (HeLa), cáncer de hígado (HepG2) cáncer de mama (MCF-7), la leucemia monocítica (U937) y de riñón de mono (Vero). Todas las células fueron suplementados con 10% de suero bovino fetal y 100 U / ml de penicilinaestreptomicina y se incubaron a 37 º C y 5% de CO 2. Toda la sangre se toma de 3 sujetos individuales sanos y las células mononucleares de sangre periférica (PBMC).  Ensayo de Citotoxicidad: Células de suspensión de línea celular (células MCF-7, HepG2, HeLa, U937, células Vero y PBMC) fueron sembradas en pocillos de una placa de 96 pocillos. El ensayo de citotoxicidad se determinó mediante MTT (bromuro de 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5difeniltetrazolio). Cada tratamiento se ensayó por triplicado. Se realizaron tres preparaciones independientes de los extractos crudos y ensayos de MTT. La doxorrubicina y 0,01% de etanol (vehículo de control) se utilizaron como controles positivos y negativos, respectivamente.
  • 6.  Morfología de la Apoptosis, Observación de la Muerte Celular: Después del tratamiento de las células con o sin extractos crudos microbianos para 48 horas, los medios se eliminaron y se lavaron 3 veces con PBS. Las células se observaron a continuación underphase contraste microscopio invertido. Para el experimento de tinción del ADN, se añadieron 50 l de 100 g / ml de Hoechst 33342, se incubó a 37 º C durante 10 min y se examina bajo microscopio invertido de fluorescencia a longitudes de onda de emisión de 461 nm.  Ensayo de Escalera del ADN: Las células de cáncer en 10 6 células x 3 fueron tratados con los extractos en concentraciones que indujeron a 70% de citotoxicidad y se incubaron a 37 º C, 5% de CO2 durante 24 horas. Las células se recogieron y se lisaron con tampón de lisis durante 10 min. También se examinaron las células normales tratados con los extractos microbianos potentes a 500 g / ml. Las células cancerosas no tratadas y la apoptosis de las células positivas se extrajeron y se ejecutan en paralelo.
  • 7.  Ensayo de Actividad de Caspasa 3:  La actividad de la caspasa-3 fue ensayada mediante CaspACE ™ sistema de ensayo, colorimétrico (Biovision, EE.UU.). 3 x 10 6 células de las células cancerosas o células normales tratadas con o sin los extractos a 37 º C, 5% de CO 2 durante 24 horas eran precipitado mediante centrifugación y se resuspendieron con tampón de lisis.  El control se preparó mediante la adición de 1 l de 1 mM Z-VADFMK (inhibidor de pan-caspasa) a la muestra de células tratadas con los extractos.  El análisis estadístico entre el tratamiento con y sin inhibidor se determinó mediante la prueba t de Student pareada de dos colas, con valores de p <0,05 se consideró como diferencia significativa.
  • 9.  Un total de 394 microorganismos de bacterias y levaduras se aislaron a partir de varias fuentes, incluyendo los suelos contaminados con petróleo, materiales de plantas, el agua y muestras clínicas. El medio basal de aceite líquido que se utiliza generalmente para la producción de biosurfactante en nuestro laboratorio se utilizó para el cultivo microbiano.  La actividad citotóxica de los extractos crudos microbianas se determinó contra establecidos cuatro líneas celulares de cáncer; MCF7, HepG2, HeLa y células U937 y células Vero como un representante de la línea normal de las células.  Se seleccionaron los extractos de células que mostraban más alta citotoxicidad para cada tipo de célula cancerosa. A través de esta prueba de detección, treinta y cinco extractos representa el 8,9% del total de muestras analizadas mostró el efecto citotóxico y la mayoría de estas muestras se obtuvieron a partir de los cultivos bacterianos (31 de 35 aislamientos). De éstos, 20 muestras mostraron citotoxicidad específicamente a las líneas celulares de cáncer (5% del total de muestras).
  • 10.  Los valores de CI50 de estos extractos contra líneas celulares de cáncer estaban en el rango de 21 a 438 g / ml, mientras que el crecimiento de la línea celular normal no canceroso (Vero) no se inhibió significativamente por 500 g / ml de cada extracto de células.  Se seleccionaron los extractos más potentes que exhiben el CI más bajo 50 (21-79 g / ml) a cada línea celular de cáncer para estudiar más a fondo.  Los 26s y 16s rRNA secuencias de los análisis de estas cepas sugirieron que Ys102, B92, B151 y B100 pertenecen a Candida tropicalis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus sp., Respectivamente.  La doxorrubicina, un fármaco contra el cáncer comercial, mostró IC 50 contra líneas celulares de cáncer en 0,66 a 2,5 g / ml y 25,7 g / ml a células normales, mientras que el tratamiento de células normales con 1,000 g / ml de extractos microbianos mostraron ningún efecto antiproliferativo significativa (valor de p de 0,05).
  • 11.  Las células normales y cancerosas tratadas con 0,01% de etanol (vehículo de control) no tuvieron ningún efecto citotóxico para todas las células cancerosas y células normales probados.
  • 12. Efecto Morfológico de Extractos de Células en las Células Cancerosas  Para la caracterización preliminar de la citotoxicidad inducida por los extractos microbianos en las células cancerosas, se examinaron primero los cambios en la morfología celular inducidos por el tratamiento con un microscopio de contraste de fase.  En todas las líneas celulares de cáncer, el redondeo celular, la contracción hasta celular, formación de ampollas en la membrana y la pérdida de la adhesión celular, inducida por los extractos microbianos. Estos cambios celulares son las características de la inducción de la muerte celular apoptótica.  Para caracterizar mejor la muerte celular inducida por los extractos microbianos, morfología nuclear se determinó mediante la tinción con el colorante de unión a ADN Hoechst33342, en presencia y ausencia de los extractos crudos microbianas.
  • 13.  Los resultados revelaron que todos estos extractos de células indujo la condensación nuclear y la fragmentación celular en cuerpos apoptóticos, las distintas características de proceso de apoptosis, en todos los tipos de células cancerosas. Por lo tanto, se sugirió que el modo de muerte celular provocada por extracto microbiana podría ser el proceso de la apoptosis, que es reconocido como una nueva estrategia para la identificación de medicamentos contra el cáncer.  En contraste, ninguna célula anormalidad morfológica y la fragmentación del ADN de las células normales tratados con todos los extractos a 500 mg / ml se observó sugirieron efecto de estos extractos no tóxico para las células normales.
  • 14.  Resultado demuestra claramente que el crudo microbiana extrae la apoptosis inducida tal como se detecta por las características de la apoptosis, la fragmentación del ADN y la activación de caspasa-3 en diversas células de cáncer que parecen tener en cuenta para la actividad anti-proliferativa determinada por el ensayo MTT.  Las respuestas citotóxicas de las células cancerosas a todos los extractos eran dependiente de la dosis. Además, los extractos mostraron la especificidad para tipos de células cancerosas.  En células normales, no se observó ninguna actividad antiproliferativa incluso a 12-50 veces la concentración de los productos microbianos se utilizaron.  No sólo el efecto citotóxico específico para las células de cáncer que les hizo como un buen candidato para el desarrollo como agente antitumoral, sino también el preliminares demostraron la inducción de apoptosis en las células cancerosas.
  • 15. CONCLUSIÓN  La utilización de los productos de fermentación microbiana como agentes contra el cáncer es un implemento ventaja de la producción de compuestos bioactivos como su capacidad para controlar las condiciones en las escalas de laboratorio e industriales. Sin embargo, nuevas investigaciones sobre la estructura y mecanismo de acción de los compuestos bioactivos necesita ser dilucidado aún más.