Este documento describe el desarrollo de nuevos marcadores moleculares basados en genes que se superponen para identificar bacterias de manera específica. Los autores utilizaron la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias de ADN que codifican proteínas superpuestas (MacC-hisH) en cepas de Burkholderia. Demostraron que la PCR es un método eficaz para amplificar estas secuencias y que la superposición de genes es un buen marcador molecular para identificar bacterias.

1. DANIELA MARTÍNEZ RIVERA
SANTIGO MORENO RAMÍREZ
Tercer Semestre
UPB

2. INTRODUCTION
The analysis of microbial genomes allows identification of particular
characteristics in genomes like:
 Species
 Gender
Taxonomy
 Taxonomy: classification of microorganisms by common characteristics
A method for identifying these
characteristics is through molecular
markers

3.  Molecular markers:
They are biomolecules that are associated with a specific trait in
the genome, they can be:
1. Proteins
2. DNA
In this process the DNA was used as
molecular marker through
overlapping genes.
Is the use of two different coding sequences
of genes for the production of multiple
products , this overlap is heritable.
Gender: Burkholderia
 Genome : DNA sequence coding for protein synthesis

4. Why Burkholderia?
Because the Burholderia has a conservative overlap
in the genomes of the complex Burkhoderia cepacia
(Bcc).
In addition…
The burkhodelia is a gram negative bacteria that is
composed of several species with pathogenic capacity
present in cystic fibrosis (CF).
macC
hisH
macC = membrane proteins with a function of multiple antibiotic
resistance.
hisH = Imidazole glycerol phosphate synthase subunit HisH. Lipid
metabolism.

6.  Used methods :
1. MALDI TOF MS: is a soft ionization technique used in mass
spectrometry, allowing the analysis of biomolecules like proteins and
DNA, also allow to identify macromolecules.
2. MLST: Multilocus sequence typing, genetic technique for taxonomic
characterization of bacteria and microorganisms. The procedure
characterizes isolates of microbial species using the DNA sequences of
internal fragments of multiple housekeeping genes.
3. PCR

7. OBJECTIVE
 Develop new molecular markers for
the overlapping genes in order to
specifically identify bacteria.

8. MATERIALES Y MÉTODOS
 Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento:
Origen clínico o ambiental
Cepas involucradas:
1. Cepas Bcc, 18 especies, para identificación previamente se usó recA
(proteína multifuncional capaz de reconocer similitudes en secuencias
de AND).
2. 3 cepas de Ralstonio.
3. 3 cepas de Cupriavidus.
4. Cepas ambientales de diferentes bacterias por CRA-ABP.
5. Cepas de origen clínico de pacientes con FC las cuales fueron recogidas
en una prueba de esputo a través de un cultivo, luego se le aplico MALDI
TOF para la identificación bacteriana, dichos pacientes pertenecían al
Hospital Infantil Anna Meyer.

9.  Medios de cultivo:
1. Cepas Bcc medio agar.
2. Cepas ambientales Medio de cultivo Tryptic soy Agar
(TSA).
3. Cepas de origen clínico de pacientes con FC Medio de
cultivo TSA.

10. PCR ( Reacción en Cadena de la Polimerasa)
Clonación,
Amplificación in vitro de un gen
o fragmento de DNA (directa) o RNA
(indirecta)
Kary Mullis
=
# de copias de
una secuencia
Generalidades:
1. Desnaturalización DNA en hebras sencillas.
2. Alineamiento/Hibridación: Primer’s.
3. Síntesis/Replicación por la DNA Polimerasa (Taq Polimerasa)
a partir de un priemer, dirección 5’-3’.

11. Características:
1. Rendimiento: cada producto sirve de molde para el siguiente.
2. Duración: depende de la secuencia a amplificar.
3. Especialidad: elevada.
4. Capacidad de detección: alta, hasta 1 molécula de DNA en cualquier
tipo de muestra.
5. Fidelidad: copia con precisión y sin mutaciones.

12.  Recuperación MacC-hisH BLAST
programa capaz de comparar una secuencia
problema con una gran cantidad de secuencias que
se encuentren en una base de datos (NCBI)
encontrando así homólogos.
Secuencias problema
1. Burkholderia
2. Ralstonia
3. Capriavidus
Diseño de primers
FOR BURK REV_UN
Reconocen la
superposición

13. RESULTADOS
Fig. 1. Bacterial identification based on the use of overlapping genes.

14. Fig. 3. Las muestras de ADN de electroforesis en gel de
agarosa amplificaron mediante PCR utilizando el
conjunto de cebadores FOR_BURK y REV_UN
a) Ejemplo de los resultados obtenidos para Burkholderia (
muestras 1-12) y las cepas Ralstonia y Cupriavidus (
muestras 13-15) .

15. b ) Ejemplo de los resultados obtenido a partir de una selección de
cepas bacterianas ambientales

16. c ) Ejemplo de los resultados obtenido a partir de una selección
de diferentes patógenos incluyendo cepas de Burkholderia CF .

17. d) Resultados obtenido a partir de 8 muestras directamente
extraídos del esputo de pacientes con FQ, positivo
resultados sólo para la muestra 6. M = GeneRuler 1 kb
escalera del ADN ( Thermo Scientific )

18. DISCUSIÓN
Agree Desagree

20. CONCLUSIONS
1. The overlapping proved a good molecular marker for
bacterial identification.
2. The PCR is an efficient and accurate method for
amplification of specific sequences of DNA that were
necessary in this case for bacterial identification.
3. The PCR is a good specific molecular marker and it can
give us a new way to recognize organisms with similar
genes.
4. Although two gens could be overlappings that not mean
they are from the same cluster.