hibridacion de ADN

1. HIBRIDACION DE
ÁCIDOS NUCLEICOS
ZHARICK OROZCO
CHRISTIAN SÁNCHEZ

2. HIBRIDACIÓN DE ADN
• Construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos
monocatenarios, usando la complementariedad de bases
Mediante dos procesos desnaturalización y renaturalzacion
- Homoduplex ADN-ADN o ARN-ARN
- Heteroduplex ADN-ARN

3. La hélice de doble cadena (ADN)
se separa mediante un proceso
físico (calor) o químico (con una
base fuerte, como la sosa cáustica-
NAOH). Esto rompe los enlaces
por puente de hidrógeno que
mantienen unidas las dos hebras
del ADN.
Las dos hebras complementarias
se separan, el ADN
se desnaturaliza.
Una muestra de cadenas simples
(o desnaturalizadas) se mezcla
con otra muestra de cadenas
simples.

4. ALGUNOS FACTORES QUE
INFLUYEN
• Temperatura
• PH y productos químicos
• Concentración
• Tamaño de la sonda (ADN)
• Tiempo de hibridación

5. MÉTODOS
• FASE LIQUIDA
- DESNATURALIZACION
ADN pierde su estructura tridimensional ya sea por agentes químicos
o físicos
Este proceso es útil como base
Para los procesos de hibridación

6. MÉTODO DE NORTHEM BLOT
• Permite determinar la cantidad y tamaño de ARN específicos
presentes en preparaciones de ARN total, mensajero, o
ribosómico
- Se ha utilizado para mostrar la sobre expresión de ADN o
desregulación de genes
Supresores tumorales en
Células cancerosas cuando
Son comparados con
Tejidos normales

7. SOUTHERN BLOT
• Esta técnica se ha empleado para el diagnóstico y
caracterización de diversas patologías
• esta técnica se utiliza para analizar secuencias de ADNs
foráneos, introducidos en el genoma vegetal

8. • - El ADN vegetal es extraído de las células y digerido con una ó más
enzimas de restricción.
• - Los productos de la digestión del ADN son separados de acuerdo a su
tamaño, mediante electroforesis en geles de agarosa.
• - El ADN, que ahora se encuentra en el gel, es desnaturalizado, y
transferido a una membrana de nitrocelulosa. Las posiciones relativas de
los fragmentos de ADN en el gel se mantienen cuando el ADN es
transferido a la membrana.
• - El ADN es fijado a la membrana mediante la exposición a la luz
ultravioleta, o por medio de altas temperaturas (80ºC).
• - El ADN ligado a la membrana es hibridado con una sonda de ADN ó
ARN, que posee homología con la secuencia de interés. La posición de
los fragmentos homólogos a la sonda puede ser detectada mediante
autor radiografía o colorimetría, dependiendo del tipo de sonda
utilizada.

10. DOT BLOT Y SLOT BLOT
• Procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es
sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana
• Este tipo de prueba es muy útil cuando se quieren estudiar gran número de
muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer información sobre el tamaño
de las bandas del ARN hibridado.

11. HIBRIDACION DE COLONIAS
BACTERIANAS
• Método empleado para identificar colonias bacterianas que contengan
determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés
• consiste en sembrar los clones sobre placas
de Petri con agar para después de crecidos
transferirlos a membranas de nylon o
nitrocelulosa y luego realizar la hibridación

12. HIBRIDACIÓN IN SITU
• Se basa en la unión recíproca de una secuencia de oligonucleótidos (la
sonda), con una secuencia complementaria de nucleótidos presente en las
moléculas de ARN o ADN dentro del tejido
• Esta técnica es muy útil,
por ejemplo, para identificar
la secuencia de
nucleótidos, en Determinadas
enfermedades de origen
genético

13. CHIP DE ADN
• En el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la miniaturización de los
filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices microscópicas en forma
de chip de ADN.
• De esta manera se pueden colocar en una matriz una inmensa cantidad de copias
génicas diferentes y mediante un proceso de hibridación detectar todas aquellas
que tienen una secuencia parecida. Modificando las características de las
moléculas presentes en la matriz así como cambiando las sondas utilizadas, las
posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los chips de ADN son
enormes.

14. APLICACIONES
• Algunas de sus aplicaciones más frecuentes son:
• Estudio de genes, que se expresan diferencialmente en
condiciones diversas (sanos/enfermos,
mutantes/salvajes, tratados/no tratados).
• Clasificación molecular en enfermedades complejas.
Identificación de genes característicos de una patología
• Predicción de respuesta a un tratamiento
• Detección de mutaciones y polimorfismos de un único
gen (SNP)