Analisis microscopico del semen

3
1999
97-99-
2000
Génesis del nuevo Manual
Manual de Análisis Básico
2002 NAFA - ESHRE
2010

4´ EDICION OMS 5 ´EDICION OMS
PARAMETRO VALOR DE REFERENCIA VALOR DE REFERENCIA
Volumen 2.0 mL o más 1.5 mL o más
pH 7.2 o más 7.2 o más
Concentración
20 millones/mL. o más 15 millones/mL. o más
Espermática
hmanuelrh@yahoo.com.mx 4
Número Total de
Espermatozoides
40 millones/Eyaculado o más 39 millones/Eyaculado o más
Movilidad 50% o más con movilidad A y B
25% o más con movilidad A
MP= 32%
MT (MP+MNP)= 40%
Morfología Consenso en Proceso (>14%) >4%
Viabilidad 50% de vivos o más 58% vivos o más
Leucocitos Menos de 1 millón/mL. Menos de 1 millón/mL.
Licuefacción 15 min-60 min. 15 min-60 min.
Viscosidad >2cm >2cm
Aglutinación (grados
esperma)
>10% 1:<10, 2:10-50, 3:>50, 4:aglu totales

5
ANALISIS DEL SEMEN
VISCOSIDAD ASPECTO VOLUMEN pH
EXAMEN
MACROSCOPICO
VITALIDAD
EXAMEN
MICROSCOPICO
MOTILIDAD
CONCENTRACION
AGLUTINACION Y
AGREGACION
OTRAS
CELULAS
MORFOLOGIA
ESPERMATICA
ANTICUERPOS
ANTI-ESPERMATOZOIDES
LICUEFACCION
hmanuelrh@yahoo.com.mx

El semen es viscoso
Área 1 elevada concentración de espermatozoides
espermatozoides rápidos
buena morfología
Área 2 baja concentración de
espermatozoides
espermatozoides lentos -mala morfología
• Mezclar bien la muestra
• Coger dos alicuotas
• Contar 2×200 espermatozoides (cuando sea posible)
• Comparar por duplicado
Distribución de Poisson (número de espermatozoides/leucocitos)
Distribución Binomial (% motilidad, % morfología, % vitalidad)

“La movilidad progresiva esta relacionada con las tasas de embarazo
(Jounnet et al., 1988., Zinaman et al., 2000; Larsen)
Difícil separar movilidad A y B con exactitud (Cooper and yeung, 2006)
A: Movilidad Progresiva Rápida
B: Movilidad Progresiva Lenta
C: Movilidad No progresiva
D. Inmóviles.
Movilidad Progresiva (MP)
Movilidad No Progresiva (NP)
Inmóviles (IM)
“licuada la muestra <30
minutos”.
MP= 32%
MT (MP+MNP)= 40%

EJEMPLO
Conteo total de espermatozoides= 200 por duplicado
CONTEO 1 CONTEO 2
PR= 37% PR= 28%
NP= 3% NP= 6%
IM= 60% IM= 66% = promedio 63% ; diferencia 6%
Los resultados son aceptados y se reportan los promedios:
PR= 33%, NP= 4%, IM= 63%
PORCENTAJE DIFERENCIA
ACEPTABLE
PORCENTAJE DIFERENCIA
ACEPTABLE
0 1 66-76 9
1 2 77-83 8
2 3 84-88 7
3-4 4 89-92 6
5-7 5 93-95 5
8-11 6 96-97 4
12-16 7 98 3
17-23 8 99 2
24-34 9 100 1
35-65 10

(Rose et al., 1976)
Adherencia entre los espermatozoides móviles.
<10%

10
Agregaciones: adherencia de espermatozoides (inmóviles o móviles) a células no
espermáticas o detritos
Aglutinaciones: espermatozoides móviles adheridos a otros espermatozoides móviles

Fundamental en muestras con < 40 % de espermatozoides móviles.
Se realiza inmediatamente licuada la muestra (de preferencia a los 30 minutos).
-Espermatozoides vitales pero inmóviles puede deberse a un defecto estructural del flagelo. (Chemes and Rawe,
2003).
-Evaluar en duplicado 200 espermatozoides.
Vitalidad utilizando Eosina-Nigrosina.
Permite almacenar las placas para re-evaluación
y propósitos de control de
calidad. Björndahl et al., 2003)
>58% vivos
Test hipo osmótico (Jeyendran et al., 1984)
Espermatozoides con membranas intactas se hinchan y sus forma
flagelar cambia dentro de los 30 minutos.
Hossain et al., 1998.
•NOTA: El Porcentaje de Viabilidad debe ser mayor o igual al porcentaje de movilidad total, cuando
sucede lo contrario se deben verificar ambas mediciones.

Es imposible caracterizar la calidad del semen masculino al evaluar
solo una muestra del paciente.
Es recomendable examinar 2 o 3 muestras para obtener datos confiables y
una media. Carlsen et al., 2004 Castilla et al., 2006.

13
OMS´5: Cámara de recuento de espermatozoides
No recomendado:
Cámaras de pequeño volumen: demasiados pocos espermatozoides
Cámaras llenadas por capilaridad: llenado desigual

Numero de
espermatozoides
contados por
campo con el
objetivo de 40X
Numero de
espermatozoides
contados por
campo con el
objetivo de 20X
Dilución
(Semen +
Diluyente)
Seme
n
(μL)
Diluyente
(μL)
Cámar
a
***Numer
o de
cuadro
que debe
ser
contado
>101 >404 1:20(1+19) 50 950 Neubau
er
5,4,6
16-100 64-400 1:5 (1+4) 50 200 Neubau
er
5,4,6
2-15 8-60 1:2 (1+1) 50 50 Neubau
er
5,4,6
<2 <8 1:2 (1+1) 50 50 Neubau
er
(toda la
camara)
los 9
cuadros
completos
Conteo espermático
o Media de 3 campos
oPreparación x duplicado de la dilución (tabla 1)
oPreparación del Hemocitometro
oContar mínimo 200 células/ por duplicado
oComparar las diferencias de los conteos
oCalcular
C=(N/n) x (1/profundidad de la camra)X factor dilucón(espermas/nL)
oReportar Mill/mL

15
15
Concentración espermática: cámara Neubauer Improved
20 nl
dilución 1+1 (1:2),
C=(N/2)x (1/900)x2 espermatozoides/nl
C= (N/1800) espermatozoides/nl.
C=(N/1.8uL)2 esperma/nl
<2 <8
Sensibilidad
56,000/ ml
0.25 esperma/nl=250/uL=250000/ml
dilución 1+1 (1:2),
C=(N/n)x (1/100)x2 espermatozoides/nl
C= (N/n)x (1/50) espermatozoides/nl.
Cámara de 100 μl de profundidad
9 rejillas de 100nl
Rejilla central
25 cuadrados grandes de 4nl
Cada cuadrado grande
16 cuadrados pequeños de 250pl
dilucion 1+4 (1:5),
C=(N/n)x(1/20)x5 espermatozoides por nl
C= (N/n)x(1/4) espermatozoide/nl ( o 106x ml de
semen).
dilucion 1+19 (1:20),
C= (N/n)x espermatozoide/nl ( o 106x ml de semen).
dilucion 1+50 (1:49),
C= (N/n)x2.5 espermatozoide/nl ( o 106x mL de
semen).
Si se observan < 25 espermatozoides,
state:
“< 56,000 /ml” o “< 2,000 /ml”
20 nl

EJEMPLO
Con una dilución 1+19 (1:20).
Conteo 1: 98 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)
Conteo 2: 114 espermatozoides;15 filas de cuadriculas (cuadros 5,4 y 6)
(98+114)= 212 en 30 filas : diferencia (114-98) =16
De acuerdo a la tabla 2.
C=(N/n)x(1/20)x20
C=(N/n)x espermatozoide nl ( o 106x ml de semen).
(212/30)x1.00=7.07 espermatozoides/nl
(212/30)x1.00=7.07 106 espermatozoides/mL.
Suma Diferencia
Aceptable *
Suma Diferencia Aceptable *
144-156 24 329-346 36
157-169 25 347-366 37
170-182 26 367-385 38
183-196 27 386-406 39
197-211 28 407-426 40
212-226 29 427-448 41
227-242 30 449-470 42
243-258 31 471-492 43
259-274 32 493-515 44
275-292 33 516-538 45
293-309 34 539-562 46
310-328 35 563-587 47
>15 mill/mL
>39 mill eyaculado

Limite de referencia inferior: >4 %
Similares a los reportados para fertilización in vitro (Coetzee et al., 1998),
inseminación intrauterina (Van Waart et al., 2001)
y fertilidad in vivo (Van derMerwe et al., 2005)
Valor en la población general: Entre 0 y 30 % (Menkveld et al., 2001).

Que es un espermatozoide normal?????
CABEZA CUELLO Y PIEZA
MEDIA
COLA
•4-5 μm Longitud.
•2.5-3.5 μm. Ancho.
•40-70%, Acrosoma.
•Oval y Uniforme.
•5 μm Longitud.
•1 μm Ancho.
•<1/2 Cabeza, Gota
Citoplasmica.
•45 μm
largo.
•Derecha y
Uniforme.

MORFOLOGÍA NORMAL DE LOS ESPERMATOZOIDES
O.M.S Criterio Estricto > 14% (Kruger)
Se asocia a alteraciones de la concentración y movilidad.
Teratozoospermia Causas:
Varicocele, la sepsis seminal, el estrés y la exposición a agentes externos nocivos.

21
Tight trousers/underpants,
Genital exposure
to heat stress
Temperature peaks:
Sauna, hot baths,
heated car seat,
electric blanket, fever
Profession:
down-filled duvet
Boilerman, welder,
foundry worker, baker...
www.analisisdesemen.com.mx 21
Clothing:
pyjamas,
Constitutional:
Varicocele,
undescended testicle,
retractile testis
Physical inactivity:
Car, desk, computer,
TV;
paraplegia

• Estirar la gota de semen sobre un portaobjetos
• No estirar hacia delante
• No dejar que la gota se seque
El grosor de la extensión de semen dependerá de:
• volumen de la alicuota (5-10 μl) pequeño espermatozoides separados
• ángulo de arrastre del portaobjetos (45º) mayor extensión más fina
• velocidad de la extensión (~1s) más alta extensión más gruesa
Se pueden hacer dos extendidos por cada muestra fresca previniendo roturas o
mala tinción.
La evaluación se hará en replicados preferentemente en cada replicado

Es preferible dejar secar, fijar y teñir las
muestras.
Sin embargo sabemos que esto se asocia a cambios en las dimensiones del
esp. ya que teñidos, resultan más pequeños que los que están frescos.
Expansión de cabezas inmaduras.
Pérdida de gota citoplasmática sensible a cambio osmótico.

Muestras de baja concentración (< 2 x 10 6/ml)
Centrifugar a 600 g x 10 min
Muestras de mucha viscosidad resulta un extendido muy grueso:
Diluir con solución salina
Ccf 10 min a 600 g
Descartar el sobrenadante
Resuspender el pellet en 20-40 ul
Chequear de que los espermatozoides esten bien distribuidos y no amontonados
Dejar secar
Centrifugar la muestra puede afectar la morfología y se debe dejar por escrito en el informe

CASA
(Analizador de Semen
Asistido por Computadora)

Espermatozoides anómalos se asocian a
bajo potencial fértil y daño al DNA,
cromatina inmadura, aneuploidias, etc.

Exceso de citoplasma residual (ERC)
Esto se asocia con una espermatogénesis anormal
Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma > 1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media
defectuosa.

Una frecuencia alta de colas
enrolladas puede indicar que el espermatozoide ha
estado sometido a un stress hipoosmótico o
envejecimiento
Si hay más de un 20 % hay que informarlo
Esto se asocia con una espermatogénesis anormal
Los espermatozoides presentan un resto de citoplasma >
1/3 de su cabeza a veces asociado a una pieza media
defectuosa.

1000x bajo aceite
Analizar todos los espermatozoides en cada campo que tengan cabeza y cola
Evaluar normales y anormales
Evaluar 200 esp x duplicado
Calcular el valor medio y la diferencia de los duplicados
Si la diferencia es aceptable (ver Tabla) informar valor medio. Sino volver a evaluar.
Informar valores enteros.
LRL: 4 % (IC 95 %: 3-4)

De acuerdo con Ward (1994), la descondensación del núcleo del
espematozoide involucra una serie de eventos:
rearreglos topológicos de la cromatina
transición de las proteínas que envuelven a la cromatina
modificación en el patrón de la transcripción
pérdida de la estructura del nucleosoma
adquisición de un arreglo condensado de la cromatina

Espermatozoide normal

Expresión de resultados
% normales y % anormales
% Anomalías de cabeza
% Anomalías Pieza media
% Anomalías de cola
% Anomalías de exceso de citoplasma residual

Ejemplos
N= 200, 18 %
N= 200, 9 %
Difer: 9, valor medio; 14 %
Aceptable hasta: 7
Descartar lecturas y repetir
N=200, 10 %
N= 200, 14 %
Difer. 4, valor medio 12%
Aceptable hasta 7:
Valor 12 % formas normales

Ejemplo
N=200
Normales: 36 esp. (18 %)
Anormales: 164
An.cabeza: 122
An. SI: 108
An.cola: 22
ECR: 36
N=200
Normales: 42 esp. (21 %)
Anormales: 158 esp.
An.cabeza: 140
An. SI: 102
An.cola: 30
ECR: 44

Ejemplo
Solo se compara el % de formas normales :
21 % y 18 %= valor medio: 19, 5 %
redondeado a 20 % y una diferencia de 3.
Voy a la Tabla y la diferencia aceptada es
hasta 8.
Informe:
Normales: 20 %
Anormales: 80%
An.cabeza: 140+122/400: 66 %
An. SI: 102+108/400: 53 %
An.cola: 30+22/400: 13 %
ECR: 44 + 36/400: 20%

Procedimientos opcionales: Indice de
teratozoospermia, evaluación de anomalías múltiples
1 4
TZI > 1,6 se asocia a daño a DNA y mal
pronóstico de fecundar

• Normal > 14% formas normales con buena tasa de fertilización
• Buen pronóstico 4 a 14% formas normales con una tasa de fertilización
regular.
• Mal pronóstico <4% formas normales con una tasa de fertilización muy
disminuida.

OTROS TIPOS CELULARES PRESENTES EN
EL SEMEN
Presencia de células no espermáticas Epiteliales y Redondas
 Células Germinales Inmaduras (daño testicular)
 Leucocitos (inflamación de las glándula accesorias)

HEMOCITÓMETRO
Prevalecía en relación con los espermatozoides

Polimorfonucleares

-Escamosas, Cúbicas y Transcisionales.

CELULAS GERMINALES INMADURAS
100X, Tinción Diff-Quick.
ESPERMATOGONIA ESPERMATIDE ESPERMATOCITO

LEUCOCITOS

EVALUACION DE LAS CELULAS REDONDAS
C= N X S
200
C= Concentración celular
N= Cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos
que 200 espermatozoides.
S= Concentración espermática.
Ejemplo: 10 X 120 millones/mL = 6millones/mL
200

Necrozoospermia o
Astenozoospermia
Falsa (los datos no
concuerdan)
Patología o
intervenciones
Recogida
inadecuada
(coitus
interruptus)
Posible
Contaminación
Abstinencia
Prolongada
Retraso en la
Entrega de la
Transporte
Inadecuado
Muestra
Eyaculación
Fraccionada

ESTUDIOS COMPLEMENTARIOS
Si el análisis de semen se encuadra en estudios de esterilidad:
www.analisisdesemen.com.mx 48
•Si se aplica en RA (REM)
•Oligozoospermia (<5 mill/mL) y Azoospermia (cariotipo y microdelecciones
del cromosoma Y)
•Hipospermia y/o pH<7, Leucocistospermia >10 mill/mL, aglutinaciones en
eyaculado, Oligoastenoteratozoospermia, marcadores prostaticos (cultivo de
semen)
•Azoospermia u Oligozoospermia: Agenesia bilateral de conductos deferente
(estudios del gen de la fibrosis quísticas)

Si la estimación de la concentración de células Redonda Excede de 1 millon/ml
Deberá evaluar por la prueba de peroxidas (leucocitos marcados)
Las células de peroxidas positivas se tiñen de pardo y la peroxidasa negativas no se
colorean.
Cuente por duplicado por lo menos 200 leucocitos peroxidas-positivos en el
Hemocitómetro y saque el porcentaje de peroxidasa positivas y negativas.

Cummings JM & Jequier AM (1994)
Treating male infertility needs more clinical andrology, not less.
Hum Reprod 9: 1214-1219
1995
2000

51
CONCLUSION
Los cambios en el manual de laboratorio de la OMS para el
examen de semen humano están enfocados a:
• aumentar la exactitud de los datos analíticos
• suministrar más detalles experimentales de métodos
comunes
Estos deberían ayudar a mejorar
• la estandarización entre laboratorios
• el valor diagnóstico de los resultados de los análisis de
semen
• y llevar a cabo tratamientos terapéuticos

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