Este documento describe el método de observación de microorganismos a través de la técnica en fresco. Se detalla el procedimiento para realizar preparaciones microscópicas en fresco de una muestra de agua estancada y una suspensión de Bacillus subtilis. Las preparaciones permitieron observar varias algas y la bacteria Bacillus subtilis, la cual se presenta en cadenas debido a la presencia de esporas. El documento concluye que el agua estancada no es apta para consumo humano y que Bacillus subtilis tiene la habil

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
Método de Observación de los
Microorganismos
Técnica en Fresco
CURSO:
Laboratorio deMicrobiología.
DOCENTE:
Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz
GRUPO:
“C”
ALUMNA:
Aburto Rodríguez Ruddy
2012

2. TÉCNICA EN FRESCO 2
I.
OBJETIVO:
Describir las principales características morfológicas diferenciales
de los microorganismos a través de la realización de preparaciones
microscópicas en fresco.
Aprender a emplear correctamente el microscopio.
II.
FUNDAMENTO TEÓRICO:
MÉTODO DE OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
TÉCNICA EN FRESCO
La totalidad de los organismos unicelulares por su pequeño tamaño son
imperceptibles para el ojo humano y para observarlos es necesario el uso del
microscopio compuesto de la luz convencional. La observación microscópica
puede efectuarse mediante el examen en fresco de una suspensión microbiana, o
bien mediante un preparado coloreado.
Hay dos métodos generales en fresco:
Las técnicas de gota pendiente o suspendida.
Esta preparación se realiza colocando una gota de la suspensión bacteriana en un
cubreobjetos en el cual se ha hecho previamente un círculo con vaselina o
parafina (a). La vaselina actúa como sellador. (b) Sobre el cubreobjetos se
coloca un portaobjetos con una excavación central que queda adherido gracias a
la vaselina (c). Se invierte la preparación y se observa colocándola en la platina
del microscopio (d). Las preparaciones en gota pendiente se utilizan para
observar microorganismos vivos.

3. TÉCNICA EN FRESCO 3
III.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Para latécnica de observación en fresco empleamos los siguientes
materiales:
Material biológico:
Agua estancada (de un charco).
Suspensión de Bacillus sp.
Suero fisiológico.
Alimentos:
Mechero de alcohol
Asa de siembra.
Pipeta serológica o pipeta Pasteur
Laminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos
Microscopio compuesto de luz convencional
METODOLOGÍA:
El examen en fresco de una muestra de agua estancada permite observar
microorganismos vivos y ciertas actividades biológicas, como la movilidad, así
como determinar la morfología.
Este examen, en fresco, se utiliza principalmente para la visualización de hongos
unicelulares, protozoos y helmintos, sin embargo, también es posible observar
bacterias.
En algunas ocasiones es de gran utilidad añadir previamente en el portaobjeto
una gota de azul de metileno o de tinta china dependiendo de los
microorganismos a estudiar, facilitando la observación.
Para la observación de los preparados en fresco es necesario el uso del
microscopio óptico común con su adecuado manejo (regular: a baja intensidad
de luz, diafragma cerrado, condensador abajo), microscopio de contraste de fases
o de campo oscuro.
La ventaja de este método de observación es su rapidez. Las desventajas son:
falta de contraste y resolución, requiere de entrenamiento.
Montaje húmedo
1. Con una pipeta serológica o pipeta Pasteur tomar una gota de la muestra de
agua estancada y depositarlo sobre la lámina portaobjeto
2. Con el asa de siembra previamente esterilizada por flameado directo del
mechero tomar una asada de la suspensión bacteriana y depositarlo sobre la
lámina portaobjeto.
3. Cubrir con la laminilla cubreobjetos cada preparado. Para evitar la
formación de burbujas debe depositarse primero una arista de la laminilla y
luego el resto de él
4. Observar a mediano y mayor aumento, 10x y 40x respectivamente y
esquematizar lo observado.

4. TÉCNICA EN FRESCO 4
IV.
RESULTADOS:
1. Agua estancada:
Muestra:
agua estancada
Preparado :
Montaje húmedo
Coloración:
no
Aumento :
40X
Descripción:
se puede observar
que la muestra presenta algunas
algas de color verde; tiene forma
phytoconis de color verde brillante.
Phytoconis
2. Suspensión microbiana:
Formación
en cadenas
Esporas
Muestra: suspensión bacteriana
Preparado :
Montaje húmedo
Coloración:
no
Aumento :
10X y 40X
Descripción:
se puede apreciar
la bacteria Bacillus subtilis, de
color verdes refringentes.
Microorganismo
agrupado
en
cadenas por filamentos largos. Tiene
estructura brillante debido a la
presencia de esporas que está en la
célula vegetativa.
Bacillus subtilis
Clasificación científica
Reino:
Bacteria
Filo:
Firmicutes
Clase:
Bacilli
Orden:
Bacillales
Familia:
Bacillaceae
Género:
Bacillus
Especie:
B. subtilis

5. TÉCNICA EN FRESCO 5
V.
DISCUSIÓN:
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos
vivos. Los aumentos mayores revelan progresivamente más detalle de
una porción de campo menor. La muestra observada en el microscopio
fue vista con un objetivo de 40x, lo cual limita la observación y no
permite
aumentar
el
contraste
de
la
preparación.
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis.
La calidad microbiológica del agua para consumo humano en el Perú es
evaluada principalmente mediante la detección y enumeración de
coliformes (ITINTEC, 1987). Debemos considerar que el cloro es uno de
los causantes de la injuria bacteriana y que la bacteria puede protegerse
del cloro mediante elementos inertes o una capa fina de polisacáridos
en las biopelículas. Es importante saber que las aguas estancadas
contiene gran número de bacterias; las cuales evitan su uso doméstico.
Sistemas de abastecimiento y distribución de agua (SADA), 2001.
Bacillus subtilis se ha mostrado muy manejable para la manipulación y
se ha hecho, extensamente adoptado como unorganismo modelo para
estudios de laboratorio, sobre todo de esporulación, que es un ejemplo
simplificado de la diferenciación celular. En la observación por la
técnica de observación en seco se demostró que es un microorganismo
de fácil manejabilidad y de óptimos resultados en cuanto a la
observación.Madigan M; Martinko, 2005.
VI.
CONCLUSIÓN:
Se aprendió a usar el microscopio correctamente, así como sus partes.
El agua estancada tiene agentes patógenos: bacterias, virus,
protozoarios y parásitos que entran al agua proveniente de desechos
orgánicos. De lo observado en la muestra se concluye que el agua
estancada es considerada no apta para consumo humano y que por el
contrario constituye un riesgo para la salud de los usuarios.
Bacillus subtilis tiene la habilidad para formar una resistente
endospora protectora, permitiendo al organismo tolerar condiciones
ambientalmente extremas.

6. TÉCNICA EN FRESCO 6
VII.
CUESTIONARIO:
1. ¿Por qué el asa de siembra debe esterilizarse al mechero antes de
tomar la muestra de la suspensión bacteriana? ¿Porque no se
hace lo mismo en caso de la pipeta?
El asa de siembra debe esterilizarse al mechero Para que no pueda
contaminar la muestra y para desinfectarlo, como se puede apreciar
en las imágenes,
No se puede hacer lo mismo con la pipeta ya que es impermeable al
vapor, se realiza por esterilización por calor seco.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO:La muerte microbiana
se produce por una esterilización, ya sea como consecuencia
de mecanismos de transferencia de energía, además de la
oxidación.
En la esterilización por Calor seco existe una destrucción de los
microorganismos oxidando sus constituyentes químicos,
desnaturalizando las proteínas y los ácidos nucleicos de las
células así como fragmentando las membranas celulares.
Para materiales que deben permanecer secos como ciertos
instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de petri,
pipetas, así como aceites, polvos (por ser impermeables al
vapor)
2. ¿Para qué es útil un montaje húmedo?
La ventaja de esta técnica, es que la preparación no se seca y puede
ser observada durante un tiempo más largo.

7. TÉCNICA EN FRESCO 7
3. ¿Explique en que se fundamenta el hecho de que todo preparado
en fresco debe ser observado a baja intensidad de luz, diafragma
cerrado y condensador abajo?
El camino de la luz en el microscopio compuesto. La lente de luz
está en la base. El condensador enfoca el haz de luz sobre el
espécimen, donde parte se absorbe, parte se refracta, y parte se
transmite. La luz transmitida penetra en la lente objetivo, que
aumenta la imagen. El prisma hace que la imagen se forme en el
tubo del microscopio, haciendo la visión más cómoda. La lente
ocular vuelve a aumentar la imagen y la enfoca en el ojo.
Todo preparado en fresco debe ser observado a baja intensidad de
luz, diafragma cerrado y condensador abajo, porque si ingresa
mucha luz no se va a poder ver la muestra, ya que la laminilla es
demasiado delgada.
4. ¿Qué grupos de microorganismos existen en una muestra de
agua estancada? es posible diferenciar microorganismos
procariotas y eucariotas.
Agentes patógenos: bacterias, virus, protozoarios y parásitos que
entran al agua proveniente de desechos orgánicos.
Desechos que requieren oxígeno: los desechos orgánicos pueden ser
descompuestos por bacterias que usan oxígeno para biodegradarlos.
Si hay poblaciones grandes de estas bacterias, pueden agotar el
oxígeno del agua, matando así las formas de vida acuáticas.

8. TÉCNICA EN FRESCO 8
Sustancias químicas inorgánicas: ácidos, compuestos de metales
tóxicos (mercurio, plomo) que envenenan el agua.
Los nutrientes vegetales que pueden ocasionar el crecimiento
excesivo de plantas acuáticas que después mueren y se
descomponen, agotando el oxígeno del agua y de este modo causan
la muerte de las especies marinas (zona muerta).
Sustancias químicas orgánicas: petróleo, plásticos, plaguicidas y
detergentes que amenazan la vida.
Sedimentos o materia suspendida: partículas insolubles de suelo
que enturbian el agua, y que son la mayor fuente de contaminación.
Sustancias radiactivas que pueden causar defectos congénitos y
cáncer.
Calor: ingresos de agua caliente disminuyen el contenido de
oxígeno y hace a los organismos acuáticos muy vulnerables
Si es posible diferenciar microorganismos procariotas y eucariotas
en el agua estancada ya que los procariotas son mucho más
pequeños que los eucariotas.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
Madigan M; Martinko J. 2005. Brock Biology of Microorganisms, 11th
ed., Prentice.
Organización Panamericana de la Salud (1985). Guías para la calidad
del agua potable vol. 1. Washington D.C.
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis
http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/htm