Este documento proporciona una introducción al tema de la cromatografía. Explica que la cromatografía separa una mezcla de solutos basándose en sus diferentes velocidades de desplazamiento a través de una fase estacionaria impulsada por una fase móvil. También resume brevemente la historia de la cromatografía y sus principios fundamentales, incluyendo la distribución de los componentes entre las fases móvil y estacionaria. Además, introduce algunos conceptos básicos como los cromatogramas, pará

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE
PIURA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERI QUÍMICA
TEMA:
“CROMATOGRAFIA”
DOCENTE:
ING. FERNANDEZ REYES.
II- 2005
INDICE
CROMATOGRAFÌA.
I - INTRODUCCION
I.1-CONCEPTO:
I.2-HISTORIA.
I.3.-PRINCIPIOS.
II.-CONCEPTOS BASICOS DE LA CROMATOGRAFIA
II.1.-PERFILES CROMATOGRÁFICOS
(CROMATOGRAMAS)
II.2.- PARAMETROS
II.2.1.- RESOLUCIÓN CROMATOGRÁFICA .
II.2.2.- FACTOR DE CAPACIDAD (Κ).
II.2.3.- EFICIENCIA.
II.2.4.- SELECTIVIDAD
II.3.- ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA.
III.-TIPOS DE CROMATOGRAFÌA.
III.1.-SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DEL ELUYENTE:

2. III.1.1.-CROMATOGRAFÌA DE GASES.
III.1.A.-INSTRUMENTACIÓN.
A.1- Gas portador.
A.2- Puerto de inyección.
A.3- Inyectores.
A.4- Recinto termostatizado.
A.5- Columna.
A.5.1.- Columnas empaquetadas.
A.5.2.- Columnas tubulares abiertas.
A.5.4.- Detectores.
A.5.4.1.- Detectores de conductividad térmica.
A.5.4.2.-Detectores de ionización de llama.
A.5.4.3.- Detector de captura electrónica:
A.5.4.4.- Otros detectores:
III.1.2.- CROMATOGRAFIA DE LÍQUIDO
III.2.- SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DEL LECHO:
III.2.1.- CROMATOGRAFÍA LIQUIDO-LIQUIDO (CLL)
III.2.2.- CROMATOGRAFÍA LIQUIDO-SÓLIDO (CLS)
III.2.3.- CROMATOGRAFÍA GAS-LIQUIDO (CGL).
III.2.4.- CROMATOGRAFÍA GAS-SÓLIDO (CGS)
IV.- CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO (HPLC).
IV.1.- INSTRUMENTACIÓN.
IV.1.2.- SISTEMA DE BOMBEO PARA PROPORCIONAR PRESIÓN A LA FASE MÓVIL
IV.1.2.1.- BOMBA RECÍPROCA.
IV.1.3.- SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRAS
IV.1.4.- COLUMNA CROMATOGRÁFICA.
IV.1.4.1.- PRE-COLUMNA.
IV.1.5.- TERMOSTATOS PARA LAS COLUMNAS
IV.1.6.- DETECTORES.
IV.1.6.1.- Detector de absorción uv
IV.1.6.2.- Detector de absorción UV de fila de diodos (Diode Array Detector,
DAD).
IV.1.6.3.- Detector de fluorescencia
IV.1.6.4.- Detector de índice de refracción
IV.1.6..5.- Detector de dispersión de luz
IV.1.6.6.- Detector Amperométrico
IV.1.6.7.- Detector de conductividad iónica
IV.1.7.- SISTEMA PARA EL TRATAMIENTO DE DATOS Y REGISTRADOR
V.- CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA
V.1.- SEGÚN LAS CARACTERÍSTICAS DEL LECHO CROMATOGRÁFICO:
V.1.1.- CROMATOGRAFÌA PLANA.
V.1.1.1.- ABIERTO: CAPA FINA, EN PAPEL.
V.1.1.1.A.- CROMATOGRAFÌA EN CAPA FINA.
V.1.1.1.B.- CROMATOGRAFIA EN PAPEL
V.I.2.- CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.
V.1.2.1.- INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
V.1.2.2.- CERRADO: EN COLUMNA:

3. V.2.- CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE BAJA PRESIÓN
V.3- SEGÚN LA COMPOSICIÓN DEL ELUYENTE
V.3.1.-ISOCRÁTICA.
V.3.2.- GRADIENTE
V.4- SEGÚN LA POLARIDAD DE LA FASE ESTACIONARIA.
V.4.1.- FASE NORMAL
V.4.1.1.- PROCESO DE ELUCIÓN EN CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL
V.4.2.- FASE REVERSA.
V.4.2.1.- PROCESO DE ELUCIÓN EN CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA.
VI.- MECANISMOS DE CROMATOGRAFIA.
VI.1.- DE REPARTO
VI.2.- DE FILTRACIÓN EN GEL O DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
VI.3.- DE ADSORCIÓN.
VI.4.- DE INTERCAMBIO IÓNICO.
VI.5.- DE AFINIDAD.
VI.5.1.- ESQUEMA DE UN CROMATOGRAMA DE AFINIDAD.
VI.5.1.1.-SOPORTES
VI.5.1.2.- INMOVILIZACIÓN DE LIGANDOS.
VII.- METODOS DE ELUCIÓN
VII.1.- ELUCIÓN BIOESPECÍFICA:
VII.2.- LA ELUCIÓN NORMAL
VII.3.- LA ELUCIÓN INVERTIDA
VII.4.- EN LA ELUCIÓN NO BIOESPECÍFICA,
VIII.- APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÌA
VIII.A.- PRODUCCIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GAS NATURAL
VIII.B.- COMPARTIMENTOS PARA COMBUSTIBLES
VIII.C.- REGISTRO PARA LA PROSPECCIÓN DE GAS Y PETRÓLEO
VIII.D.- INDUSTRIA QUÍMICA
VIII.E.- DESARROLLO DE EQUIPOS CON COMBUSTIÓN DE GAS
VIII.F.- MEDIDAS RÁPIDAS Y EXACTAS, CUANDO Y DONDE LAS NECESITE.

4. VIII.1.- METODOLOGÍA ANALÍTICA
VIII.1.2.- TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
VIII.1.3.- CORRELACIÓN CROMATOGRÁFICA
VIII.1.4.-DETERMINACIÓN DE COMPOSICIÓN DE MEZCLAS
VIII.1.5.-CONCLUSIONES
IX.- NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA
X.- MÉTODOS PRINCIPALES
X.1.-CROMATOGRAFÍA FRONTAL
X.2.-CROMATOGRAFÍA DE DESPLAZAMIENTO:
X.3.-CROMATOGRAFÍA DE ELUSIÓN:
XI.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
XI.1.-EXTRACCIÓN.
XI.1.1.- Líquido-Líquido.
XI.1.2.-Extracción en fase sólida (SPE)
XI.1.3.- Supercrítica (FSC).
XI.2.- LIMPIEZA (CLEAN-UP).
XI.3.- CONCENTRACIÓN
XI.4.- DERIVATIZACION
XII.- OTRAS APLICACIONES ANALITICAS
XII.1.-MEDICINA Y FARMACOLOGÍA
XII.2.- MEDIO AMBIENTE
XII.3.-ALIMENTACIÓN.
XII.4.- BIOQUÍMICA
XIII.- APLICACIONES – ANALISIS
XIII.1.- ANÁLISIS CUALITATIVO
XIII.2.- ANÁLISIS CUANTITATIVO
XIII.3.-CALIBRACIÓN ABSOLUTA

5. XIII.4.- NORMALIZACIÓN DE ÁREA
XIII.5.- FACTOR DE RESPUESTA (CÁLCULOS PARA EL FID):
XIII.6.-MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO
XIV. PRACTICA DE LABORATORIO
XV.-PARTE BIBLIOGRAFICA.
CROMATOGRAFÌA.
I - INTRODUCCION
I.1-CONCEPTO:
La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos
basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al
ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico
que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de
los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase
móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la
migración de los mismos.
La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido que se queda fijo en la misma
posición. La fase móvil puede ser un líquido o un gas que corre a través de una superficie
y de la fase estacionaria. Las sustancias que están en un sistema de cromatografía
interaccionan tanto con la fase estacionaria como con la fase móvil. La naturaleza de
estas interacciones depende de las propiedades de las sustancias así como también de la
composición de la fase estacionaria.

6. La rapidez con que viaja una sustancia a través del sistema de cromatografía depende
directamente de la interacción relativa entre las sustancias y las fases móvil y
estacionaria. En el caso de una mezcla, si cada componente interacciona diferente con la
fase móvil y la fase estacionaria, cada uno de ellos se moverá diferente.
I.2-HISTORIA.
La cromatografía fue descubierta por el botánico ruso de origen italiano Mijail Tswett en
1903. Tswett separo los pigmentos de las plantas (clorofila) vertiendo extracto de hojas
verde en éter de petróleo sobre una columna de carbonato de calcio en polvo en el interior
de una probeta. No obstante, no existen datos sobre la utilización de esta técnica hasta
1930 cuando khun y Lederer separaron también pigmentos de las plantas usando como
adsorbentes alúmina y carbonato de calcio. Fue a partir de ahí cuando se inicio el
verdadero desarrollo de la cromatografia.
Para explicar el fenómeno cromatorgafico es necesario establecer dos tipos de
fundamento, uno remoto y otro próximo
Fundamento remoto: Este fundamento se encuentra en alguna o algunas propiedades
físicas o físico químicas de los analitos: solubilidad, adsorción (tendencia a ser retenidos
en sólidos finamente divididos), volatilidad, tamaño, carga, reactividad química o
bioquímica, etc. La mezcla de sustancias a separar se coloca en una situación
experimental dinámica donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero
por duplicado tal como la solubilidad en dos líquidos diferentes como ocurre en
cromatografía liquido - liquido. Deben cumplirse las condiciones siguientes:
- Los componentes de los sistemas empleados deben estar en intimo contacto entre si.
- El equilibrio establecido entre esos componentes debe ser lo mas completo posible.
Fundamento próximo: Se encuentra en el hecho de que es muy improbable que dos
especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades físicas o físico -
químicas frente a un sistema cromatográfico dado. Por tanto, en estas diferencias, que
pueden ser muy pequeñas, se basa la separación cromatográfica.
CONTRADICION: Hay que indicar que el nombre de la técnica es incorrecto, ya que no
consiste en escribir con colores. Este nombre proviene de la primera experiencia
cromatográfica realizada, la cual se utilizo para separar pigmentos coloreados de plantas.
I.3.-PRINCIPIOS.
La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los
componentes separados eran colorantes. Se define como una técnica o método físico de
separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos
en un disolvente llamado eluente (fase móvil) a través de un medio estacionario o fijo.
Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o
fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la
mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la
separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la
distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas que "prefieren

7. disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido que las que son preferencialmente
solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se
fundamenta en la separación entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil
liquida o gaseosa
Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la
absorción. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la
fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con
fuerzas químicas y físicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida,
temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina
la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia
que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.
II.-CONCEPTOS BASICOS DE LACROMATOGRAFIA
Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan son “movilidad” entre si y
con respecto a la fase móvil. Se eligen las condiciones experimentales y las fases
cromatográficas para que los componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad.
La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la velocidad de
migración de los mismos.
La cromatografía es probablemente la más versátil de las técnicas de separación: es
aplicable a cualquier mezcla soluble o volátil. De hecho las técnicas de separación suelen
dividirse en dos grandes grupos: cromatograficas y no cromatograficas. La elección de
una técnica cromatográfica concreta dependerá de la naturaleza y cantidad de la muestra,
del objetivo de la separación y de las limitaciones del tiempo y equipo asequible
Puede hacerse una primera distinción entra las técnicas cromatográficas atendiendo a la
integración continua o no del sistema de detección. Así, la cromatografía no conlleva a un
sistema de detección, mientras que cualquier cromatógrafo de líquidos o gases lleva
incorporado dicho sistema siendo, por tanto, auténticos instrumentos.
Para clasificar globalmente los procesos cromatográficos es necesario atender a dos
criterios básicos:
técnicas cromatográficas.
La cromatografía es un proceso físico-químico de separación. Se trata de un proceso de
aplicación muy amplia, tanto es así que muchas mezclas heterogéneas o en forma sólida
pueden transformarse en fase liquida por el empleo de un disolvente. El esquema de
trabajo puede resumirse de la siguiente manera (Rouessac y Rouessac, 2003):
1- Se inmoviliza en una columna un sólido finamente dividido llamado fase
estacionaria.

8. 2- Se coloca en la parte superior de la columna un pequeño volumen de muestra
que hay que separar.
3- Se fuerza a la mezcla disuelta, a través de la fase móvil, a atravesar la
columna de arriba abajo para arrastrar los diversos constituyentes. Si los
compuestos de la mezcla migran a velocidades diferentes, podrán recogerse
separadamente.
La técnica ha mejorado considerablemente desde sus principios. Actualmente se dispone
de cromatógrafos que reúnen alrededor de una columna optimizada y miniaturizada (para
poder separar micro cantidades de muestras) todo un conjunto de accesorios destinados
a asegurar la repetibilidad de las experiencias sucesivas por el perfecto control de los
diferentes parámetros de separación. Para análisis sucesivos de una misma muestra,
realizados en condiciones idénticas a diferentes intervalos, los tiempos de retención son
reproducibles con variaciones de pocos segundos (Rouessac y Rouessac, 2003).
Para revelar la presencia de las sustancias eludías a la salida de la columna estratigráfica
se utilizan detectores. El detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad
física, no medible directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la
naturaleza y magnitud de la propiedad física.
Características de los detectores:
- Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en
una señal eléctrica medible.
- Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector
mantiene una sensibilidad constante sin una desviación arbitraria.
El significado práctico de la linealidad del detector es el que le indica al analista la
concentración para la cual el detector es confiable. Hay dos límites en la curva de
linealidad:
a) El límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección.
b) El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la
curva de linealidad.
- Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es
constante.
- Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El
significado de conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la
determinación de la cantidad mínima detectable y el límite inferior del rango lineal.
- Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que
puede producir una señal que sea el doble del nivel de ruido.
- Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que
un detector está operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal
es muy importante, ya que permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del
detector.
Las proteínas, debido a su alto peso molecular, no pueden ser separadas por
cromatografía de partición, ya que no son arrastradas por el solvente. En tales casos se
utiliza la cromatografia en columna, en la que una solución de una mezcla de proteínas se
pasa por una columna formada por un material sólido y poroso (denominado matriz), con
el cual las proteínas interaccionan de diferentes maneras y pueden ser separadas según
sean o no retardadas en su pasaje (Fig. II). Las matrices de las columnas están diseñadas

9. de manera de interactuar con la carga de las proteínas (cromatografía de intercambio
iónico) o con los aminoácidos expuestos en su superficie (cramatografía de interacción
hidrofóbica), o pueden llevar unida alguna molécula que, a su vez, interacciona
específicamente con la proteína que se quiere retener (cromatografía de afinidad).
Fig. I
Separación de moléculas pequeñas por cromatografía de partición. La muestra se aplica
en el origen y se deja secar; luego, una mezcla de solventes, que sube por efecto de la
capilaridad, se deja pasar lentamente. Los componentes de la muestra se separan según
sean más solubles en el solvente que queda absorbido al soporte o en aquel que migra
más rápido.
Fig. II
Separación de proteínas por cromatografía en columna. La muestra se aplica en la superficie de
una columna de vidrio o plástico llena con una matriz permeable inmersa en el solvente elegido.
Luego, el solvente se hace pasar lentamente por la columna y es recogido en tubos separados. La
elución de las proteínas se registra por su capacidad de absorber luz en una longitud de onda de
280NM. Abajo: Diagrama de elución de las proteinas
fraccionadas.

10. Fig. III
Separación de proteínas según su tamaño molecular. La mezcla de proteínas en solución se pasa
por una columna compuesta por esferas de un polímero sólido (en general dextrano), que permite
la entrada de pequeñas moléculas; las de mayor tamaño no penetran en la matriz y eluyen con
mayor rapidez. Abajo: Diagrama de elución de las proteínas fraccionadas.
La cromatografía de exclusión molecular es diferente de las anteriores, pues conduce al
fraccionamiento de las proteínas según su tamaño. Para ello, la matriz está formada por
pequeñas esferas porosas que permiten la entrada de proteínas de un cierto tamaño, que
son retardadas, mientras las moléculas mayores pasan (o eluyen, según dicen los
bioquímicos) más rápido (Fig. III).
La salida de las proteínas de una columna cromatográfica se detecta normalmente por
absorción de la luz, en una longitud de onda de 280nm. Debido a la composición de sus
aminoácidos, las proteínas absorben tal luz y, utilizando un espectrofotómetro, se puede
detectar la elución de las proteínas en la cromatografía. Los datos se registran en lo que
se denomina diagrama de elución e indican la posición de las proteínas que se han
separado. Después pueden realizarse estudios de actividad biológica, enzimática, etc. de
las proteínas fraccionadas.
La separación efectuada se conserva en un registro individual llamado cromatograma. Un
cromatograma es una imagen que traduce visualmente en una pantalla o en un papel la
evolución, en función del tiempo, de un parámetro que depende de la concentración
instantánea del soluto a la salida de la columna. Este gráfico se obtiene gracias a un
detector situado a la salida de la columna (Rouessac y Rouessac, 2003).

12. II.1.-PERFILES CROMATOGRÁFICOS
(CROMATOGRAMAS)

13. II.2.- PARAMETROS
II.2.1.- RESOLUCIÓN CROMATOGRÁFICA
Es una medida cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos A y B. la
resolución de cada columna queda definida como:
2 ΔZ 2((tR) B - (tR) A)
RS = -------------- = --------------------
WA +WB WA +WB
Se puede mejorar la resolución para una fase estacionaria determinada alargando la
columna, lo que incrementa el número de platos. Sin embargo, una consecuencia adversa
de añadir platos es un incremento en el tiempo necesario para la separación de los
componentes (Skoog y cols., 2001).
II.2.2.- FACTOR DE CAPACIDAD (Κ).
Actualmente, se conoce como factor de retención (k). El factor de retención es un
parámetro experimental importante que se utiliza para describir las velocidades de
migración de los solutos en columnas. Para el soluto A, el factor de retención, kA se define
como:
KA.VS
kA = --------
VM
Donde KA es la constante de distribución del soluto A, Vs es el volumen del soluto en la
fase estacionaria y Vm el volumen del soluto en la fase móvil (Skoog y cols., 2001).
II.2.3.- EFICIENCIA.
La eficiencia de una columna cromatográfica depende del ensanchamiento de banda que
ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna. Para las mediciones
cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatográficas se emplean dos términos:
(1) altura del plato H y (2) cantidad de platos o número de platos teóricos N. Los dos están
relacionados por la ecuación:
L
N = ------
H
Donde L es la longitud del empaque de la columna (en cm). La eficiencia de las columnas
cromatográficas aumenta a medida que es mayor el número de platos N y la altura H es
menor. Se observan grandes diferencias en la eficiencia de las columnas como resultado
de las diferencias en el tipo de columna y de las fases móvil y estacionaria.
En términos de número de platos teóricos, la eficiencia puede variar desde unos
centímetros hasta varios cientos de miles; la altura de los platos varía desde unas
décimas hasta milésimas de centímetro y son comunes incluso mas pequeñas (Skoog y
cols., 2001).
II.2.4.- SELECTIVIDAD

14. El factor de selectividad α de una columna para dos solutos, A y B, se define como la
relación de la constante de distribución del soluto retenido con más fuerza, B, y la
constante de distribución del soluto retenido con menos fuerza, A:
KB
α = ------
KA
Donde KB es la constante de distribución de la especie retenida con más fuerza,
especie B, y KA es la constante de la especie retenida con menos fuerza, es decir, la
especie A, que eluye más rápido. De acuerdo con esta definición, α siempre es mayor
que la unidad (Skoog y cols., 2001).
II.3.- ETAPAS DEL ANALISIS DE UNA MUESTRA
 Optimización de las condiciones instrumentales.
 Obtención de los cromatogramas en condiciones óptimas (muestras y patrones)
 Calibración (diferentes técnicas).
 Cuantificación del/los componentes presentes en la muestra.CG 3.
 Tratamiento de los resultados.
1. Se busca obtener como respuesta instrumental:
 Picos bien resueltos.
 Buena relación señal a ruido.
 Línea de base horizontal (sin deriva).
 Picos no distorsionados.
2. Normalmente suele realizarse una calibración por estándar externo o utilizando un
Estándar interno.
i. Estándar externo:
Se preparan muestras de patrones de concentración conocida que se analizan y
Permiten construir una curva de calibración para cada componente a cuantificar. Con
Este método es necesario medir exactamente los volúmenes inyectados tanto de los
Patrones como de la muestra incógnita.
ii. Estándar interno:
En este caso se agrega a la muestra una cantidad conocida de un compuesto que no
Está presente originalmente. En este caso, la calibración se realiza analizando patrones
de concentración conocida para cada componente a cuantificar a los cuales le agrega la
misma cantidad del estándar interno que a la muestra incógnita. La curva de calibración
se construye graficando el cociente entre la señal del analito incógnita y el estándar
interno en función de la concentración del analito incógnita. Este método elimina el error
cometido por la irreproducibilidad en el volumen inyectado.
3. Tanto para la medición de la muestra como de los patrones, es conveniente estudiar la
reproducibilidad de la señal analítica y la de los tiempos de retención del/los analitos.
Para ello se deben realizar varias inyecciones (n) de cada muestra y cada uno de los
patrones y utilizar los valores medios.
4. Se realizara el tratamiento de resultados siguiendo las indicaciones dadas en la guía de
Trabajos prácticos.

15. III.-TIPOS DE CROMATOGRAFÌA.
III.1.-SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DEL ELUYENTE:
III.1.1.-CROMATOGRAFÌA DE GASES
La cromatografía de gases es una técnica que se usa para separar compuestos orgánicos
volátiles. Implica el uso de una columna cromatografica especial en cuyo inicio se inyecta
la muestra vaporizada. La muestra se transporta a lo largo de una columna impulsada por
una fase móvil gaseosa inerte, los componentes de dicha muestra se separan debido a
las diferencias en su perfil de partición entre fase móvil gaseosa y fase estacionaria
liquida o sólida, hablándose entonces de cromatografía gas-liquido o gas-sólido.
III.1.A.-INSTRUMENTACIÓN.
Se hace pasar un analito (gas o liquido volátil) en forma gaseosa a través de la columna
arrastrado por una fase móvil gaseosa, llamado el gas portador.
La muestra de un líquido volátil o de un gas se inyecta, a través de un septo (disco de
goma), en un portador caliente, en el que se evapora rápidamente. El vapor es arrastrado
a través de la columna por el gas portador, que puede ser helio, nitrógeno, hidrógeno,
argón, hidrógeno o dióxido de carbono. Los analitos después de separarlos llegan al
detector, cuya respuesta aparece en la pantalla de un ordenador.
A.1- Gas portador.
Se mezcla con la muestra vaporizada impulsándose por la columna cromatografiíta. La
elección del gas portador depende del detector, de la eficacia y rapidez de separación
deseados.
A.2- Puerto de inyección.
Para que los componentes de una muestra se separen eficientemente es necesaria
introducir en la columna volúmenes de muestras no demasiado grandes y en forma de
nube de vapor puntual. Ambas cosas se consiguen utilizando una microjeringilla que
permitirá atravesar el septo de goma que separa la cámara del exterior e inyectar la
muestra rápidamente en dicha cámara. La temperatura del puerto de inyección suele
estar a 50º por encima del punto de vaporización del componente menos volátil de la
muestra.
A.3- Inyectores.

16. El inyector es la puerta de entrada de la muestra en el cromatógrafo. Tiene otras dos
funciones: vaporizar y arrastrar a la cabeza de la columna la muestra mezclada con el gas
portador. El gas portador arrastra la muestra vaporizada desde el inyector a la columna.
Los inyectores pueden ser de dos tipos, se diferencian según el tipo de columnas
que utilicen:
1. Inyectores directos para columnas empacadas (hot direct packed inyector).
2. Inyectores semidirectos para columnas capilares (capillary split-splitless
inyector).
La inyección en columnas abiertas puede ser de tres tipos:
1. con división: forma rutinaria de introducir una muestra pequeña en la columna.
2. sin división: es la mejor forma para niveles de traza de solutos de alto punto
de ebullición en disolventes de bajo punto de ebullición.
3. en columna: es la mejor forma de inyección para solutos termodinámicamente
estables y disolventes de alto punto de ebullición.
A.4- Recinto termostatizado.
El cromatógrafo incluye una cámara de volumen suficiente y fácil acceso para instalar la
columna, que puede ser termostatizada a alta temperatura.
A.5- Columna.
Localizada normalmente en el interior de una cámara termostatizada (horno). Las
columnas pueden ser de dos tipos:
A.5.1.- Columnas empaquetadas.
Se caracterizan porque contienen un soporte sólido fino recubierto de una fase
estacionaria liquida no volátil, o el sólido mismo es la fase estacionaria. Estas
columnas son de acero inoxidable, níquel o vidrio y sus dimensiones típicas son 3-
6 mm de diámetro y 1-5 m de longitud. El soporte sólido suelen ser tierras de
diatomeas.
A.5.2.- Columnas tubulares abiertas.
Son columnas abiertas, largas y estrechas que están hechas de sílice fundida y
recubiertas de poliamida (un polímero capaz de resistir 350 ºC) como soporte y
protección de la humedad atmosférica. Se caracterizan por una mayor resolución,
más rapidez de análisis, mayor sensibilidad y menor capacidad de muestra.
Pueden ser de tres tipos:
a) Columnas tubulares abiertas de pared cubierta: se caracterizan por
estar recubiertas en su interior por una película de fase estacionaria
liquida de un grosor de 0,1 a 0,5 μm.
b) Columnas tubulares abiertas recubiertas de soporte: se
caracterizan por poseer partículas sólidas adheridas a la pared interior,
que están recubierta de la fase estacionaria liquida.

17. c) Columnas tubulares abiertas de capa porosa: se caracterizan por
tener la pared interior recubierta de una fase estacionaria sólida.
A.5.4.- Detectores.
Es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eludías a la salida de la
columna cromatográfica. Hay distintos tipos de detectores entre los que destacan:
A.5.4.1.- Detectores de conductividad térmica: se utilizan en columnas de 0,53
mm y en empaquetadas. La conductividad térmica se caracteriza porque mide la
capacidad de una sustancia para transmitir calor de una región caliente a una fría.
Este dispositivo denominado catarómetro, se caracteriza por:
 Presentar intervalos de respuesta lineal de 104
.
 Usar helio como gas portador.
 Dar el menor limite de detección el hidrógeno y el helio.
 Aumentar la sensibilidad cuando: aumenta la corriente en el filamento,
disminuye el caudal, la temperatura del bloque es la más baja posible.
A.5.4.2.-Detectores de ionización de llama: se usa mucho en cromatografía de
gases cuando se trabaja con columnas tubulares abiertas y con columnas
empaquetadas. La corriente gaseosa que sale de la columna penetra en la llama
de un pequeño quemador alimentado por la mezcla de hidrógeno y aire. Este
detector destruye la muestra, cuya combustión produce iones y partículas
cargadas responsables del paso de una corriente iónica extremadamente débil
entre dos electrodos.
Se caracteriza por:
 Utilizar el nitrógeno como mejor limite de detección.
 Ser la señal proporcional al número de átomos de carbono ionizable.

18.  Tener un límite de detección de 100 veces mejor que el de
conductividad eléctrica.
 Tener un intervalo de respuesta lineal de 107
, aun teniendo este amplio
intervalo de linealidad la resolución es siempre menor con las
disoluciones más diluidas.
A.5.4.3.- Detector de captura electrónica:
Se caracteriza por:
 Ser sensible a moléculas que contienen halógenos, carbonilos
conjugados, nitrilos, nitrógenos, compuestos organometálicos, pero es
insensible a los hidrocarburos, cetonas y alcoholes.
 Usar como gas portador nitrógeno o argon con un 5% de metano.
 Disminuir la sensibilidad la humedad.
A.5.4.4.- Otros detectores:
a) Detector de llama alcalina: es sensible a compuestos que contienen
nitrógeno y fósforo. Tiene interés en análisis de medicamentos, pesticidas y
herbicidas.
b) Detector fotométrico de llama: mide la emisión óptica procedente del
fósforo, azufre, plomo, etc. Cuando el eluato (lo que sale de la columna)
pasa por una llama de H2-aire, los átomos excitados emiten luz
característica.
c) Detector de fotoionización: utiliza una fuente ultravioleta de vacío para
ionizar compuestos aromáticos y no saturados. Mide los electrones
producidos por ionización de estos compuestos.
El detector se coloca al final de las columnas, responde a la concentración del soluto y se
registra en función del tiempo y obteniéndose una serie de picos, generándose un grafico
que se denomina cromatograma. La posición de los picos en el eje del tiempo puede
servir para identificar los componentes de la muestra.
III.1.2.- CROMATOGRAFIADE LÍQUIDO
Es una técnica ampliamente utilizada para realizar separaciones físicas de mezclas de
compuestos orgánicos naturales y sintéticos
III.2.- SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DEL LECHO:
III.2.1.- CROMATOGRAFÍA LIQUIDO-LIQUIDO (CLL)
En la que ambas fases son liquidas y, por tanto, se trata de una cromatografía de
partición.
III.2.2.- CROMATOGRAFÍALIQUIDO-SÓLIDO (CLS)
En la que la fase estacionaria es sólida (adsorción, cambio iónica, exclusión,
afinidad).

19. III.2.3.- CROMATOGRAFÍAGAS-LIQUIDO (CGL).
Que es una cromatografía de partición.
III.2.4.- CROMATOGRAFÍAGAS-SÓLIDO (CGS)
Que es una cromatografía de adsorción.
Si es un fluido supercrítico, (fluido calentado a una temperatura superior a la temperatura
crítica, pero simultáneamente comprimido a una presión mayor que su presión critica), se
trata de la cromatografía de fluidos supercríticos (CFS), que puede ser de partición o de
adsorción.
IV.- CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA EFICIENCIA O RENDIMIENTO
(HPLC).
Es una Cromatografía de alta presión es decir se
aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El
tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la
longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y
requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar
muestras proteicas. La reducción del tiempo en
que la sustancia se encuentra en el interior de la
columna, limita el ensanchamiento por difusión de
las bandas, aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de
solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el
líquido a la columna. Generalmente las columnas
de sílica requieren alta presión para que el flujo de
líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere
para variar la proporción de solvente en la fase
móvil y el inyector permite la aplicación de la
muestra. A la salida de la columna se coloca un
detector generalmente de absorción ultravioleta o
de fluorescencia y si se desea recuperar las
moléculas que eluyen de la columna, se requiere
un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una
computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar
la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según
su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos
presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando
el área la curva del pico correspondiente.

20. -OTROS COMPONENTES.
- Tubos capilares de acero
- Conexiones sin volumen muerto
- Horno columna (opcional)
- Sistema eliminación de aire
Aire disuelto en la fase móvil
(Problemas):
Bomba (flujo inestable).
Detector (señales erráticas)
– Elución por alta presión (hasta 500 atmósferas)
– Alta resolución, rapidez y reproducibilidad
– Purificación de moléculas biológicas de gran variedad de propiedades y tamaños.

21. IV.1.- INSTRUMENTACIÓN.
Los componentes básicos de un sistema para HPLC son:
IV.1.1.- DEPÓSITOS PARA LA FASE MÓVIL (DISOLVENTES)
 FASE MÓVIL.
Agua, metanol, acetonitrilo, cloroformo, hexano.
Disolventes alta pureza (microfiltrados).
 PRESIÓN
Presión entrada columna hasta 200 atm
Presión de trabajo habitual: 25 – 100 atm.
 FLUJO DE FASE MÓVIL
En cromatografía analítica: 0,5 – 2,5 mL/min
La bomba ajusta la presión necesaria para conseguir el flujo requerido. La presión
depende de: longitud columna, tamaño de partícula, viscosidad y flujo fase móvil,
temperatura
Unidades de presión (SI)
Pascal (Pa) = Newton m-2
1 atm = 105 Pa = 1 bar
psi (pound square inch, libra por pulgada cuadrada)
Kg cm-2
1 psi = 6897 Pa
1 atm = 105/6897 = 14,5 psi
IV.1.2.- SISTEMADE BOMBEO PARAPROPORCIONAR PRESIÓN ALAFASE MÓVIL

22. • Flujo constante
• Material inerte
• Rango adecuado flujos
• Facilidad de cambio
• Flujo sin pulsos
• Cambio fácil de disolvente
• Fácil de desmontar y reparar
IV.1.2.1.- BOMBARECÍPROCA.
El pistón avanza y retrocede llenando la cámara de disolvente (10 – 100 mL) e
impulsando la fase móvil hacia la columna. Suelen tener dos pistones.
IV.1.3.- SISTEMADE INYECCIÓN DE MUESTRAS
Inyector Rheodyne 7125.
IV.1.4.- COLUMNACROMATOGRÁFICA.
Tubo de acero inoxidable
10, 12’5, 15, 25 cm de longitud; 4,6
mm f interno.

23. IV.1.4.1.- PRE-
COLUMNA.
Columna de
dimensiones reducidas, situada antes de la columna analítica.
Mismo tipo de fase estacionaria, partículas de mayor diámetro, menor empaquetamiento.
Protección de la columna analítica
IV.1.5.- TERMOSTATOS PARA LAS
COLUMNAS
IV.1.6.- DETECTORES.
Dispositivo que monitoriza el eluato de la columna. Genera una señal eléctrica, que es
proporcional a alguna propiedad de los analitos y/o de la fase móvil.
Características.
Sensible
Lineal
Universal
Selectivo
Volumen muerto reducido
No destructivo
Barato
Fácil de manejar
Tipos:
- Absorción UV
- Fluorescencia
- Índice de refracción
- Dispersión de luz
- Electroquímico
- Amperométrico
- Conductividad eléctrica

24. - Espectrometría de masas
IV.1.6.1.- Detector de absorción uv
Fundamento: absorción de radiación UV por parte de los
compuestos eluidos de la columna.
El eluato de la columna pasa por una célula de flujo, que
es atravesada por el haz de radiación procedente de la
lámpara.
La mayoría de los compuestos orgánicos absorben en la
zona UV del espectro. Ej. Hidrocarburos aromáticos y sus
derivados, compuestos con enlaces múltiples entre
carbono y oxígeno, nitrógeno y azufre.
Las absorciones más intensas son en el intervalo 180 -
210 nm. También para los disolventes. Por ello la zona útil de medida l > 210 nm. De
medida no tiene por qué situarse en el máximo del espectro de absorción.
Componentes básicos: Fuente de radiación: lámpara de deuterio (wolframio + deuterio)
Monocromador, selecciona l. Tubo foto multiplicador
Ventajas
Buena sensibilidad
Rango lineal muy amplio
Sirve para muchos compuestos.
IV.1.6.2.- Detector de absorción UV de fila de diodos (Diode Array Detector, DAD)
La radiación policromática, después de atravesar la muestra, llega a un elemento
dispersor, fijo, que descompone la radiación y la hace llegar hasta una fila de fotodiodos.
.
Cada fotodiodo mide, simultáneamente, la radiación que le llega, y, por lo tanto, todas las
absorbancias a las distintas longitudes de onda se miden simultáneamente.

25. cromatograma
espectro
Genera una enorme
cantidad de datos. Registra
todos los valores de
absorbancia, en el intervalo de l de trabajo, cada microsegundo.
Matriz de datos que puede ser consultada en tiempo real y después del registro del
cromatograma (uso de ordenador)
IV.1.6.3.- Detector de fluorescencia
Fundamento: Sustancias excitadas con radiación UV-V emiten radiación
Muy sensible y selectivo para sustancias que tengan esta propiedad. Ej., hidrocarburos
policíclicos aromáticos (PAH’s).
IV.1.6.4.- Detector de índice de refracción
Fundamento: cambio del índice de refracción entre el eluato de la columna y una corriente
de referencia de fase móvil pura.
Se utiliza para detectar compuestos que no se puede detectar con otros detectores (UV,
fluorescencia). Ej., hidrocarburos alifáticos, triglicéridos

26. IV.1.6..5.- Detector de dispersión de luz
Fundamento: dispersión de la radiación por un
aerosol seco formado por el eluato de la columna.
Ventajas: Universal, Compatible con elución en
gradiente.
Inconvenientes: No es selectivo.
IV.1.6.6.- Detector Amperométrico
Fundamento: oxidación o reducción de los analitos
sobre el electrodo de trabajo, y medida de la
intensidad de corriente eléctrica originada. Responde
a analitos que pueden oxidarse o reducirse.
Ej., fenoles, aminas aromáticas, heterociclos
nitrogenados, mercaptanos, alcoholes insaturados,
hidratos de carbono, aniones inorgánicos. Como fase
móvil se usan disoluciones acuosas o de disolventes
polares que tengan electrolitos, exentas de
oxígeno.Puede realizar medidas mediante pulsos de
potencial. Eliminación de productos de la reacción
electródica de oxidación o reducción, que envenenan
la superficie del electrodo.
IV.1.6.7.- Detector de conductividad iónica
Se utiliza en cromatografía de intercambio iónico.
Tipos:
-Con supresión iónica.
Sin supresión iónica.
Con supresión: Un dispositivo (supresor de conductividad), situado después de la
columna analítica, reduce la conductividad de la fase móvil y aumenta la de la banda del
analito.
Sin supresión: Se utilizan fases móviles, que son disoluciones diluidas de electrolitos
débiles, que dan una señal baja en el detector
Características de los sistemas con supresión
Fase móvil más concentrada
Columna analítica Detector de conductividad
Columna analítica Supresor Detector de conductividad

27. Mayor capacidad de intercambio
Disolución supresora.
Características de los sistemas sin supresión
Fase móvil más diluida
Menos capacidad de intercambio
Sencillo
IV.1.7.- SISTEMAPARA EL TRATAMIENTO DE DATOS Y REGISTRADOR
V.- CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA
V.1.- SEGÚN LAS CARACTERÍSTICAS DEL LECHO CROMATOGRÁFICO:
V.1.1.- CROMATOGRAFÌAPLANA
La cromatografía plana es un tipo de cromatografia liquida en la que la fase estacionaria
esta extendida sobre la superficie de un plano y la fase móvil fluye a través de ella. La
fase móvil siempre es un líquido, mientras que la fase estacionaria puede ser un
liquidosoportedo en un sólido (cromatografia de particion) o un sólido sorbente
(cromatografia de adsorción, cambio iónico o exclusión).
El flujo de la fase móvil se produce:
d y gravedad (cromatografia descendente)
Esta clase de cromatografia es considerada la más simple de todas las técnicas
cromatograficas. La diferencia principal con la cromatografia en columna es de tipo
técnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase estacionaria. En lo que se refiere
al fenómeno en que se fundamenta la separación, es el mismo para ambas técnicas
En la cromatografía plana, la disolución de la muestra a separar se sitúa sobre el plano
que contiene la fase estacionaria en forma de mancha, o a veces de banda, a corta
distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una vez seca la mancha o banda, el
extremo del plano próximo a la misma se pone en contacto con la fase móvil,
manteniendo todo el sistema cromatográfico en una cámara cerrada.
La separación se produce por migración diferencial de los componentes de la muestra en
la dirección en que se mueve la fase móvil. Generalmente, a diferencia de la
cromatografía en columna, en cromatografía plana el analito no abandona el lecho
cromatográfico, de forma que el proceso se detiene cuando la fase movil ha alcanzado
una determinada zona del plano
V.1.1.1.- ABIERTO: CAPA FINA, EN PAPEL.
V.1.1.1.A.- CROMATOGRAFÌAEN CAPA FINA.

28. Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se
aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma
de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas
electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos,
etc). Los adsorbentes más utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y
poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas
o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia: f254 ó f366.
La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe
encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara
por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo
“manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración
diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más
polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente
se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de métodos químicos en el que por
inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de
Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por
medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen
comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el
semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la
mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa
se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión
o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.
En cromatografía en capa fina, un sólido, sorbente o soporte de la fase estacionaria, se
extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie rígida, normalmente una capa
de vidrio o polietileno, de forma que la fase móvil fluye a través del mismo. Dependiendo
de las características del sólido utilizado, la cromatografía será de partición, adsorción,
cambio iónico o exclusión.
V.1.1.1.B.- CROMATOGRAFIAEN PAPEL
El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el
tanque cromatográfico.
La cromatografía en papel tuvo su máximo desarrollo en, os años cincuenta per en la
actualidad se encuentra prácticamente eclipsada debido a la mayor rapidez, eficacia y

29. versatilidad de la cromatografía en capa fina. Aproximadamente solo el 4% de las
publicaciones sobre las distintas técnicas cromatográficas se dedican a la cromatografía
en papel. En esta técnica, la celulosa actúa como soporte de la fase estacionaria que
suele ser agua (cromatografia de partición). No obstante, también existen en el comercio
papeles impregnados (v.i. como gel de sílice o alúmina, con silicona para separaciones en
fase invertida, con cambiadores ionicos) o tratadas químicamente (v.i. grupos
cambiadores incorporados al esqueleto polimérico de la celulosa), que amplían la
aplicabilidad de esta técnica.
Particularidades de esta técnica:
- Comprende un sistema donde están presentes tres fases distintas; una fase
estacionaria sólida, una fase móvil liquida y una fase vapor en equilibrio.
- La fase estacionaria esta parcialmente equilibrada por la fase liquida antes del
paso de los compuestos.
- La capacidad de absorción disminuye a medida que una parte de las
posiciones de absorción están ocupados.
- No es posible hacer variar el flujo de la fase móvil para mejorar la separación.
- La velocidad de migración del disolvente no es constante.
V.I.2.- CROMATOGRAFIAEN COLUMNA.
V.1.2.1.- INTRODUCCIÓN A LA CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
La cromatografía es una técnica que se emplea en el fraccionamiento de proteínas.
Consiste en la aplicación de una muestra compleja de proteínas a una columna de cristal
en la que se ha situado una matriz sólida porosa que está inmersa en el solvente. A
continuación se bombea una gran cantidad de solvente a través de la columna. Las
diferentes proteínas se van retrasando de manera distinta según sus interacciones con la
matriz, por lo que pueden ser recogidas separadas a medida que son eluidas por el fondo
de la columna. Según la matriz escogida, las proteínas se pueden separar de acuerdo a
su carga, su hidrofobicidad, su tamañó o su capacidad de unirse a grupos químicos
particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la
electroforesis en geles de poliacrilamida.

30. En toda cromatografía hablaremos de los siguientes términos:
 matriz de la columa. Sustancia que está empapada de solvente y que se
empaqueta en la columna. También se denomina el lecho de la columna.
 longitud de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la
columna. Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en
gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
 volumen de la columna. Volumen total de gel que se empaqueta en una columna
cromatográfica.
 volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la
columna para asegurar que se ha reemplazado completamente. Coincide con el
volumen de solvente que sale de la columna desde que se aplica la muestra hasta
que empieza a salir la primera proteína. En general, y dependiendo del tipo de
cromatografía puede ser de 1 a varias veces el volumen de la columna.
 'Run Throught'. Es, en columnas de intercambio iónico o de afinidad, el volumen
de solvente más proteínas que atraviesa la columna sin quedar retenido en ella.
Correspondería en el caso de la cromatografía de afinidad al volumen de solvente
que contiene las proteínas no afines al ligando.
V.1.2.2.- CERRADO: EN COLUMNA:
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio.
La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el
interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se
encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La
solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución
que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra
retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas
pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente
formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución,
aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede
ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la
resolución.

31. Es de destacar que en la actualidad, aunque incorrectamente, el término de cromatografia
en columna suele aplicarse a la cromatografia liquida para distinguirla de la cromatografia
plana ya que, obviamente la cromatografia de gases solo puede realizarse en columna.
V.2.- CROMATOGRAFÍALÍQUIDA DE BAJA PRESIÓN

32. – Elución por gravedad o por bomba peristáltica
V.3- SEGÚN LA COMPOSICIÓN DEL ELUYENTE
V.3.1.-ISOCRÁTICA.
Composición de la fase móvil constante durante todo el desarrollo cromatográfico.
Ventajas: Mayor rapidez, No necesita reacondicionar, Menos consumo disolventes
Inconvenientes: No resuelve mezclas complejas
V.3.2.- GRADIENTE
La composición de la fase móvil cambia durante el desarrollo cromatográfico.
Ventaja: Alta
resolución.
Inconvenientes: Mayor tiempo análisis, Mayor consumo disolventes
V.4- SEGÚN LA POLARIDAD DE LA FASE ESTACIONARIA.
V.4.1.- FASE NORMAL
La fase móvil es no-polar (hexano, tetracloruro de carbono, benceno, etc) y la
fase estacionaria es polar (generalmente sílica).

33. Fase estacionaria polar, Fase móvil apolar.
Fase estacionaria típica: sílice
Fase móvil típica: hexano
V.4.1.1.- PROCESO DE ELUCIÓN EN CROMATOGRAFÍADE FASE NORMAL
La cromatografía de adsorción con sílice, como fase estacionaria, es un ejemplo de
cromatografía en fase normal.
La fase móvil compite con las moléculas de soluto por los sitios activos de la fase
estacionaria.
La capacidad de un disolvente para eluir un soluto del adsorbente es, prácticamente,
independiente de la naturaleza del soluto.
Se puede describir la elución como el desplazamiento de un soluto, adsorbido en la fase
estacionaria, por un disolvente
Fuerza eluyente (eo) es una medida de la energía de adsorción del disolvente. Se le da
valor cero al sistema pentano/sílice.
En cromatografía de adsorción, cuanto más polar es un disolvente mayor es su fuerza
eluyente. Los solutos se eluyen más rápidamente.
V.4.2.- FASE REVERSA.
La Fase Móvil es Polar (Agua, Soluciones “Amortiguadoras de pH”, Acetonitrilo, Metanol,
etc.) y la Fase Estacionaria es No-Polar (Generalmente Sílica injertada con cadenas de
grupos orgánicos de 8 y 18 átomos de Carbón (C8 y C18).
Fase estacionaria apolar
Fase móvil polar.
Fase estacionaria típica: C-18
Fase móvil típica: agua-metanol.
Ventajas: Aplicación, Fases móviles baratas, Amplia polaridad de solutos, puede
utilizarse para solutos iónicos (formación pares iónicos).
V.4.2.1.- PROCESO DE ELUCIÓN EN CROMATOGRAFÍADE FASE REVERSA
La fase estacionaria es apolar (octadecilsilano) y la fase móvil polar (agua/metanol).
El disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente., Disolventes orgánicos miscibles
con agua: Metanol, acetonitrilo, tetrahidrofurano.

34. VI.- MECANISMOS DE CROMATOGRAFIA.
VI.1.- DE REPARTO:
Lecho líquido polar
Eluyente líquido apolar (hidrofóbico)
VI.2.- DE FILTRACIÓN EN GEL O DE EXCLUSIÓN
MOLECULAR:
La cromatografía de filtración en gel se realiza empleando
unas matrices formadas por unas esferas porosas. El
volumen de los poros es muy elevado y su diámetro está
determinado. Cuando penetran en el lecho de la columna
dos proteínas de tamaños tales que una penetra en los
poros de las bolas de gel y la otra no, la primera se
reparte entre el espacio entre las bolas y el interior de los
poros, reduciéndose la concentración en la fase libre
entre las bolas. La segunda proteína, por tamaño, sólo
puede encontrarse entre las bolas. El flujo de solvente es

35. más elevado entre las bolas que en el interior de los poros de éstas, por lo que el efecto
neto es el de acelerar el desplazamiento de las proteínas de mayor peso molecular
respecto al de las de menor peso molecular. En esta cromatografía se eluyen primero las
proteínas mayores, y en segundo lugar las menores, y tiene una gran influencia en el
resultado la longitud de la columna y el volumen de la misma. Columnas largas aseguran
separaciones de mayor calidad. Empleando patrones de proteínas de peso molecular
conocido se emplea para determinar el peso molecular de proteínas de tamaño
desconocido.
– Retención dependiendo de la relación tamaño molecular porosidad del gel
– Parámetros importantes:
• Volumen de exclusión, V0
• Volumen total de eluyente, Vt
• Volumen de elución, Ve
• Coeficiente de reparto
VI.3.- DE ADSORCIÓN.

36. El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba en fase móvil (liquida o
gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals) Por este método la separación se logra por
absorción selectiva de los constituyentes en la mezcla. La fase estacionaria puede ser
alúmina o sílice, en tanto que la fase móvil generalmente es un líquido o bien un gas.
El grado de separación depende de la superficie activa del sólido, por lo tanto, el tamaño
de la partícula que se emplea debe ser lo más pequeña posible para tener mas superficie
activa sin llegar al extremo de tener un polvo tan fino que restrinja el paso de la fase
móvil.
El método por absorción se emplea sobre todo en la separación de estructuras
semejantes en especial isómeros poco diferentes, incluso se ha podido aplicar en la
resolución de mezclas racémicas empleando un absorbente con poder rotatorio como la
sacarosa.
– Interacciones reversibles específicas entre soluto y fase estacionaria
– Materiales adsorbentes: óxidos de aluminio, silicatos, carbón activo, polisacáridos, ...
VI.4.- DE INTERCAMBIO IÓNICO.
La cromatografía de intercambio iónico se realiza sobre matrices que tienen una carga
neta, positiva en el esquema. La carga de la matriz de la columna así como la carga de
las proteínas dependerá del pH del solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la
concentración de iones). En unas condiciones determinadas serán retenidas en la
columna las proteínas que tengan una carga complementaria a la de la matriz del gel (las
proteínas cargadas negativamente serán retenidas por una matriz cargada
positivamente), siendo eluidas las restantes. Para eluir las proteínas retenidas se pueden
variar la carga iónica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoeléctrico
de la proteína de interés o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que
retiene a las proteínas en la columna.
– Interacción de moléculas ionizadas con una matriz cargada

37. VI.
5.-
DE AFINIDAD.
En la cromatografía de afinidad las bolas de gel que conforman el lecho de la columna
presentan unido en su superficie un ligando, una molécula ante la que tiene afinidad una o
más de las proteínas presentes en la mezcla a separar. Al atravesar la columna el ligando
secuestra sobre la superficie de las bolas de gel la proteína afín, y deja pasar el resto. La
elución de la proteína afín se puede conseguir modificando las propiedades de carga del
ligando (variando el pH hasta alcanzar su punto isoléctrico, variando la fuerza iónica del
solvente, etc...) con lo que se reduce la intensidad de la interacción hasta anularla.
La naturaleza del ligando es muy variada, puede ser un receptor (proteína) unido a las
bolas, que seleccionará su/s ligando/s de una mezcla compleja, o el antígeno empleado
en una inmunización el que recubre las bolas y que retendrá del suero del animal aquellos
anticuerpos que lo reconocen (anticuerpos purificados por afinidad), o en el caso concreto
de la inmunoafinidad el ligando que recubre las bolas son anticuerpos que retienen en la
columna a aquellas proteínas que contienen los epítopos que reconocen.
En ocasiones la cromatografía de afinidad se realiza incubando el gel recubierto con el
ligando directamente con la solución que contiene las proteínas a purificar.

38. Posteriormente se empaqueta la columna y se procede a la elución, primero de las
proteínas no unidas ('run throught') y posteriormente de las retenidas (eluido
específico).
– Interacción específica y reversible con ligandos inmovilizados en la fase estacionaria
– Purificación de enzimas y anticuerpos
VI.5.1.-
ESQUEM
A DE UN
CROMAT
OGRAM
A DE AFINIDAD.
VI.5.1.1.- SOPORTES
El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando
de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano
controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar
adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en
especial para trabajar a alta presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los
polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y
sílices CPG.
VI.5.1.2.- INMOVILIZACIÓN DE LIGANDOS.
La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso
tiene connotaciones específicas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces
químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté
lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando
bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas

39. secuenciales:
- Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la
superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos
hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque
con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se
originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos,
según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un
disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando
que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el
soporte activado.
VII.- METODOS DE
ELUCIÓN
Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en
cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos
generales de elución como:
VII.1.- ELUCIÓN BIOESPECÍFICA:
La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que
en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que
interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito
o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos
los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo
peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o
libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.

40. VII.2.- LA ELUCIÓN NORMAL
Se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es
una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso
molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene
preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida.
Ejemplo, la purificación de la lectina.
VII.3.- LA ELUCIÓN INVERTIDA
Se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula
que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil
provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para
purificar glucoproteína.
VII.4.- EN LA ELUCIÓN NO BIOESPECÍFICA,
La fase móvil provoca la desnaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de
ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal
manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o
varias de las causas que la provocan.
VIII.- APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÌA
Su trabajo se utiliza la cromatografía de gases tanto en el laboratorio como en el
oleoducto donde realiza la medida. Desde la cabeza del pozo hasta la refinería, durante
todo el proceso de producción, la instrumentación ha de estar preparada para que pueda
llevar a cabo la medida correcta, justo cuando usted la necesita, un día sí y otro también.
Debe ser exacta y fácil de utilizar y ofrecer resultados de las pruebas a tiempo ya sea
para utilizarlos en investigación, fabricación, o almacenamiento y distribución.
El Micro cromatógrafo de gases Agilent 3000 es precisamente ese tipo de producto.
Fiable. Fácil de utilizar. Exacto. Rápido.
Ha sido diseñado específicamente para cuantificar composiciones químicas en
aplicaciones relacionadas con toda la industria de proceso de hidrocarburos: refinerías,
producción y distribución de gas natural, operaciones químicas y prospección de gas y
petróleo, y en el desarrollo de compartimentos para combustibles y en la producción de
gas industrial.
El Micro CG Agilent 3000 ya está preconfigurado para aplicaciones en un amplio espectro
de sectores industriales. Analizadores específicos de aplicación están preparados,
equipados con los instrumentos, software, gases de calibración y ordenador. Algunos
ejemplos de estos analizadores ilustran las posibilidades que ofrece el Micro CG 3000.
Las aplicaciones incluyen:
VIII.A.- PRODUCCIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE GAS NATURAL

41. Una planta de proceso de gases puede beneficiarse del Analizador de gas natural Agilent
3000, una configuración específica de aplicación del Micro CG 3000. Esta solución
completa incluye el CG, software, gases de calibración y un ordenador, todo ello
preparado para ofrecer un servicio rápido, fiable y repetible. Esta unidad es eficaz en
sistemas de distribución al tiempo que permite realizar una medida rápida de la
composición y contenido calorífico en el punto de transferencia de custodia, asegurando
un valor correcto del gas y protegiendo los gaseoductos de distribución, las bombas y
válvulas.
VIII.B.- COMPARTIMENTOS PARACOMBUSTIBLES
El Micro CG 3000 tiene cabida tanto en el desarrollo como en la fabricación de
compartimentos para combustibles. Resulta cómodo en la medida de H2, CO, CH4 y otros
componentes en investigación y desarrollo. Su velocidad y flexibilidad permiten también la
optimización del rendimiento del sistema de compartimentos para combustibles, en todos
los pasos del proceso.
VIII.C.- REGISTRO PARA LA PROSPECCIÓNDE GAS Y PETRÓLEO
Los sondeos de exploración son caros. Es esencial obtener medidas rápidas del
contenido de hidrocarburos durante la operación de perforación, para que ni el equipo ni
el personal se queden parados y para poder tomar decisiones sobre la dirección y
ubicación de la perforación. El Micro CG 3000 se puede introducir en el lugar de
perforación con lo que las medidas son inmediatas y no hay necesidad de un
cromatografista extremadamente experto, ni de un laboratorio.
VIII.D.- INDUSTRIAQUÍMICA
El uso de gases como material en la fabricación de polímeros requiere un control efectivo
de la composición y pureza del gas. Las impurezas pueden afectar a la producción e
incluso dañar los catalizadores y los componentes del sistema. La rápida capacidad de
respuesta del Micro CG 3000 optimiza la “inspección” de entrada, para confirmar el
cumplimiento de las especificaciones por parte del proveedor y proteger la integridad del
proceso de fabricación.
VIII.E.- DESARROLLO DE EQUIPOS CON COMBUSTIÓN DE GAS
Puede resultar difícil optimizar el rendimiento y la eficacia de los componentes de
combustión de calderas, hornos o calentadores de agua sin tener información precisa
sobre la composición del gas de entrada. El pequeño tamaño y cómodo funcionamiento
del Micro CG 3000 permiten realizar esta medida en la entrada de la cámara de
combustión, obteniéndose resultados prácticamente en tiempo real que se pueden utilizar
para llevar a cabo una regulación en línea de la corriente de gas.

42. VIII.F.- MEDIDAS RÁPIDAS Y EXACTAS, CUANDO Y DONDE LAS NECESITE
La elevada seguridad de funcionamiento del Micro CG 3000, la exactitud, velocidad y
facilidad de uso, son las características que necesita para sus medidas. Está listo en todo
momento. No existe una elección mejor para un amplio rango de aplicaciones en las que
se deba medir la composición de los gases. Póngase en contacto con su representante o
distribuidor autorizado de Agilent para que le ayude a seleccionar las configuraciones
correctas
Micro cromatógrafo de gases 3000
En la industria del petróleo, la presencia de compuestos pesados constituye un problema
tanto para la extracción, como para la transportación y refinación, siendo mayores los
daños al medio ambiente, lo que implica disminución del beneficio económico reportado
por los petróleos con estas características. En este caso se encuentran la mayoría de los
petróleos cubanos.
Es por ello que el presente trabajo tiene como objetivo fundamental la selección,
aislamiento e identificación de microorganismos con capacidades para biodegradar
fracciones pesadas del petróleo (resinas y asfaltenos), como una alternativa para la
solución de los problemas generados por estos compuestos en la industria petrolera
cubana.
La selección se realizó a partir de dos fuentes: muestras de suelos contaminados
tomadas en diferentes sitios del país y cepas conservadas con capacidades
biodegradadoras ya conocidas. Las muestras se cultivaron en un medio salino con un
petróleo crudo pesado como única fuente de carbono durante 14 días.
Al concluir se extrajo la fase orgánica de cada cultivo y se determinó su composición en
fracciones del petróleo (hidrocarburos saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos)
mediante cromatografía de elusión, calculando la tasa de biodegradación de cada fracción
para seleccionar aquellos microorganismos que fueron capaces de oxidar las fracciones
pesadas en más de un 20% sin afectar los hidrocarburos saturados.

43. VIII.1.- METODOLOGÍAANALÍTICA
La cromatografía gaseosa capilar permite reconocer pequeñas diferencias
composicionales por lo que es una herramienta analítica muy útil para diferenciar las
familias de petróleos determinadas por diferentes condiciones migratorias y de
entrampamiento.
VIII.1.2.- TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
El análisis de los petróleos totales por cromatografía gaseosa capilar permite obtener la
distribución de componentes de cada muestra de acuerdo al número de átomos de
carbono y a las características estructurales de los compuestos (hidrocarburos normales o
parafinas y ramificados o isoparafinas). Es una técnica ampliamente aplicada para el
estudio de mezclas complejas como es el caso de los petróleos. En los estudios
geoquímicos que requieren la identificación de compuestos orgánicos individuales, como
los biomarcadores se utiliza la cromatografía gaseosa capilar acoplada a técnicas de
detección más detalladas y poderosas como la espectrometría de masas (p. ej. GC/MS o
GC/MS-MS). En los estudios descriptos en este trabajo el objetivo es comparativo por lo
que la cualidad más apreciada de esta técnica es la reproducibilidad de los fingerprints
cromatográficos. Para lograr estos resultados se utiliza la cromatografía gaseosa capilar
con detector de ionización de llama (FID).
El cromatograma gaseoso capilar de un petróleo está constituido por más de 500 picos y
hombros diferenciables, de los que sólo una pequeña proporción es identificada por
correlación con patrones auténticos.
VIII.1.3.- CORRELACIÓN CROMATOGRÁFICA
Los métodos de correlación de fingerprint cromatográfico utilizan una idea diferente en la
selección de los picos o elementos a considerar. Opuestamente a la metodología
geoquímica exploratoria no se da peso diferente a ningún conjunto de picos en particular
sino que se intenta utilizar todo el fingerprint. En este desarrollo se muestran dos métodos
de comparación. En uno se utilizan todos los compuestos detectados en el cromatograma
gaseoso expresados como porcentajes y discriminados según n- e iso-parafinas para
cada número de átomos de carbono (C). El área correspondiente a cada n-parafina se
determina integrando cada pico individual y se define como iso-parafina con "y" átomos de
C a la porción del cromatograma comprendida entre los compuestos n-C(y-1) y n-Cy . De
esta forma se dispone de un conjunto de parámetros que representan la distribución
completa del fingerprint cromatográfico desde C3 hasta n-C39. La comparación gráfica de
los parámetros porcentuales así obtenidos para dos petróleos determinados permite
establecer el grado de correlación entre los mismos.
El otro método (recomendado cuando los petróleos presentan muchas similitudes)
consiste en la selección de picos (generalmente nafténicos y aromáticos en lugar de n-
alcanos e isoprenoides) que de acuerdo con el examen visual o numérico del
cromatograma pueden resaltar las diferencias composicionales entre los grupos de
petróleos. La metodología más utilizada es la elaboración de una Matriz de Relaciones
que se utiliza para correlacionar las muestras por distintos métodos, tanto numéricos

44. como gráficos (McCaffrey et al, 1996; Callejón-Jiménez, 1995; Nederlof et al, 1995;
Kaufman et al, 1987; Kaufman et al, 1990).
VIII.1.4.-DETERMINACIÓN DE COMPOSICIÓN DE MEZCLAS
Cuando en un pozo se presentan varias capas productoras suele ser muy complejo
determinar el aporte de cada una y su variación con el tiempo de producción. Los
métodos comparativos descriptos más arriba permiten determinar el porcentaje de aporte
de cada una de ellas mediante el análisis de los petróleos punzados correspondientes a
cada capa y el petróleo de producción. La reproducibilidad de la técnica cromatográfica
demuestra ser tan buena que generalmente se pueden comparar los fingerprints
cromatográficos, con excelentes resultados durante períodos muy prolongados.
De cualquier manera se controlan las variaciones analíticas para minimizar su incidencia
en los resultados y además se conservan las muestras en condiciones adecuadas para
repetir análisis si así lo requiere el caso. A modo de ejemplo, en los trabajos pioneros de
Kaufman se presenta la resolución de mezclas de dos petróleos mediante la interpolación
gráfica con varias relaciones (Kaufman et al, 1987; Kaufman et al, 1990).
VIII.1.5.-CONCLUSIONES
En el presente desarrollo se presentan nuevas aplicaciones de la cromatografía gaseosa
capilar y se muestra su potencial en la resolución de problemas relacionados con el
desarrollo y la producción de yacimientos de petróleo. Los resultados obtenidos permiten
puntualizar las siguientes conclusiones: ·
 Es posible detectar heterogeneidades composicionales en los petróleos obtenidos
en los ensayos de cada capa en un pozo.
 Las diferencias entre los grupos o familias de petróleos así detectadas
interpretadas en el marco geológico permiten establecer los procesos que
alteraron los petróleos y así conocer la dinámica de los fluidos en el reservorio.
 Para realizar correlaciones dentro de un reservorio sólo se requiere determinar los
distintos grupos de petróleos observados en distintos niveles (verticalmente) y se
pueden comparar luego en forma lateral para determinar la continuidad del
reservorio. ·
 Es posible determinar el porcentaje aportado por cada una de las capas
estudiadas al petróleo de producción por métodos numéricos.
 Una característica fundamental de esta forma de análisis del petróleo de
Producción es que sólo tiene en cuenta los aportes de petróleo de cada capa y es
totalmente independiente de la producción de agua.
 Las técnicas cromatográficas permiten comparar muestras tomadas en distintos
momentos de la historia productiva de un pozo, un nivel o un yacimiento
determinar las variaciones composicionales producidas e interpretarlas en función
de las condiciones fisicoquímicas del reservorio aportando información
completamente independiente a las herramientas habitualmente utilizadas
IX.- NOMENCLATURAIUPAC PARA CROMATOGRAFIA

45. IX.1.-TERMINO
 Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que
los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales
está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve
en una dirección definida.
 Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación
cromatográfica.
 Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un
detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada
como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente
o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al
papel o capa con las zonas separadas.
 Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las
partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
 Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las
partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por
polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
 Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en
una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas
(Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido
Supercrítico). En la cromatografía de gases se puede usar la expresión Gas
Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también
para la fase móvil la expresión Eluyente.
 Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede
detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho
cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se
prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografía plana.
 Efluente. La fase móvil que abandona la columna.
 Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya
separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos
por la fase móvil.
 Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la
muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no
retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o
retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito
para un componente de la muestra

46. X.- MÉTODOS PRINCIPALES
X.1.-CROMATOGRAFÍAFRONTAL:
Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al
lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional
X.2.-CROMATOGRAFÍADE DESPLAZAMIENTO:
Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es
retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se
alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
X.3.-CROMATOGRAFÍADE ELUSIÓN:
Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del
lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una
pequeña cantidad en un tiempo breve
XI.- PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
XI.1.-EXTRACCIÓN.
XI.1.1.- Líquido-Líquido.
XI.1.2.-Extracción en fase sólida (SPE)
XI.1.3.- Supercrítica (FSC).

47. XI.2.- LIMPIEZA (CLEAN-UP).
El extracto se pasa por una columna rellena de:
- florisil
- gel de sílice
- alúmina
Se separan componentes de la muestra que dan interferencias. Picos en el cromatograma
que solapan con los de los analitos.
XI.3.- CONCENTRACIÓN
XI.4.- DERIVATIZACION
XII.- OTRAS APLICACIONES ANALITICAS
Las primeras aplicaciones analíticas se usaban para analizar compuestos poco volátiles o
térmicamente inestables, que no podían analizarse por cromatografía de gases.
Bomba alta
presión
Cámara
extracción
Sistema
colector
Bala con FSC
bomba auxiliar restrictor

48. Hoy en día son muchas las áreas científicas en las que la cromatografía líquida de alta
eficacia (CLAR) tiene gran importancia.
A continuación comentaremos algunos ejemplos de aplicaciones
XII.1.-MEDICINAY FARMACOLOGÍA
Medicamentos y drogas en preparados farmacéuticos y fluidos biológicos (suero, orina)
XII.2.- MEDIO AMBIENTE
Agua, sedimentos, materia en suspensión, suelo
XII.3.-ALIMENTACIÓN.
XII.4.- BIOQUÍMICA.
XIII.- APLICACIONES - ANALISIS
XIII.1.- ANÁLISIS CUALITATIVO
Un análisis cromatográfico puede dar una amplia información cualitativa si se escoge el
sistema de detección adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, así si
se Utiliza un detector que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a
su vez Contenga una base de datos que pueda realizar su comparación con una
biblioteca de Espectros se podría, de una forma muy precisa, establecer la identidad de
los componentes de una muestra, de hecho esto se logra fácilmente con cromatógrafos
que contienen sistema de detección como el Infrarrojo (IR), el de Resonancia Magnética
Nuclear (RMN) o el Espectrómetro de Masas (MS). Sin embargo, estos sistemas son muy
costosos, es por ello que la mayoría de los laboratorios cuentan con cromatógrafos con
sistemas de detección Sencillos como el detector de ionización a la llama (siglas en
ingles, FID) o el detector de Conductividad térmica (siglas en ingles (TCD).
La única información cualitativa que Pueden ofrecer estos sistemas es el tiempo de
retención del analito, el cual, solo puede ser Usada controlando bien las condiciones
cromatográficas como: flujo, temperatura, tipo de Fase estacionaria entre otras, además
de que se debe tener conocimiento de los posibles Compuestos de la muestra y una
amplia variedad de patrones para realizar comparaciones.
Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo de
Retención, lo que imposibilita su identificación. Por supuesto que, a partir de
Cromatogramas obtenidos con diferentes fases móviles (para cromatografía liquida) y
Estacionarias y a diversas temperaturas de elusión (para cromatografía gaseosa), se
puede Obtener datos adicionales.
XIII.2.- ANÁLISIS CUANTITATIVO

49. El uso de la cromatografía se ha extendido en todo el mundo, en las ultimas cuatro
décadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se puede realizar
un análisis cuantitativo de las especies proporcionadas.
En la cromatografía en columna, el análisis cuantitativo se basa en la comparación de la
altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más patrones inyectados bajo las
mismas condiciones cromatográficas. El uso de una u otro termino dependerá de las
características de la banda obtenida, aunque en la actualidad con el uso de sistemas de
integración de área computarizados, la precisión es alta para el calculo de área, sin
embargo siempre es importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el
área de una banda y en que momento es mejor usar altura en vez de área por si llega a
faltar el sistema computarizado. Para lograr un análisis cuantitativo de los componentes
separados de una muestra existe una gran variedad de métodos de análisis entre los que
se pueden mencionar:
1. Calibración absoluta
2. Normalización de área (con y sin factor de respuesta)
3. Método del estándar interno.
Cada método tiene sus ventajas y desventajas.
XIII.3.-CALIBRACIÓN ABSOLUTA
Para realizar el cálculo de composición, se inyecta masas exactas del componente puro al
Cromatógrafo y se determina el área. Se realiza un grafico relacionando el área de pico
con la masa se obtendrá entonces una curva de calibración que debe ser lineal y pasar
Por el origen. Las desventajas de este método son que la inyección de la muestra debe
ser exacta y que las condiciones del sistema no deben cambiar de una inyección a la otra.
XIII.4.- NORMALIZACIÓN DE ÁREA
La normalización de área es un medio para establecer el porcentaje de cada componente
en la muestra. Se calcula dividiendo el área de cada componente entre el área total y
Multiplicando por 100%, es decir: 100 * % Este término es independiente del volumen de
inyección de muestra y debe cumplirse que Todos los picos deben estar separados. Sin
embargo, esta ecuación solo se puede aplicar para una serie homologa de compuestos
de punto de ebullición muy parecidos y con similares respuestas del detector, algo mas
acorde con la realidad es usar el factor de respuesta.
XIII.5.- FACTOR DE RESPUESTA(CÁLCULOS PARA EL FID):
Cada detector tiene su forma particular de respuesta para cada analito, es por ello, que la
composición de cada componente en la muestra no se puede relacionar directamente a
menos que se unifique la respuesta del detector para cada componente. La respuesta de
un detector de ionización a la llama (FID) es independiente de la temperatura, del flujo de
gas de arrastre y de la velocidad de flujo. Esto hace más sencillos los cálculos, ya que se
puede realizar relaciones directas de peso de muestra, lo cual contribuye a que este sea
el detector ideal para el análisis cuantitativo. El cálculo de factor de respuesta se realiza
experimentalmente de la siguiente forma. Se pesa una cantidad exactamente conocida
del patrón del analito a estudiar Así sucesivamente para todos los componentes en la
muestra. Una vez conocido el factor de respuesta de cada componente en la muestra, se
puede realizar el cálculo de normalización de área con factor de respuesta. Note que al

50. final las áreas corregidas serán iguales, solo se invierte los dividendos y productos. Eso si
es sumamente importante que no mezcle las dos ecuaciones o se confunda
XIII.6.-MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO
Este método es conocido como calibración relativa o indirecta. Para ello, relación de
masas conocidas de un patrón de la muestra y de un estándar deber ser preparadas e
inyectadas al cromatógrafo para luego determinar las relaciones de área. Estas relaciones
de area son graficadas en función de la relaciones de masa, De esta curva se obtiene la
ecuación lineal y = mx.
XIV. PRACTICA DE LABORATORIO
Separación de biomoléculas por cromatografía de permeación en gel.
XIV.1.- Objetivos.
Al término de la práctica el alumno ha de ser capaz de:
1. Comprender el fundamento de la cromatografía de permeación en gel.
2. Saber cómo se realiza una separación cromatográfica en una columna de
permeación en gel.
3. Determinar los parámetros cromatográficos de una columna de permeación
con gel de Sephadex G-100.
4. Calibrar una columna de permeación en gel con dos proteínas coloreadas
patrón.
5. Determinar la masa molecular aparente de la enzima catalasa.
XIV.2.-Contenido.
1. ¿Qué es la cromatografía de permeación en gel?
2. ¿Cómo se realiza una separación cromatográfica?
3. ¿Cómo se determinan los parámetros cromatográficos de la columna de
permeación con gel de Sephadex G-100?
4. ¿Cómo se calibra la columna de permeación en gel?
5. ¿Cómo se determina la masa molecular de la enzima catalasa?

51. DESARROLLO
1. ¿Qué es la cromatografía de permeación en gel?
La cromatografía de permeación en gel es un método de purificación de polímeros
naturales y sintéticos, que separa moléculas en función de la diferencia de sus tamaños
moleculares. En este tipo de cromatografía la fase móvil es líquida, normalmente acuosa,
y la fase estacionaria también es líquida, la misma fase móvil, pero que está contenida en
el interior de una matriz sólida porosa que tiene propiedades de gel cuando se hidrata.
Por tanto, la cromatografía de permeación en gel, en función de las fases, es una
cromatografía de partición o de reparto líquido-líquido.
La matriz sólida porosa que se va a utilizar en la práctica está constituida por un polímero
de dextrano entrecruzado con epiclorhidrina. Es un polisacárido altamente hidrofílico, al
igual que el almidón, que se hincha en contacto con un solvente acuoso. Su estructura
parcial se presenta en la Figura siguiente:
Su nombre es el de Sephadex©. Se fabrica en partículas esféricas porosas, con distintos
tamaños de partícula y de grados de entrecruzamiento. Al variar dicho grado se consigue
obtenerlo con distintas propiedades de capacidad de hidratación, de límites de
fraccionamiento, etc. El que se va emplear es el Sephadex G-100, cuyas propiedades
más importantes son:
 Separa proteínas globulares en el rango de 4.000 – 150.000 Da.
O
C
C
C
C
H
O
OH
C
H
OH
H
CH2
OH
H
H
O
C
C
C
C
H
O
C
H
OH
H
CH2
OH
H
H
O
CH2
CHOH
O
O
C
C
C
C
H
O
OH
C
H
OH
H
CH2
OH
H
H
C
C
C
C
H
O
OH
C
H
C
H
OH
HO
H
H
CH2
O
C
C
C
C
H
O
OH
C
H
OH
H
CH2
H
H
O
CH2
CHOH
CH2OH
O
C
C
C
C
H
O
OH
C
H
OH
H
CH2
OH
H
H

52.  Retiene una cantidad de agua de 10,0 ± 1,0 mL por g de Sephadex seco.
 Su densidad es de 1,04 g/mL.
 La forma de gel se consigue por hidratación. Para ello es necesario calentarlo a 90
ºC durante 5 h en presencia de la fase móvil, con tal de conseguir que el gel
absorba toda el agua que es capaz de retener.
Es interesante que se recuerde que:
 La fase estacionaria es el agua retenida por la matriz en el interior de los poros.
 La fase móvil en esta práctica es una solución acuosa de NaCl al 0,9 % en azida
sódica al 0,03 %).
Los límites de fraccionamiento de cada gel vienen impuestos por el tamaño de los poros
de la matriz del gel. Esto quiere decir, que el gel que se va a utilizar tiene un tamaño de
poro comparable al de las moléculas que se van a separar.
¿Cómo se produce la separación cromatográfica de una muestra que contenga una serie
de proteínas de distinto tamaño molecular?
Las moléculas que tengan un tamaño relativamente pequeño podrán difundir al interior del
gel (fase estacionaria) desde la solución (fase móvil), mientras que las moléculas de un
tamaño grande en relación al tamaño de los poros del gel, tendrán un impedimento a
difundir al interior del gel, tanto mayor cuanto mayor sea su tamaño molecular. Las
moléculas que sean de gran tamaño, se desplazarán con la fase móvil. Por tanto, el
mecanismo de separación de la cromatografía de permeación en gel es un retardo de las
moléculas que pueden entrar por difusión simple al interior del gel.
Sephadex Moléculas
Grande
Pequeña

53. Las muestras que se van a ensayar en la cromatografía de permeación en gel son
cuatro:
 1. Una mezcla de Azul Dextrano y vitamina B12. Esta solución se utilizará para
establecer los límites de separación de la columna cromatográfica. El Azul
Dextrano es un polisacárido de color azul, que al tener una Mr de 2x106
Da, mayor
que el límite superior de 150.000 Da del rango de separación del Sephadex, se
desplazará con la fase móvil y no se introducirá a través de los poros del gel. En
cambio, la vitamina B12, que es una cianocobalamina de color rosa, sí difundirá
totalmente al interior del gel, al ser su Mr de 1.372 Da, menor que el límite inferior
de 4.000 Da del rango de separación del Sephadex.
 2. Una solución de mioglobina. La mioglobina es una cromoproteína con un grupo
ferrohemo que le confiere un color marrón, con una Mr de 17.000 Da, valor que
está dentro del rango de separación del Sephadex.
 3. Una solución de azoalbúmina. Es una proteína natural modificada químicamente
para que tenga una coloración amarillenta, con una Mr de 68.000 Da, valor que
también está dentro del rango de separación del Sephadex G-100.
Estas dos soluciones de proteínas se utilizarán como patrones para calibrar la
columna cromatográfica.
 4. Una solución de catalasa. La catalasa es una enzima oxido-reductasa que actúa
con peróxido de hidrógeno como aceptor, y que produce oxígeno molecular a
partir de dos moléculas de H2O2. Es la proteína cuya Mr se quiere conocer y se ha
seleccionado porque su Mr está dentro del rango de separación del Sephadex. Sin
embargo, la solución de catalasa es incolora, y su presencia en las fracciones
cromatográficas se detectará mediante un ensayo enzimático con H2O2, mediante
la observación de desprendimiento de burbujas de oxígeno.
2. ¿Cómo se realiza una separación cromatográfica?
La técnica que se va a emplear para realizar la cromatografía de permeación en gel es la
de columna. El dispositivo experimental que está montado en el laboratorio consta de:
 Una columna cromatográfica de dimensiones 20 cm de altura x 1 cm de diámetro,
que contiene la fase estacionaria, y que está sujeta verticalmente con pinzas a un
soporte. La columna tiene una llave en la parte inferior por la que se recoge el
eluído de la cromatografía.
 Un depósito de 1 litro de capacidad, que contiene la fase móvil necesaria para
realizar de forma continua la cromatografía.

54.  Un tubo de polietileno que conecta el depósito anterior con la columna
cromatográfica.
 Una gradilla con tubos de ensayo en los que se recogerán las fracciones que
eluyan de la columna.
 Un tubo graduado de 10 ± 0,1 ml en el que se medirán los volúmenes de las
fracciones recogidas.
Las etapas en las que se va a dividir la cromatografía son:
2.1. Preparación de la columna.
Dicha preparación se ha realizado previamente en el laboratorio. Para ello, una papilla de
gel hidratado en la fase móvil, obtenida como se ha indicado en el punto 1, se ha vertido,
poco a poco, en la columna cromatográfica hasta que se ha alcanzado una altura no
menor de 15 cm, pero sin llegar a completar la columna, procurando que no se hicieran
burbujas. A continuación, se ha hecho pasar un volumen de fase móvil suficiente para que
el gel se compacte perfectamente. La columna preparada de esta forma ya está lista para
realizar separaciones cromatográficas.
2.2. Aplicación de la muestra.
Se abre la columna, desenroscando la parte superior que une la columna con el depósito.
Se sujeta dicha parte en la cabeza del depósito, haciendo una lazada.
Precaución: Procure que no se vierta fase móvil, ya que contiene azida sódica, que
aunque está en baja concentración, es un inhibidor de la cadena transportadora de
electrones y por tanto bloquea la respiración celular. Es venenosa. La azida se adiciona
para evitar el crecimiento microbiano en la columna, puesto que el Sephadex es un buen
alimento para los microorganismos.

55. Antes de aplicar la muestra se debe retirar la fase móvil líquida que esté por encima del
gel, sin perturbar el lecho de gel. Esto se realiza para evitar que la muestra se diluya. Para
ello, o bien se introduce una pipeta Pasteur limpia y se succiona el líquido con cuidado de
no llevarse gel, o bien se abre la llave inferior de la columna y se deja fluir la fase móvil
hasta que el menisco del líquido esté por debajo del lecho del gel, o ambas cosas.
La muestra se coloca en la parte superior del lecho en una capa, zona o banda. La
aplicación se realiza con una pipeta Pasteur. Con ella se succiona un volumen de muestra
adecuado del tubo de muestra correspondiente; se introduce la pipeta en la columna
procurando no rozar las paredes de la misma, ni el gel, y se depositan 4 gotas de la
muestra sobre la superficie del gel sin que se remueva la misma. El resto de la solución
contenida en la pipeta se devuelve al tubo de muestra.
IMPORTANTE: Cualquier eliminación de gel o alteración del empaquetamiento influirá en
las siguientes cromatografías, por lo que los resultados que se obtengan no serán válidos
al no ser comparativos, ya que las eluciones se deben de realizar bajo las mismas
condiciones de cantidad de fase estacionaria, de flujos de elución, etc.
2.3. Elución de la muestra.
La cromatografía comienza desde que la muestra aplicada se introduce en el gel. Se
preparan en una gradilla dos tubos de ensayo bien limpio y seco, por cada componente
de la mezcla a separar. Se abre la llave de la columna y se recogen unas cinco gotas en
el tubo. Se cierra la llave. A continuación, con otra pipeta Pasteur se añade lentamente
fase móvil por la paredes de la columna, hasta uno a dos centímetros de altura por
encima de la superficie del gel, procurando no agitarlo. Esta operación concluye con éxito,
cuando al ir adicionando fase móvil se observa que dicha fase permanece incolora, lo que
indica que la muestra ya está introducida adecuadamente en la zona superior del gel.
A continuación, se procede a eluir de manera continua con fase móvil del depósito. Los
pasos a seguir son:
 Se abre la tapadera del depósito para conectarlo a la presión de la atmósfera.

56.  Se llena de líquido el tubo de conexión entre el depósito y la parte superior de la
columna. Si existen burbujas hay que eliminarlas, ejerciendo una presión en el
depósito.
 Se abre la llave inferior de la columna para que empiece a eluir fase móvil por la
columna. Al mismo tiempo se cierra la parte superior en la columna, enroscándola
lentamente. Es importante que esta parte superior no esté llena de líquido que
pueda caer en los tubos.
 El depósito se coloca a mayor altura y se termina de cerrar la parte superior de la
columna, procurando que el flujo sea continuo. Si la columna no está bien cerrada,
se llenará de fase móvil. que rebosará por la parte superior.
2.4. Recogida de fracciones
La recogida de las fracciones que eluyen de la columna se realiza manualmente en los
tubos de ensayo.
 En el primer tubo se recoge el volumen de eluído desde que se introduce la
muestra (las 5 gotas iniciales) hasta que aparece la primera gota coloreada.
 En el siguiente tubo se recoge el volumen en el que eluye todo el componente
coloreado.

57.  En el tubo graduado se mide el volumen en ml de cada uno de los dos tubos de
ensayo.
2.5. Determinación del volumen de elución.
Como se expresa en la guía de la práctica, el volumen de elución de una sustancia es el
volumen del eluído desde que se introduce la muestra en el gel hasta el máximo del pico
de elución del cromatograma. De acuerdo con la teoría de platos de la separación
cromatográfica, toda sustancia eluirá de una columna bajo una curva de distribución de
Gauss, siempre que se utilice otra sustancia que la desplace de la fase estacionaria de la
columna. El análisis cromatográfico que se utiliza es el análisis zonal por desplazamiento.
Como en el procedimiento analítico que se ha realizado, se ha utilizado una fase móvil
que contiene NaCl, y dado que su Mr es de 58,5 Da, la sal actuará como compuesto que
desplazará a todos los componentes de la muestra que tengan una Mr mayor que el
cloruro sódico.
El pico que se debe obtener es simétrico y cuanto más estrecho y puntiagudo sea, mejor
será la resolución cromatográfica obtenida (pico azul). Sin embargo, si en las etapas de
introducción y elución de la muestra (2.2 y 2.3), no se han tenido en cuenta las
precauciones citadas, se puede obtener un pico no simétrico, más ancho, que indicaría
que la elución se ha realizado en parte o totalmente con el componente de la muestra a
separar y no con fase móvil (línea roja discontinua).

58. El volumen de elución se determina por la expresión: Ve = A + B/2 ml.
3. ¿Cómo se determinan los parámetros cromatográficos de la columna de
permeación con gel de Sephadex G-100?
En la práctica hay que determinar los siguientes parámetros cromatográficos para cada
compuesto que se va a eluir en la columna cromatográfica. En total, son diez coeficientes
o constantes de distribución o partición a determinar en la práctica, definidos por la
relación de los volúmenes de la fase móvil a la fase estacionaria, de acuerdo con las
siguientes ecuaciones:
Parámetro Ecuación
Coeficiente de distribución
Coeficiente de reparto
La diferencia entre ellos radica en el denominador de las fracciones, y que es fácilmente
entendible, si se observan los siguientes esquemas y significados:
Concentración
Volumen
Ve
A B
Kd =
Ve - V0
Vi
Kav =
Ve - V0
Vt - V0

59. Para el coeficiente de distribución, Kd:
· Ve es el volumen de elución de un soluto determinado.
· V0 es el volumen muerto, definido como el volumen de la fase móvil que ocupa el
espacio entre los intersticios del gel. Corresponde con el Ve del Azul Dextrano,
compuesto de Mr tan alta que no se introduce al interior del gel.
· Vi es el volumen de la fase estacionaria que se calcula mediante la ecuación 1:
Donde:
 Wr es el agua retenida por el Sephadex G-100 = 10,0 ± 1,0 ml/g
 d es la densidad del gel húmedo, que es 1,04 g/ml,
 Vt es el volumen total, que se calcula por el volumen del cilindro:
Vt = p r2
h, (2), en que:
r = el radio de la columna (diámetro 1 cm),
h = altura del lecho de gel, que se mide con la regla desde la placa porosa que está
situada en parte inferior de la columna hasta la superficie superior de gel.
Para el coeficiente de reparto, Kav:
 Ve y V0 tienen los mismos significados y valores.
 Vt también es el volumen total de lecho, que se determina
experimentalmente mediante el Ve de la vitamina B12, compuesto con una
Mr tan baja, que se introduce en el interior del gel.
Obsérvese que en ambos coeficientes, Vi siempre viene dado por Vt –V0, la diferencia
estriba que en la Kd, la Vt se calcula como el volumen del cilindro de gel, y en la Kav se
determina como el Ve de la vitamina B12.
V0 Vt - V0 Vt
Vo Vt
Vt - Vo
Vi
Mr alta
(Azul Dextrano)
Mr baja
(Vit. B12)
Ve
Mr intermedia
Concentración
Volumen
Vi =
Wr d
Wr + 1
(Vt - V0)

60. ¿Cómo se determinan los límites de separación de la columna de permeación en gel?
Las etapas a seguir son:
· Se tiene la precaución de colocar cuatro tubos de ensayo en la gradilla.
· Se toma la primera muestra constituida por Azul Dextrano y vitamina B12, y se
llevan a cabo cada una de las etapas 2.2 – 2.5 descritas anteriormente.
· Se recogen las siguientes fracciones:
Fracción A: volumen recogido desde que se aplica la muestra hasta que
aparece la primera gota de color azul.
Fracción B: volumen de todas las gotas de color azul.
Fracción C: volumen de fase móvil incolora hasta que aparece la primera
gota de color rosa.
Fracción D: volumen de todas las gotas de color rosa.

61. · Se determinan los correspondientes Ve para ambos compuestos.
- El Ve del Azul Dextrano = V0 = A + B/2.
- El Ve de la Vitamina B12 = Vt = A + B + C + D/2, que se utiliza para el
cálculo de Kav.
· Con la regla se mide la altura de lecho y se calcula el Vt mediante la ecuación 2.
· Se calcula el Vi mediante la ecuación 1, utilizando el Vt calculado anteriormente.
· Se calculan las Kav y Kd para cada una de los componentes.
¿Qué resultados cabe obtener?
· Los valores de los coeficientes de partición del Azul Dextrano y de la Vitamina B12
deben de ser de 0 y 1, respectivamente. Eso quiere indicar que los coeficientes de
partición de proteínas, que tengan unos valores de Mr dentro del rango de
separación del Sephadex G-100, deben de estar comprendidos entre 0 y 1, y por
tanto, los volúmenes de elución de las mismas deben de ser menores que el de la
Vitamina B12 y mayores que el del Azul Dextrano.
· El volumen del pico en el que eluye el Azul Dextrano (volumen B) debe ser menor
que el volumen del pico en el que eluye la Vitamina B12 (volumen D), por lo que el
efecto que produce el paso por la columna de permeación en gel de un compuesto
es un efecto de dilución, como consecuencia del mecanismo de difusión de las
moléculas del compuesto al interior del gel.
¿Cómo calcular los factores de dilución de ambos compuestos?
Mediante la expresión siguiente:
Factor de dilución:
Volumen (ml) del pico de componente / Volumen (ml) de muestra aplicado
4. ¿Cómo se calibra la columna de permeación en gel?

62. La calibración de una columna cromatográfica consiste en establecer una relación lineal
entre los valores experimentales de Kav y el logaritmo de las Mr de una serie de proteínas
patrón de Mr conocidas. En la práctica sólo se va a determinar la recta de calibrado con
dos puntos, puesto que hay en el mercado muy pocas proteínas que sean coloreadas.
Como se ha indicado en el apartado 1, las proteínas que se van a emplear son la
azoalbúmina y la mioglobina. Como se indica en la figura contigua, hay que obtener los
coeficientes de reparto, Kav, de ambas proteínas.
Para ello, hay que:
 Determinar los volúmenes de elución de la azoalbúmina y la mioglobina,
realizando una elución de cada muestra por la columna de permeación, siguiendo
las etapas descritas en 2.2 hasta 2.5. Hay que recordar que el volumen de
muestra a aplicar en la columna es de 4 gotas.
 Calcular los coeficientes de distribución y reparto según se describe en el apartado
3.
 Representar gráficamente los coeficientes de reparto obtenidos frente a los
logaritmos de las masas moleculares de las dos proteínas.
 Calcular la ecuación de la recta.
5. ¿Cómo se determina la masa molecular de la enzima catalasa?
Una vez obtenida la recta de calibrado, la masa molecular de la enzima catalasa se
obtiene por interpolación del valor de la Kav de la enzima en la citada gráfica. Sin
embargo, la determinación del volumen de elución de la catalasa es algo diferente a la
metodología empleada hasta ahora. Los pasos que hay que seguir son los siguientes:
Kav
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
104
5x104 105 Mr

63. Se preparan 10 tubos de ensayo limpios y secos y se rotulan del 1 al 10.
 Se aplican 8 gotas de la solución de catalasa, según el apartado 2.2.
 Se eluye con la fase móvil siguiendo el protocolo establecido en 2.3.
 En cada tubo de ensayo se recogen 15 gotas de eluído.
Kav
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
104
5x104 105 Mr

64.  Para conocer en qué tubo/s eluye la catalasa, se adiciona a cada tubo 5 gotas de
la solución de H2O2 200 mM. Se agitan los tubos y si es preciso se calientan a 37
ºC. La catalasa se encontrará en los tubos en los que se observe la aparición de
burbujas conforme se agita.
 El volumen de elución de la catalasa vendrá dado por la suma de los volúmenes
de los tubos anteriores a los que muestran actividad catalasa más la mitad del
volumen de los tubos que sí contienen catalasa.
 Se calcula la Kav de la catalasa de acuerdo con el apartado 3.
La práctica finaliza cuando:
1. Se mide el volumen que ocupan 15 gotas del eluído de la columna de permeación,
mediante la recogida de 45 gotas de fase móvil en el tubo graduado, la medición
del volumen y su división por tres. Esta operación asegura que la columna queda
lavada y en condiciones para su uso posterior.
2. Se resuelven las preguntas de la evaluación del aprendizaje.
XIII.-PARTE BIBLIOGRAFICA.
 http://www.monografias.com/trabajos19/microorganismos
biodegradantes/microorganismos-biodegradantes.shtml.
 http://www.monografias.com/trabajos15/separacion-mezclas/separacion-
mezclas.shtml#CROMAT.
 D:Mis documentoscromatografiaCROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.htm.
 D:Mis documentoscromatografiacromatografia columna.htm.
 http://www.monografias.com/trabajos10/mese/mese.shtml
 http://www.ingenieroambiental.com/?pagina=592.
 http://www.fq.uh.cu/dpto/qa/cromoweb/que_es_la_cromatografia.htm
 http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy33/jugos04.htm
 http://www.q1.fcen.uba.ar/materias/ai/CGL1.pdf