Analisis basico de semen

ANALISIS BASICO DE SEMEN
I.- FASE PREANALITICA:
La información que tiene que recibir el paciente debe suministrarse
por escrito. ( Normas de recogida de muestras de semen).
En el momento de recoger el frasco con la muestra en el laboratorio
este deberá rotularse con el nombre del paciente.
Proceder a dar un número de identificación de la muestra, poniendo
dicho código en el bote y volante.
Dar el volante a las administrativas para que proceda a su registro.
Deberá anotarse días de abstinencia, fecha y hora de recogida, si la
muestra es completa, toma de fármacos y fiebre.
Es fundamental anotar el tiempo que transcurre entre la recogida y el
inicio del análisis de semen.
Estos datos se registrarán en la hoja de trabajo.
2.- EXAMEN MACROSCOPICO:
Licuefacción:
El manejo de la muestra de semen desde su recepción en el
laboratorio debe ser como sigue. Cuando recibimos una muestra recién
eyaculada debemos dejarla incubar a 37º C durante 20-25 min ( estufa de
microbiología). Durante este tiempo lo ideal es que esté en rotación
continua, sino es posible debemos agitarla de vez en cuando durante unos
20-30 segundos. Transcurrido este tiempo determinamos si esta licuada o
no. De estarlo procederemos al análisis de la muestra y de no estarlo la
dejaremos incubar hasta una hora. Si transcurrido este tiempo no esta
licuada, hay presencia de grumos, coágulos o hebras, lo anotaremos como
licuefacción anormal.
Las muestras de semen deben ser agitadas suavemente para que se
homogenicen pero no debe utilizarse el vortex.
Si una muestra es recogida fuera del laboratorio, antes de comenzar
con su análisis debe ser atemperada durante 5-10 min.
Ante muestras con déficit de licuefacción o elevada viscosidad se
diluye 1:1 con tampón fosfato (PBS) y posterior homogeneización con
pipeta Pasteur. En éste caso el volumen debe ser determinado previamente
y referir los resultados de concentración al volumen original.
1

Aspecto:
Debe inspeccionarse visualmente después de la licuefacción pero
nunca después de trnascurridos 60 minutos desde la eyaculación.
Su color suele ser nacarado o gris-opalescente pudiendo parecer
más claro en caso de baja concentración de espermatozoides. Si presenta
color rojizo o marrón nos indicará la presencia de hematíes, un color
amarillento suele aparecer en pacientes con ictericia, alta ingestión de
vitamina B” (riboflavina) o elevados niveles de flavoproteínas oxidadas de
vesículas seminales que suelen reflejar una elevada abstinencia.
Volumen:
Este se medirá utilizando un tubo graduado.
Se considera normal un volumen superior a 2 mL. Cuando existe un
orgasmo y no eyaculación tras una masturbación nos encontramos ante una
aspermia (ausencia de eyaculado). A la eyaculación de menos de 2 mL se
puede denominar hipospermia u oligospermia. Estas dos situaciones y en
especial la aspermia, deben hacernos sospechar una eyaculación retrógrada.
Viscosidad:
Para evaluar la viscosidad cargaremos una pipeta Pasteur con semen
y dejaremos caer su contenido, si este no cae a gotas o formando hilos de
menos de 2cm, consideraremos una viscosidad aumentada. Los resultados
se anotan como normal o anormal.
El tratamiento de muestras muy viscosas será el mismo que el usado
para la muestras con licuefacción anormal.
Ph:
Lo mediremos utilizando tiras reactivas de rango 6,5 a 10,0. Tras
depositar una gota en dicha tira esperamos 30 segundos y comparamos el
color de la tira con la escala.
Dado que las secreciones de vesículas seminales son alcalinas,
cuando éstas no se producen (infección o agenesias) el ph del semen será
ácido. Cuando el ph sea menor de 7.2 en una muestra azoospérmica puede
indicarnos una obstrucción a nivel de conductos eyaculadores o una
agenesia bilateral de deferentes. Un ph menor de 7.2 pero con
espermatozoides puede sugerir infección en tracto genital.
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III.- MOVILIDAD ESPERMÁTICA:
Los diferentes tipos de movilidad espermática son:
Tipo a: movilidad rápida y progresiva, mayor o igual 25
micrometros/sg a 37º C, o mayor o igual 20 micrómetros/seg a 20 ºC
(equivalente el primero a 5 veces la cabeza en 1 segundo o a la mitad
de la longitud de la cola).
Tipo b: movilidad progresiva lenta o perezosa.
Tipo c: movilidad no progresiva, < 5 micrométros/seg (equivalente a
1 vez la cabeza por segundo).
Tipo d: inmóvil.
Un eyaculado humano deberá tener a los 60 minutos de la eyaculación:
• Mayor o igual 50% de los espermatozoides con movilidad
tipo a + b, o bién
• Mayor o igual 25% con movilidad tipo a.
Así un eyaculado que posea valores inferiores a los mostrados será
clasificado como: Astenozoospermia.
Material necesario:
- Portaobjetos y cubreobjetos de 22x22mm que deben
estar atemperados previo manejo a 37º C.
- Microscopio con contraste de fases, y objetivos de 10,
20 y 40x.
- Pipeta automática de 10 microlitros.
El laboratorio debe permanecer a temperatura estable, de 20-24º C.
- Sobre un porta atemperado a 37º C se dispensan 10
microlitros de la muestra bien mezclada. Sobre esta se
pone un cubre de 22 x 22 mm, sin apretar y sin dejar
burbujas.
- Se deja estabilizar, y si a los 60 segundos no se
estabiliza, se debe preparar otra muestra.
- Se realiza una primera observación a 100 aumentos
para asegurarnos de una distribución lo más
homogénea posible, teniendo en cuenta que debemos
evitar los bordes de la preparación. Si no fuera
homogénea se debe preparar otra muestra,
asegurándonos que el eyaculado está completamente
licuado. Si no se pudiera licuar, se debe anotar que la
valoración de la movilidad se ha realizado con dicho
inconveniente, que podría dar lugar a una falsa
astenozoospermia.
- A continuación pasamos a 400x , y comenzamos
nuestra valoración de la movilidad.
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- Se deben contar en una zona determinada primero los
espermatozoides tipo a y tipo b que existen, para
contar a continuación los de tipo c y tipo d en esa
misma zona.
- Se contarán 200 espermatozoides en un porta, con la
ayuda de un contador de laboratorio. Se debe realizar
en sucesivos campos siempre alejados de los bordes
del porta. Seguidamente se repetirá el contaje en otro
porta y seguidamente se valora si la diferencia entre los
dos contajes están dentro del 95% de intervalos de
confianza de error debido al azar. Para esto calculamos
la diferencia y la media de los porcentajes del tipo de
movilidad con más presencia en ambos portaobjetos. A
continuación llevamos el valor de la media de los
porcentajes a la curva ofrecida por la OMS (Figura 1).
En dicha curva encontramos definidas las diferencias
entre los porcentajes admisibles por el azar para cada
valor de la media, si nuestra diferencia real es mayor o
igual a la diferencia entre los dos porcentajes se debe
repetir la estimación de la movilidad. Si a pesar de
todo sigue ofreciendo valores inadmisibles, se debe
repasar el procesado de la muestra para descartar
errores.
- En el momento de la valoración podemos encontrar
varios inconvenientes, debiendo anotar la existencia de
éstos en el seminograma, y actuando de la siguiente
manera:
o En la valoración de la movilidad las colas sueltas no
se cuentan.
o Presencia de agregaciones o aglutinaciones. La
presencia de éstas puede interferir en la valoración,
ya que podríamos interpretar como tipo c a un
elevado número de espermatozoides tipo a o b que se
encuentran capturados. De esta manera, si el
porcentaje de espermatozoides atrapados es mayor de
10%, la valoración de la movilidad se realizará
exclusivamente con espermatozoides libres,
debiéndose anotar que espermatozoides se
encuentran atrapados.
o Si la muestra está muy concentrada, puede
interferirse la evaluación, tanto por la dificultad que
conlleva el seguimiento de los espermatozoides,
como por el entorpecimiento entre estos. Para
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solventar este inconveniente contaremos en áreas
mucho más reducidas.
o Si la muestra posee una viscosidad elevada pueden
producirse “falsas astenozoospermias”, además de
valoraciones muy dispares; si tal eventualidad se
solventa mediante la dilución con medio, en el
seminograma se deberá anotar que la valoración se
ha realizado con la muestra diluida.
o Elevado número de células redondas en el eyaculado.
En este caso se puede observar que espermatozoides
de tipo a, al chocar con células redondas, pueden
permanecer un tiempo parados, interpretándose
erróneamente como espermatozoides de tipo d o tipo
c. Solventaremos este inconveniente contando sólo
en áreas donde la densidad de células redondas se
menor y, si esto no es posible, se deberán valorar con
más exactitud los espermatozoides tipo d.
IV: AGLUTINACIONES Y AGREGACIONES:
La visualización de la aglutinación se define por la
visualización de espermatozoides móviles unidos por las cabezas,
colas, o cabeza-cola.
Agregación se define por la unión de espermatozoides a
espermatozoides inmóviles ( en general muertos), otras células,
restos, fibra mucosa, etc.
La valoración se realiza en el portaobjetos preparado para el
contaje de la movilidad, observándose como mínimo 10 campos
diferentes.
La cantidad de aglutinaciones observadas en el examen se
anotan en el informe del seminograma con una escala
semicuantitativa, desde la no presencia de aglutinaciones (-), hasta la
práctica totalidad de los espermatozoides aglutinados(+++).
Teniendo en cuenta que la presencia de un pequeño número de
aglutinaciones o pequeñas agregaciones puede ser habitual en
seminogramas normales. Según autores, no se considera patológica si
no se observa en más del 10% de los espermatozoides. La presencia
de aglutinaciones sugiere, aunque de forma no definitiva, posibles
alteraciones causadas por la presencia de Anticuerpos. También se
presentan con más frecuencia en eyaculados hiperconcentrados, o
incluso en infecciones de vía seminal.
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V.- MORFOLOGÍA ESPERMATICA
Preparación de la extensión:
Deben realizarse dos extensiones del semen fresco.
Los portas deben limpiarse en alcohol de 70% durante 15
minutos para asegurarnos que están perfectamente limpios y secarse
antes de aplicar el semen.
Si la concentración de espermatozoides es superior a 20
millones/ml, se aplican 5 microlitros de semen, si es inferior, debe
aplicarse de 10 a 20 microlitros. En semenes con oligozospermia
severa se debe concentrar la muestra.
La técnica que se usa para extender la muestra es la de
arrastrar la gota con el canto de otro porta pero teniendo en cuidado
de no dejar la extensión demasiado espesa.
Si tenemos un semen muy espeso o con baja concentración
de espermatozoides, proceder: una alícuota de 0.2 a 0.5 ml se
diluyen con 10 ml de suero fisiológico. El tubo se centrífuga a 800g
durante 10 minutos, se tira el sobrenadante y el botón se resuspende
en el suero salino remanente. Se toma de 5 a 10 microlitros y se hace
la extensión.
Las dejamos secar al aire .
Tinción : utilizamos el Panóptico rápido ( Dic-Quick) que consta de
tres pasos:
Colorante 1: Introducir el porta manteniéndolo 15 seg. Sacarlo e
Colorante 2: Introducirlo manteniéndolo durante 15 seg. Lavarlo en
una cubeta con agua
Colorante 3: Introducirlo manteniéndolo durante 15 seg. Lavarlo en
una cubeta con agua y poner a secar al aire.
Estudio morfológico:
Deben evaluarse 200 espermatozoides. Se evaluarán dos
extensiones y se valorará si la diferencia entre los dos contajes está
dentro del 95% de intervalo de confianza de error debido al azar,
procediendo del mismo modo que se describió para movilidad
espermática. Llevamos el valor de la media de los porcentajes a la
curva ofrecida por la OMS. En dicha curva encontramos definidas
las diferencias entre los porcentajes admisibles por el azar para cada
valor de la media de dichos porcentajes, si nuestra diferencia real es
mayor o igual a la diferencia entre los dos porcentajes según la curva
se debe repetir la estimación de la morfología. Si a pesar de todo
sigue ofreciendo valores inadmisibles, se debe repasar el procesado
de la muestra para descartar errores.
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Criterios de normalidad:
Para que un espermatozoide sea considerado normal deben
serlo la cabeza, cuello, pieza intermedia y cola.
1.-Cabeza normal: forma oval, 4.0-5.0 micras de longitud, 2.5-3.5
micras de ancho, la relación longitud/ anchura debe ser 1.5-1.75, la
región acrosómica debe estar bien definida y suponer el 40-70% del
área de la cabeza.
2.- Pieza intermedia normal: debe ser delgada, con un ancho
inferior a 1 micra, una longitud de aproximadamente una vez y
media la longitud de la cabeza, unida axialmente a la cabeza y puede
tener restos citoplásmicos siempre que el área que ocupen sea
inferior a la mitad del área de la cabeza.
3.- Cola normal: debe ser recta, uniforme, de aproximadamente 45
micras de longitud.
En la clasificación no se incluyen las cabezas solas ni las colas solas,
pero si se observan, deben ser anotadas y comentadas en el informe.
Otros elementos celulares: Pueden encontrarse y deben ser
identificadas otras células tales como leucocitos, células de
espermatogénesis, células de tránsito o células de origen urinario.
Tabla 3 se pueden ver los criterios para definir a un espermatozoide
como morfológicamente normal y dibujos esquemáticos de
alteraciones de espermatozoides.
VI. VITALIDAD ESPERMÁTICA
Las técnicas de determinación de Vitalidad Espermática nos
permiten evaluar el porcentaje de espermatozoides vivos. Para ello se
usa una medida indirecta, el estudio del estado de la membrana
plasmática. Las técnicas de Vitalidad Espermática medirán, por lo
tanto el estado de la membrana plasmática, ya que un
espermatozoide vivo debe tener la membrana plasmática intacta y
otro muerto la debe tener dañada. Para el estudio del estado de la
membrana plasmática vamos a utilizar la técnica de la tinción con
eosina.
La membrana plasmática intacta es impermeable a los
colorantes vitales ( como Eosina), pero es atravesada fácilmente
cuando se encuentra alterada y desorganizada. Estas sustancias se
unirán específicamente al DNA celular y la observación
microscópica nos permitirá distinguir entre espermatozoides teñidos
y no teñidos. Los primeros serían no viables y por tanto con
membrana estructuralmente dañada y los segundos viables, con
membrana estructuralmente intacta. Según OMS-99 el estudio de
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vitalidad debería de ser desarrollado cuando la movilidad
espermática sea menor del 50%.
Tinción con Eosina-Nigrosina:
Se mezcla una gota de semen con dos gotas de Eosina Y ( 10
g/l en agua destilada). Después de 30 seg. Se añaden 3 gotas de
Nigrosina ( 100g/l en agua destilada). Después de mezclar se hace
una extensión y se observa bajo aceite de inmersión (1000x).
Cuando se utilizan colorantes vitales se debe informar el
porcentaje de espermatozoides no teñidos, espermatozoides vivos.
El valor de normalidad es mayor del 75% de espermatozoides
no teñidos.
Hay que evaluar al menos 200 espermatozoides en muestras
duplicadas. Los contajes deben ser cotejados mediante su media y
diferencia y comparados con los esperados en la gráfica 1.
La vitalidad puede servir además de chequeo de la movilidad
porque el número de espermatozoides teñidos no debería exceder el
número de espermatozoides inmóviles. La presencia de
espermatozoides vivos e inmóviles, es decir cuando el porcentaje de
espermatozoides teñidos es inferior al de espermatozoides inmóviles,
podría indicar alteraciones estructurales en el flagelo, como ocurre en
el “Síndrome de Kartagener”. Por otra parte la presencia de
espermatozoides muertos en un porcentaje del 100% puede indicar
algún problema en la obtención y/o transporte de la muestra,
posiblemente por contaminación con sustancias citotóxicas
( detergentes, espermicidas, etc).
VII.- CONCENTRACIÓN DE ESPERMATOZOIDES Y
OTRAS CÉLULAS
El semen es una suspensión de espermatozoides en liquido
seminal. Además del componente testicular un eyaculado se
compone de secreciones procedentes de próstata, de vesícula seminal
y glándulas uretrales y bulbouretrales. La medida de la concentración
espermática indicará el estado de la espermatogenesis del individuo.
La OMS considera los valores de normalidad de concentración por
encima de 20 millones/ml, cifras inferiores se denominan
oligozoospermia.
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Procedimiento:
Situar un volumen de muestra de 10 microlitos entre un porta y
un cubre de dimensiones 22x22.
Estabilizar la muestra durante un minuto a 37ºC y observar a
400x.
Según el número de espermatozoides por campo que se
observen habrá que realizar un determinado grado de dilución con el
diluyente de Weigman ( solución de 50 g de bicarbonato sódico y 10
ml de formalina al 35% en un litro de agua) para la medida definitiva
de la concentración espermática.
Si se observan :
• < 15 espermatozoides por campo se realiza una dilución 1:5.
• Entre 15-40 espermatozoides una dilución 1:10
• Entre 40-200 espermatozoides por campo una dilución 1:20
• >200 espermatozoides por campo una dilución 1:50.
• Cuando el número de espermatozoides por campo es < 1-2
habrá que centrifugar la muestra a 300 g durante 15 minutos.
En este caso es suficiente con fines clínicos informar de una
concentración espermática de < 2 millones/ml, anotando si
se observan espermatozoides móviles o no.
• Todas las muestras en las cuales no son detectadas
espermatozoides deben ser centrifugadas para detectar
espermatozoides en el sedimento. Centrifugación a más de
3000g durante 15 minutos es recomendado. Solamente cuando
no se observan espermatozoides en el precipitado
resuspendido es cuando podemos clasificar a una muestra
como azoospermica.
Transferir aproximadamente 10 microlitos a la cámara de
Neubauer Improved.
Dejar durante 5 minutos en cámara húmeda para evitar que se
seque.
Una vez sedimentados los espermatozoides se cuentan al
microscopio, solo se cuentan espermatozoides enteros.
El procedimiento para contar los espermatozoides en la cámara
es: la cámara posee 25 cuadrados grandes y cada cuadrado grande
posee 16 cuadrados pequeños.
• Si la muestra posee < 10 espermatozoides en cuadrado
grande deben ser contados los 25 cuadrados.
• Si posee entre 10-40 espermatozoides en cuadrado grande
se deben contar 10 cuadrados.
9

• Si posee > 40 espermatozoides en un cuadrado grande se
debe contar 5 cuadrados.
Si es espermatozoide cae en una línea dividiendo 2 cuadros
adyacentes. Debe ser contado solo si está en la línea superior o el
lado izquierdo del cuadro asignado.
Se deben realizar contajes duplicados de unos 200
espermatozoides para obtener un bajo error de contaje. Como
chequeo se calcula la suma y diferencia de los contajes y se
comparan con la gráfica 2.
Si la diferencia es mayor que la dada en la curva, se repite la
dilución y se vuelve a realizar el duplicado.
Es necesario agitar bien la muestra antes de realizar la dilución.
Si la muestra es muy viscosa, pasarla la muestra por aguja fina
mediante jeringa.
El eyaculado contiene además otras células, llamadas
genéricamente células redondas, que incluyen células epiteliales,
células prostáticas, células de la espermatogénesis, y leucocitos. Un
eyaculado normal no debería tener más de 5 millones/ml de
células redondas.
Un excesivo número de leucocitos puede ser indicativo de
infecciones y pobre calidad espermática. El Número no debería
exceder de 1 millón por mililitro.
Un número elevado de células inmaduras en el eyaculado es
indicativo de desordenes de la espermatogénesis, tales como
hipoespermatogénesis, varicocele y alteración de células de Sertoli.
La concentración de estas células se puede medir indirectamente a
partir de la siguiente fórmula:
C=(NxS)/100
N= número de células
S= Concentración espermática.
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Tabla: diluciones y factores de conversión para una Cámara de
Neubauer.
Factor conversión
Nº cg contados
Esp.x400 Dilución
25 10 5
______________________________ ________________________
<15 1:5 20 8 4
15-40 1:10 10 4 2
40-200 1:20 5 2 1
>200 1:50 2 0.8 0.4
Recomendaciones de cuadros grandes (cg) que hay que contar en
función de los espermatozoides que hay en un cuadro grande.
Nº esp cg Nº cuadros a contar
< 10 25
10.40 10
>40 5
VIII.- DETECCIÓN DE ANTICUERPOS ANTIESPERMATOZOIDE
Antecedente previos de patología andrológica parecen relacionarse
con la presencia de estos anticuerpos, derivados de la posible ruptura de la
barrera hematotesticular y toma de contacto sistema inmune – células
germinales. Por tanto, ante criptorquidias, varicoceles, infecciones
recidivantes del tracto genitourinario, intervenciones quirúrgicas, etc, son
circunstancias a considerar en la exploración de este factor.
Vamos a utilizar el MAR Test o reacción mixta de la antiglobulina.
Nos va a permitir identificar la presencia de AEE, caracterizar los isotipos
presente y cuantificar la respuesta inmunológica existente, expresada como
porcentaje de espermetazoides móviles que tiene adheridos anticuerpos en
sus superficie.
Se considera que un factor inmunológico tiene importancia clínica
en aquellos casos en que se observan más del 50% de espermatozoides
móviles con anticuerpos adheridos a su superficie.
Debido a que dicha técnica es de detección directa de los anticuerpos
que se encuentran adheridos a los espermatozoides móviles, de forma que
en caso de elevada astenozoospermiay/o necrozoospermia, no podremos
explorar la presencia de factor masculino inmunológico concomitante
empleando estas técnicas.
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Principio del test:
La presencia de anticuerpos antiesperma reacciona con antigenos en
los espermatozoides es considerado como típico y especifico de infertilidad
inmunológica. Los anticuerpos antiesperma son de dos clases: IgA e IgG.
Los anticuerpos IgA son mçás importantes clínicamente que los IgG. Sin
embargo los anticuerpos IgA raramente ocurren sin los IgG, por lo tanto,
testando los anticuerpos IgG son suficiente como método de escrining.
El Mar Test directo se realiza mezclando semen fresco con partículas
de latex a las que se las ha unido Ig G. Después se4 mezcla con antisuero
humano IgG. La formación de aglutinaciones entres las partículas y
espermatozoides móviles indica la presencia de Ig G anticuerpos en los
espermatozoides.
Procedimiento:
1.- Poner los reactivos y la muestra a temperatura ambiente.
2.- En un porta poner:
• 10 microlitros de semen fresco sin tratar.
• 10 microlitros de partículas de latex de SpermMar.
• 10 microlitros de antisuero SpermMar.
• Mezclar la muestra y el reactivo de Látex 5 veces con la
punta de la pipeta.
• También mezclar el antisuero con la mezcla de la muestra y
el reactivo de látex.
• Poner un cubre de 24 x40 mm y observar al microscopio a
400X o 600x con luz intensa o en contraste de fases.
• Leer el resultado después de 2-3 minutos. Observar las
particulas de latex unidas a los espermatozoides móviles.
Contar 100 espermatozoides para determinar el porcentaje
de esperma reactivo. Si no se observan bolas unidas a los
espermatozoide, leer otra vez a los 10 minutos.Guardar la
preparación en una cámara húmeda.
• Si existen anticuerpos contra los espermatozoides, las
particulas de látex se adherirán a los espermatozoides
móviles. Al principio se ven los espermatozoides móviles
que se mueven de un sitio para otro con unas pocas y hasta
con muchas partículas adheridas, pero eventualmente estos
aglutinados se tornan tan masivos que los espermatozoides
sólo pueden moverse en su sitio si están adheridos a las
partículas.
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CONTROL DE CALIDAD INTERNO
La distribución aleatorioa de los espermatozoides, incluso cuándo la
muestra está muy bien homogenizada, es en gran parte responsable de la
falta de precisión en los resultados del análisis de semen.
La medición de concentración, movilidad y morfología se realiza con
un limitado número de espermatozoides que suponemos representativos de
la muestra, lo cual provoca un error aleatorio que se denomina “ error de
contaje”. La magnitud de éste error está inversamente relacionada con la
raíz cuadrada del número de espermatozoides contados. Teniendo en
cuenta que el error de contaje puede ser reducido examinando un mayor
número de espermatozoides, debe también evaluarse la posible pérdida de
exactitud debida al cansancio del técnico que realiza la medición, por lo
que es necesario establecer un equilibrio entre ambos factores.
El control de calidad llevado a cabo:
a) A nivel intra- individual: todas la mediciones que realiza un observador
se hacen por duplicado y, si las diferencias superan el error de contaje, se
rechace la medición comenzándose de nuevo. La medición duplicada se
realiza desde el comienzo del procedimiento, ya que si lo limitamos a la
lectura al microscopio no podremos detectar errores de preparación.
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