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             INMUNOLOGIA



Electroforesis en Campos Pulsantes




                PRESENTAN: Francisco Archundia Camacho
                                  Alfredo Ramírez Moran
                              Heriberto Ramírez Morales
¿Qué es la        método en el que se utiliza una
                  corriente eléctrica controlada
electroforesis?   con la finalidad de separar
                  biomoléculas según su tamaño
                  y carga eléctrica a través de
                  una matriz gelatinosa.
Moléculas
                                 Campo eléctrico
    ionizadas



Atracción hacia el   Moléculas
                                                   Cátodo-
polo opuesto         positivas
                     Moléculas
                                                   Ánodo+
                     negativas
FUERZAS
ADICIONALES


                                   Dificulta el
   Fricción con el disolvente      movimiento


   Movimiento Browniano             temperatura

                                     Difusión



    Moléculas no migran de forma        Se forma un frente
            homogénea
Para reducir la anchura del frente…

                  Se reduce el movimiento de
                  las moléculas empleando un
                     medio que oponga mas
                       resistencia a dicho
                          movimiento




                               GEL


   la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el
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Polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y
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Electroforesis en Gel de
Campos Pulsantes (PFGE)
• Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un
  sistema denominado electroforesis en gel de
  campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron
  separar cromosomas de levadura de varios
  cientos de kpb.
• La PFGE consigue la separación de grandes
  fragmentos de DNA induciendo su reorientación
  mediante cambios periódicos en el campo
  eléctrico, cuya duración determina el intervalo de
  tamaños que se pueden separar (cuanto mayor
  sea el tamaño de los fragmentos a separar, mayor
  ha de ser la duración de los campos aplicados).
• En una Electroforesis en Gel de Campos
  Pulsantes (PFGE), los fragmentos se someten a
  varios campos eléctricos de distinta orientación.
• Al aplicarse el primero (E1) durante cierto
  tiempo, los fragmentos se estiran y se orientan
  según la dirección de dicho campo.
• Si ahora se aplica un segundo campo (E2),
  perpendicular al anterior, se obliga a los
  fragmentos de DNA a relajarse y elongarse y
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  eléctrico.
• Cuanto menos tarde una molécula en
  reorientarse, antes migra en la dirección de E2;
  el tiempo que se consume en esta reorientación
  depende del tamaño de los fragmentos,
  tardando más los mayores.
• Aplicando sucesivos cambios de campo
  eléctrico (E1/E2/E1/E2/E1/E2 etc.) se
  consigue la separación de los fragmentos en
  función de su tamaño.
• El ángulo α que forman las direcciones de los
  campos eléctricos E1 y E2 se denomina
  ángulo de reorientación, y determina lo que
  deben “girar” los fragmentos de DNA cada
  vez que cambia la orientación del campo.
• Normalmente se utilizan ángulos >100°;
  cuando se opera a un ángulo fijo, éste es de
  120°, aunque si el dispositivo permite
  seleccionar diferentes ángulos, se trabaja
  entre 100° y 120°; esto es particularmente
  útil para la separación de fragmentos muy
  grandes de DNA (>2Mb).
• La duración de los campos eléctricos que se
  alternan se denomina duración del pulso y
  determina el intervalo de los tamaños de
  DNA que se pueden separar; estos intervalos
  son muy variables, desde fracciones de
  segundo para fragmentos muy pequeños
  hasta 1-2 horas para fragmentos muy
  grandes (>5Mb).
• Para una duración de pulso dada, aquellos
  fragmentos de gran tamaño que no hayan
  tenido tiempo a reorientarse en la nueva
  dirección del campo no se separan, pero no
  permanecen inmóviles en el gel; se mueven
  muy lentamente, pero juntos, sin resolverse
  en bandas distintas y aparecen como una
  zona más o menos ancha en la parte superior
  del gel; dicha zona se denomina zona de
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• Es importante destacar que la utilidad de la
  PFGE es análoga a la de la electroforesis
  convencional, salvo que los fragmentos de
  DNA separados son de mayor tamaño.
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  no pueda hacerse directamente, ya que para
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  DNA o de cromosomas enteros pequeños.
• El equipo necesario para realizar una PFGE se
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  un par, cuya disposición y diseño posibilitan las
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  corrosión de los mismos.
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  los ya descrito para otras electroforesis de DNA; se
  utilizan geles de agarosa al 0,5-1,0% (20×20 ó 15×15
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  resistencia
• La preparación y aplicación de la muestra es la fase más
  delicada de la PFGE por el gran tamaño de las estructuras que
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  suele cargarse en el gel como una disolución concentrada (de
  mucha viscosidad), junto con agarosa fundida o embebido en
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  DNA a analizar y de la naturaleza de la muestra.
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Electroforesis en campos pulsantes

  • 1. INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL HOSPITAL GENERAL DE ZONA No. 32 “VILLA COAPA” CARRERA PROFESIONAL T.L.C. INMUNOLOGIA Electroforesis en Campos Pulsantes PRESENTAN: Francisco Archundia Camacho Alfredo Ramírez Moran Heriberto Ramírez Morales
  • 2. ¿Qué es la método en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada electroforesis? con la finalidad de separar biomoléculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa.
  • 3. Moléculas Campo eléctrico ionizadas Atracción hacia el Moléculas Cátodo- polo opuesto positivas Moléculas Ánodo+ negativas
  • 4. FUERZAS ADICIONALES Dificulta el Fricción con el disolvente movimiento Movimiento Browniano temperatura Difusión Moléculas no migran de forma Se forma un frente homogénea
  • 5. Para reducir la anchura del frente… Se reduce el movimiento de las moléculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento GEL la migración electroforética de las moléculas será mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se vera reducido también Polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos
  • 6. Electroforesis en Gel de Campos Pulsantes (PFGE) • Schwartz y Cantor desarrollaron en 1984 un sistema denominado electroforesis en gel de campo pulsante (PFGE) con el que consiguieron separar cromosomas de levadura de varios cientos de kpb. • La PFGE consigue la separación de grandes fragmentos de DNA induciendo su reorientación mediante cambios periódicos en el campo eléctrico, cuya duración determina el intervalo de tamaños que se pueden separar (cuanto mayor sea el tamaño de los fragmentos a separar, mayor ha de ser la duración de los campos aplicados).
  • 7. • En una Electroforesis en Gel de Campos Pulsantes (PFGE), los fragmentos se someten a varios campos eléctricos de distinta orientación. • Al aplicarse el primero (E1) durante cierto tiempo, los fragmentos se estiran y se orientan según la dirección de dicho campo. • Si ahora se aplica un segundo campo (E2), perpendicular al anterior, se obliga a los fragmentos de DNA a relajarse y elongarse y alinearse de acuerdo con este segundo campo eléctrico. • Cuanto menos tarde una molécula en reorientarse, antes migra en la dirección de E2; el tiempo que se consume en esta reorientación depende del tamaño de los fragmentos, tardando más los mayores.
  • 8. • Aplicando sucesivos cambios de campo eléctrico (E1/E2/E1/E2/E1/E2 etc.) se consigue la separación de los fragmentos en función de su tamaño. • El ángulo α que forman las direcciones de los campos eléctricos E1 y E2 se denomina ángulo de reorientación, y determina lo que deben “girar” los fragmentos de DNA cada vez que cambia la orientación del campo. • Normalmente se utilizan ángulos >100°; cuando se opera a un ángulo fijo, éste es de 120°, aunque si el dispositivo permite seleccionar diferentes ángulos, se trabaja entre 100° y 120°; esto es particularmente útil para la separación de fragmentos muy grandes de DNA (>2Mb).
  • 9. • La duración de los campos eléctricos que se alternan se denomina duración del pulso y determina el intervalo de los tamaños de DNA que se pueden separar; estos intervalos son muy variables, desde fracciones de segundo para fragmentos muy pequeños hasta 1-2 horas para fragmentos muy grandes (>5Mb).
  • 10. • Para una duración de pulso dada, aquellos fragmentos de gran tamaño que no hayan tenido tiempo a reorientarse en la nueva dirección del campo no se separan, pero no permanecen inmóviles en el gel; se mueven muy lentamente, pero juntos, sin resolverse en bandas distintas y aparecen como una zona más o menos ancha en la parte superior del gel; dicha zona se denomina zona de compresión.
  • 11. • Es importante destacar que la utilidad de la PFGE es análoga a la de la electroforesis convencional, salvo que los fragmentos de DNA separados son de mayor tamaño. • Esto hace que la transferencia a membranas no pueda hacerse directamente, ya que para tamaños superiores a las 20kb los fragmentos se han de dividir en otros menores mediante radiación UV o tratamiento con ácido (HCl). • También puede ser utilizada para electroforesis bidimensionales, esto permite el mapeo genético de grandes regiones de DNA o de cromosomas enteros pequeños.
  • 12. • El equipo necesario para realizar una PFGE se diferencia notablemente del de otras electroforesis, tanto en la cubeta como en la fuente de alimentación. • La cubeta tiene un conjunto de electrodos en lugar de un par, cuya disposición y diseño posibilitan las distintas orientaciones del campo eléctrico; los electrodos de platino son de mayor grosor que en el resto de las electroforesis, ya que los cambios periódicos de polaridad producen una marcada corrosión de los mismos. • La cubeta tiene, además, un sistema de recircularización del tampón a temperatura estrictamente controlada, de modo que no se produzcan variaciones de temperatura en el gel (Figura 25). • La preparación de los geles de agarosa no difiere de los ya descrito para otras electroforesis de DNA; se utilizan geles de agarosa al 0,5-1,0% (20×20 ó 15×15 cm), de bajo flujo electroendosmótico y elevada resistencia
  • 13. • La preparación y aplicación de la muestra es la fase más delicada de la PFGE por el gran tamaño de las estructuras que se manejan, lo que las hace fácilmente fragmentables. El DNA suele cargarse en el gel como una disolución concentrada (de mucha viscosidad), junto con agarosa fundida o embebido en pequeños bloques o tacos de agarosa sólida. • La utilización de una u otra forma depende del tamaño del DNA a analizar y de la naturaleza de la muestra. • Los fragmentos de 200-300kb pueden cargarse como disoluciones directamente en el gel, pero para fragmentos mayores de 500kb no se suele emplear el DNA aislado como tal y sí las propias células que lo contiene.