Este documento describe un estudio de laboratorio que involucra la realización de tinción diferencial, tinción de Gram y tinción de Ziehl-Neelsen a muestras de bacterias obtenidas de un medio ambiente. Se aislaron tres cepas bacterianas distintas y se clasificaron como cocos Gram negativos, bacilos Gram negativos y bacilococos Gram negativos tras aplicar la tinción de Gram. El documento también explica conceptos clave sobre la morfología bacteriana y los diferentes tipos de tinción.

1. DETERMINACIÓN DE FLORA AMBIENTAL, MORFOLOGÍA
BACTERIANA, TINCIÓN SIMPLE, TINCIÓN DIFERENCIAL Y
SELECTIVA
Montes Alfredo; Palmeth Carlos; Quintana Adriana.
Universidad De Cartagena
Facultad De Ciencias Exactas y Naturales
Programa de Biología
Microbiología
RESUMEN
Este trabajo de laboratorio se basó en la realización de pruebas de extendidos o
frotis a partir de un cultivo de microorganismos, las cuales se sometieron a
diferentes tipos de tinción como fue la tinción de diferencial, la tinción de
ZiehlNeelsen y la tinción de Gram; además se hizo la clasificación de bacterias por
medio de tinción de Gram las cuales se clasificaron en Gram positivas (+) o Gram
Negativas (-).
Palabras clave: Tinción diferencial, Bacterias Gram positivas, Bacterias Gran
negativas, Frotis, extendidos.
ABSTRACT
This work of laboratory was based on the accomplishment of tests of extended or
smear from a culture of microorganisms, which surrendered to different types of tint
since it was the tint of differential, ZiehlNeelsen's tint and Gram's tint; the
classification of bacteria was done to others by means of Gram's tint which
qualified in positive Gram (+) or Gram Negativas (-).
Keywords: Differential tint, Bacteria positive Gram, Bacteria Great denials, Smear,
extended.
INTRODUCCIÓN
La morfología bacteriana debe
considerarse desde dos puntos de
vista:
 como células individuales
observables sólo al microscopio y
 como colonias bacterianas
apreciables a simple vista
después de desarrollarse en la
superficie de medios de cultivo
sólidos.
Las diferencias en el tamaño, forma y
ciertos detalles estructurales son
características de los principales

2. grupos de bacterias, y proporcionan
las bases fundamentales para su
estudio sistemático e identificación.
De la misma forma, las colonias
bacterianas, compuestas por masas
de células individuales, tienen
características de tamaño,
consistencia, textura y color que
poseen un valor sistemático, pero no
tienen la importancia fundamental de
la morfología celular.
Por otra parte el tamaño de las
células bacterianas se mide
habitualmente en micrómetros,
oscilando entre los 1 x 10 µm de los
bacilos grandes como
Bacillusanthracis, y los 0,2 x 0,7 µm
de Francisellatularensis. Existen
ligeras variaciones de tamaño de las
células bacterianas dentro de algunas
especies, siendo mayores las
fluctuaciones entre las formas
bacilares que entre las formas
esféricas. Los límites de tamaño entre
las células bacterianas y los virus no
tienen una frontera bien definida,
pues curiosamente existen virus más
grandes que ciertas bacterias.
Desde el punto de vista microscópico,
la diferencia más importante entre las
bacterias es su forma, existiendo tres
tipos morfológicos claramente
distinguibles:
Formas esféricas o cocos.
Formas alargadas o bacilos.
Formas curvadas, comas o espirilos
Cocos:Las bacterias esféricas son las
más homogéneas con respecto al
tamaño, presentando un diámetro
medio de 0,6 a 1,0 µm. La forma no
siempre es exactamente esférica,
observándose como más comunes
las siguientes variaciones:
Formas lanceoladas.
Formas en grano de café.
Formas cocobacilares (achatadas)
Las diferencias entre los subtipos de
cocos se basan en los agrupamientos
celulares. Estos aparecen como
consecuencia de dos factores: el plano
o planos de división celular y la
tendencia de las células hijas a
permanecer unidas entre sí, una vez
que se completa la división. Los
cocos que se separan completamente
después de la división aparecen
individualmente, esta forma se le llama
coco. Cuando hay una ligera
tendencia a que las células hijas
permanezcan unidas y la división
celular ocurre en un solo plano, los
cocos se agrupan predominantemente
en pares, llamados diplococos. Si la
unión es más marcada, se ven largas
cadenas de cuatro cocos o más; estos
agrupamientos se conocen como
estreptococos. Cuando los cocos se
dividen en varios planos, y hay una
elevada tendencia a que permanezcan
unidos, aparecen racimos irregulares
de cocos, semejantes a racimos de
uvas; estos agrupamientos se
denominan estafilococos. Sin
embargo, la separación de subtipos

3. morfológicos no es absolutamente
nítida, y en una misma colonia pueden
observarse cadenas o racimos junto
con formas aisladas o en parejas. A
pesar de todo esto, los grupos
morfológicos tienen mucho valor
práctico en la identificación y
clasificación de cocos.
Bacilos:Las formas alargadas o
bacilares agrupan una gran cantidad
de subtipos morfológicos. Las
diferencias en anchura, longitud y
forma de los extremos de la célula
proporcionan una
considerableheterogeneidad a la
forma bacilar. En función de la
tendencia de las células hijas a
permanecer unidas, los bacilos
presentan también agrupaciones
celulares características, los
agrupamientos de células bacilares
no tienen la misma importancia
morfológica que el agrupamiento de
cocos.
Espirilos:El tercer tipo morfológico es
la forma espirilar, que puede
considerarse como un bacilo que se
ha torcido adoptando la forma de
hélice. Aunque la curvatura se
observa ocasionalmente en muchas
formas bacilares, en el género Vibrio
es suficientemente constante como
para tener importancia diferencial.
Los vidrios pueden presentar una
forma espirilar si las células
permanecen unidas por sus
extremos. Las verdaderas bacterias
espirilares pueden ser de dos tipos:
con espira rígida o con espira flexible.
Al conjunto de las formas espirilares
flexibles se le conoce como
espiroquetas. La clasificación y
diferenciación de las espiroquetas
patógenas se basa en criterios
morfológicos tales como la longitud
de vuelta, el ángulo en los extremos
de la célula, la presencia de una
envuelta externa y la composición del
filamento axial. (Gustavo A. 2010)
METODOLOGÍA
Marzo 18:En una caja de Petri se
agregó agar nutrido y se expuso al
medio para que bacterias en el aire
se pudieran adherir al agar. Esto fue
echo en una zona de mucha
concurrencia de personas, una zona
comercial. Luego se rotulo la caja de
Petri y se dejo durante 24 horas en
una incubadora a 37⁰C.
Marzo 19:A las 24 horas de
incubación se revisó la caja de Petri,
luego se tomó una nueva caja de
Petri y con un asa esterilizada, se
dividió el agar y se realizó una
siembrade las cepas que habían
crecido en la caja de Petri expuesta al
medio a las cuales se les llamó cepa
1,2,3. Luego en cada una de las
secciones de agar de la nueva caja
de Petri. Esta se llevó a la incubadora
nuevamente a 37⁰C.
Marzo 21:Se hizo crecimiento por
siembra masiva de las Cepas 1, 2, 3
incubadas el día 19 de marzo.
Marzo 25:Se hizo replique de las
cepas 1, 2, 3 bacterianas, para luego

4. hacer crecimiento por agotamiento
debido a que las bacterias ya habían
pasado la fase de meseta e iban en
disminución, esto debido a que se
habían agotado los nutrientes
disponibles en ese agar.
Marzo 26:sSe aplicó tinción de Gram
a tres tipos de bacterias y se procedió
a mirar en el microscopio en el
objetivo de 100X.
Por otro lado se tomó una muestra de
frotis bucal y se le aplicó una tinción
selectiva.
RESULTADOS
Pasada 24 horas después de exponer
el agar al medio, se pudo observar el
crecimiento de diferentes tipos de
bacterias, esto se determinó juzgando
las características de crecimiento
macroscópico de la colonia y la
textura de esta misma. Una era
mocosa y todas crecían en círculos
(figura 1).
Posterior a esto el día 21 de marzo, al
realizar la nueva siembra se observó
el crecimiento de las cepas 1, 2, 3 por
separado (figura 2 y 3).
Figura 1. Crecimiento luego de 24
horas de varios tipos de bacterias
luego de exponer el agar al medio.
Figura 2. Crecimiento de cepas
mucosa.
Figura 3. Crecimiento de cepas
diferentes.

5. El 26 de marzo al terminar la tinción
pudimos obtener como resultados de
la tinción de la primera cepa cocos
gram negativos (figura 4), de la
segunda cepa bacilos gram negativos
(figura 5) y finalmente de la tercera
cepa se obtuvo bacilococosgram
negativos (figura 6). En la tinción
selectiva no se obtuvo resultado
alguno debido a que no se dejó
suficiente tiempo con el colorante
safranina.
Figura 4. Cepa 1, cocos Gram
negativos.
Figura 5. Cepa 2, bacilos Gram
negativos.
Figura 6. Cepa 3, bacilococos Gram
negativos.
DISCUSIÓN
Los ambientes exteriores o interiores
se encuentran un gran número de
partículas de diferente origen, forma y
tamaño, teniendo en cuenta el origen
(biológico, orgánico, inorgánico), la
localización (marina, continental,
rural, industrial, urbana) y el efecto
que pueden causar sobre las
superficies en que se depositan
(químicos, tóxicos, patogénicos,
degradatvo) (Mandrioli, 2002).
La determinación de la microbiota
ambiental de un lugar altamente
concurrido y en el cual el periodo de
exposición de la caja de Petri fue
aproximadamente 15 minutos, nos
fue posible gran crecimiento de
bacterias, teniendo en cuenta que las
características macroscópicas de
estas colonias eran diversas unas
respecto a otras.
Al comparar los resultados obtenidos
en los cultivos de las diferentes cepas

6. obtenidas con los expuestos por
Borrego et al.; podemos determinar
que en los medios exteriores y en el
aire normalmente podemos encontrar
gran diversidad de bacterias las
cuales pueden ser indispensables en
procesos naturales como pueden
encontrarse cepas patógenas. Sin
embargo que en gran proporción
podemos encontrar diversos tipos de
bacilos, cocos gram negativos en
ambos casos, dentro de lo cual
debemos se sabe que las cepas de
bacterias Gram negativas pueden ser
productoras de endotoxinas que
están compuests por
lipopolisacáridos relacionados con la
membrana bacteriana y al inhalase
desencadenan irritación de las
muscosas del sistema respiratorio
causando diversas enfermedades de
tipo respitario (Yang, 2003).
CONCLUSIÓN
Se aprendieron las técnicas de
coloración mediante las cuales se
clasifican la mayoría de las bacterias,
además se llevo a cabo el
reconocimiento de bacterias Gram
positivas la cuales dieron un color
violeta y las Gram negativas dieron
un color rosado usando la tinción de
Gram. Cabe resaltar que se
adquirieron conocimiento de cómo
elaborar extendidos o frotis a partir de
cultivos de microorganismos
BIBLIOGRAFÍA
Borrego, S. Perdomo, I. De la Paz, J.
Gómez de Saravia, S. Guiamet, P.
2011. Relevamiento microbiológico
del aire y de materiales almacenados
en el Archivo Histórico del Museo de
La Plata, Argentina y en el Archivo
Nacional de la República de Cuba.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA
PLATA. Sección Botánica, 18 (119):
1-18. La Plata, Argentina.
Díaz Martín, G. Centro de Formación
Profesional Instituto Villaverde Curso
2009-2010 Pigmentación:
Fundamentos y técnicas de análisis
microbiológicos Morfología y
estructura bacteriana - 9 Laboratorio
de Diagnóstico Clínico. 2º curso U.T.
12 - 1 Bloque temático III.
Mandrioli, P. 2002. Bioaerosol and
Biodeterioration. Science and
Technology for Sustainable Protection
of Cultural Heritage. Technical Notes
for Session 78. UCL Center for
Sustainable Heritage London, UK.
Yang, C.S. 2004. Endotoxins.
Aerotech P & K
(AerotechLaboratorios, Inc. and P & K
Microbiology Services, Inc.) Version
2003-1.
PREGUNTAS
1. ¿Qué es un frotis y para que se
utiliza?
R/ Es una prueba que consiste en
tomar muestras de las células de un
tejido corporal, membrana o líquido el
cual se utiliza para la determinación
de organismos microscópicos, la
muestra se extiende en un

7. portaobjetos la muestra lo que facilita
la observación de los
microorganismos en el momento de
la tinción.
2. ¿Qué es una tinción?
R/ Una tinción es una técnica auxiliar
utilizada en microbiología para
mejorar el contraste en la imagen
vista al microscopio. Los colorantes y
tinturas utilizadas son sustancias que
se utilizan para resaltar estructuras
en tejidos biológicos que van a ser
observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios.
3. ¿Qué estructura permite la
coloración de las bacterias?
R/ la pared bacteriana, la cual
presenta en bacterias Gram positivas
cuya pared está formada por varias
capas superpuestas de
peptidoglicano y en la cara externa se
encuentran polisacáridos y otras
moléculas de ácidos teicoicos los
cuales adquieren color violeta oscuro
de la tinción de Gram; y en bacterias
Gram negativas la pared está
formada por una sola capa de
peptidoglicano, sobre la que se
encuentra una bicapa lipídica y
proteica conocida como membrana
externa, donde adquieren color rojo o
fucsia de la tinción de Gram
4. ¿Cuáles géneros no pueden ser
coloreados por la tinción de
Gram?¿Cuál es la razón de ello?
R/ Los géneros de bacterias los
cuales no pueden ser teñidos por la
tinción de Gram son los siguientes:
Mycobacterium y Nocardia.
Esto se da debido a una propiedad
física de algunas bacterias a la
resistencia de la coloración de la
fucsina la cual penetra a la bacteria
por acción del fenol, a lo cual se le
llama Acido-alcohol resistencia.
5. ¿Qué reacción de Gram darán
resultados los cultivos de levaduras?
¿estos resultados tendrán la misma
importancia que para las
bacterias?¿por qué?
R/
6. ¿Qué es un mordiente? Mencione
ejemplos.
R/ Es una sustancia que se utiliza en
una coloración para hacer más sólida
la unión entre el colorante y el
sustrato a teñir. El uso de los
reactivos mordientes es
imprescindible en aquellos casos en
que la materia orgánica se muestra
refractaria a los colorantes.
Ejemplos: IODO, ácido tánico
7. De ejemplos de 3 bacterias Gram
positivas y 3 bacterias Gram
negativas.
R/ Gram Positivas: Staphylococcus
Aureus, Streptococcus Phogenes,
streptococcus Agalactiae.
Gram Negativas: Bacillus Antracis,
Escherichia Coli, Salmonella Typhy.