1. Método de tinción policromático
que utiliza una coloración nuclear y
coloraciones citoplasmáticas
competitivas
TINCIÓN PAPANICOLAOU
2. Tinción
nuclear
Buena definición del detalle nuclear
evidenciando el patrón cromatínico
Diferentes grados de
diferenciación celular y
actividad metabólica
HEMATOXILINA
Tinción
citoplasmática
policromática
ORANGE G
EOSINA
LIGHT GREEN
• Tinción contrastante
• Tranparencia
citoplasmática
3. FIJACIÓN
Detener el metabolismo celular conservando su estructura e
impidiendo la degradación celular .
El déficit por fijación produce alteración de la tinción.
Las células se tornan eosinófilas (no hay patrón de tinción diferente)
y la coloración con hematoxilina es subóptima.
Para una tinción Papanicolaou ÓPTIMA es necesaria una CORRECTA Y
RÁPIDA FIJACIÓN.
4. Cuál es el fijador satisfactorio ?
Debe penetrar las células rápidamente para que la
morfología celular sea mantenida.
El encogimiento celular debe ser mínimo y uniforme de
forma que no ocurran distorsiones morfológicas.
Debe favorecer la permeabilidad de las tinciones a través
de las barreras celulares y ser apropiado para los métodos
de tinción usados.
Debe proteger la adhesión celular a la lámina
Debe ser bactericida, no tóxico y permanente
El fijado debe ser inmediato. No debe dejarse secar antes
de ser fijado
REHIDRATAR
Sin fijación previa
Colocación durante 3 a 5 minutos
en solución con 50% de agua destilada y
50% de Glicerina
5. Fijadores adecuados para
tinción Papanicolaou
Alcohol 96%: inmersión completa de la muestra,
al menos 10 minutos.
Spray fijador (contiene una base de alcohol y
cera-carbón): rociar el preparado a una distancia
no menor de 15 a 20 cm.
6. Coloraciones
HEMATOXILINA
El componente activo es la HEMATEINA, combinada con metales (como el aluminio),
forma un compuesto con carga neta positiva (Grupos básicos)
unión Fuerzas electrostáticas
compuesto con carga neta negativa, Grupos aniónicos de sustancias Ácidas
ADN
OTRAS SUSTANCIAS
CITOPLASMÁTICAS
ÁCIDAS
Esta en SOLUCIÓN ACUOSA,
por lo que el extendido debe HIDRATARSE previamente al baño de inmersión
METODO PROGRESIVO: se tiñe el núcleo con la intensidad del color deseado
MÉTODO REGRESIVO: se sobre tiñe con una hematoxilina no acidificada y luego se remueve
el exceso de tinción con ácido clorhídrico
ARN
7.
8. ORANGE G
Tinción proteica ácida( carga neta negativa)
Monocromática( de tinte naranja brillante/ amarrillo anaranjado)
Penetra rápidamente el citoplasma,
compite con la eosina y en menor medida con el Light Green
Es una SOLUCION ALCOHÓLICA,
por lo que el preparado debe deshidratarse previamente
Molécula pequeña( penetra fácilmente estructuras densas)
9.
10. EA
SOLUCIÓN ALCOHÓLICA,
por lo que deben DESHIDRATARSE los extendidos previamente
Esta constituída por 2 tinciones:
1) EOSINA: es un ÁCIDO PURO, que se une principalmente a proteínas citoplasmáticas.
Es una molécula más grande que el orange G
Dímero: naranjaMonómero: rosado a rojizo
Células superficiales GR y proteínas del nucleolo
2)LIGHT GREEN: es un colorante ÁCIDO que posee también grupos básicos que se une
principalmente a proteínas citoplasmáticas.
Es una molécula más grande que la eosina.
El agregado de ácido fosfotúngstico (PTA) le confiere un efecto mordiente
Permitiendo la actividad del colorante en la solución EA a un pH mas alto.
Puede actuar como contrastante al competir en su unión a proteínas con la eosina.
11.
12.
13. • Alcohol etílico 50% por 20 minutos
• Agua destilada o corriente
• Hematoxilina 1 min
• Virar en agua destilada o corriente
• Alcohol etílico 96º
• Alcohol etílico 96º
• Orange G (OG6) 3 min
• Alcohol etílico 96º
• Alcohol etílico 96º
• EA 3 min
• Alcohol etílico 96%
• Alcohol etílico 100%
• Alcohol /xilol (50% de alcohol absoluto y 50% de xilol puro)
• Xilol puro 5 min
• Montaje
Protocolo
Remoción de la cera del
Spray fijador
Respetar el tiempo para
evitar hipercromasia
Aclaramiento,
otorgan la transparencia citoplasmática
14. Montaje
Unión del portaobjeto con el cubreobjeto
Medio de Montaje
PERFECTA VISCOSIDAD
SECARSE RÁPIDO
PERMANCER TRANSPARENTE
QUIMICAMENTE NEUTRO E INACTIVO
IGUAL INDICE DE REFRACCIÓN DEL VIDRIO
BALSAMO DE CANADA
RESINAS SINTÉTICAS
Malinol
Histoclad
Entallan
Permount
Continental Pharma
Distirene 100 gr, dibutilftalata
25 gr y xilol o tolueno 350 ml
Material: preferentemente vidrio
Espesor entre 0,13 y 0,17mm
24x 50 o 60mm
15. Porta y cubreobjeto deben tener superficie
plana y paralelas….
Y debido a que el medio de montaje no se
mezcla con el alcohol, los preparados deben ser
primeros inmersos en xilol y….
no dejar secar antes de colocar el balsamo con
el cubreobjeto
16.
17. Evaluación de resultados
La tinción es evaluada con 4 OBSERVACIONES:
1. INTENSIDAD DEL TINTE AZUL DEL CITOPLASMA DE LAS CÉLULAS INTERMEDIAS
2. INTENSIDAD DEL COLOR VERDE EN CÉLULAS INTERMEDIAS
3. INTENSIDAD DEL COLOR ROJO EN CÉLULAS SUPERFICIALES
4. COLOR DE LAS CÉLULAS PARAKERATÓSICAS
0 sin tinción citoplasmática
4 núcleo=citoplasma
CONTRASTE NUCLEO-CITOPLASMA
0 sin tinción
4 intensa
0 sin tinción
1 Rojo (monómero Eo)
2 Rojo anaranjado( dímero Eo)
3 Naranja (Eo y orange G)
4 Amarillo (orange G)
CONTRASTE OPTIMO: VALOR BAJO DEL 1 y VALOR ES ALTO DEL 2 Y 3
DIFERENCIACIÓN ENTRE
SUPERFICIALES E
INTERMEDIAS
18. Variación de los resultados de tinción dentro de la muestra
FONDO: fibrina, necrosis y sangre tienen tendencia a teñirse con eosina,
entonces las células se tornan rojizas en lugar de verdosas
AGRUPAMIENTO CELULAR GRUESO Y POBREMENTE EXTENDIDO: células central
rojo –anaranjadas y las periféricas, verdosas. Pobre detalle cromatínico.
FIJACIÓN: los sectores desprovisto de moco tienden a secarse más rápido, son
afines a la eosina. Las células con citoplasma frágil, tienden a amontonarse y
secarse y se pierde el detalle nuclear.
SECTORES BIEN FIJADOS
NO AGRUPADOS
CON FONDO LIMPIO O ESCASO
20. • Filtrar el alcohol y el xilol si se observan sobrantes
• El alcohol absoluto debe mantenerse al 100% y el xilol
puro
• Control del PH de manera rigurosa( medir al comienzo
y final de la semana de trabajo)
• Filtrar la hematoxilina diariamente
• Cambiar cada 100 extendidos los colorantes Orange G
y EA
• Remover una vez a la semana todas las soluciones
• Lavar con agua destilada las cubetas de tinción, dejar
secar al aire
• Excurrir los extendidos antes de pasar a la siguiente
cubeta
• Cambiar el agua diariamente
Recomendaciones
Hematoxilina PH < 4
EA PH 5
OG PH <5 >6
21. Bibliografía
• Boon Mathilde E., Suurmeijer Albert J. H.: The
Pap smear, 1º edición, Leiden, Holanda.
Columb Press Leyden, 1991. p.265 – 275.
