Enzimas

ENZIMAS Se llaman enzimas a las sustancias de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible (si bien no pueden hacer que el proceso sea más termodinámicamente favorable). En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en diferentes moléculas, los productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran en tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación (ΔG‡) de una reacción, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reacción. Las enzimas no alteran el balance energético de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reacción, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Una reacción que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho más deprisa que la correspondiente reacción no catalizada. 2310765255905Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las reacciones que ellas catalizan, ni alteran su equilibrio químico. Sin embargo, las enzimas difieren de otros catalizadores por ser más específicas. Las enzimas catalizan alrededor de 4.000 reacciones bioquímicas distintas. No todos los catalizadores bioquímicos son proteínas, pues algunas moléculas de ARN son capaces de catalizar reacciones (como el fragmento 16S de los ribosomas en el que reside la actividad peptidil transferasa). La actividad de las enzimas puede ser afectada por otras moléculas. Los inhibidores enzimáticos son moléculas que disminuyen o impiden la actividad de las enzimas, mientras que los activadores son moléculas que incrementan la actividad. Asimismo, gran cantidad de enzimas requieren de cofactores para su actividad. Muchas drogas o fármacos son moléculas inhibidoras. Igualmente, la actividad es afectada por la temperatura, el pH, la concentración de la propia enzima y del sustrato y otros factores físico-químicos. Clasificación de las enzimas GrupoAcciónEjemplos1. Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción. Tras la acción catálica quedan modificados en su grado de oxidación por lo que debe ser transformado antes de volver a actuar de nuevo. DehidrogenasasAminooxidasaDeaminasasCatalasas 2. Transferasas Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de ciertas moléculas)a otras sustancias receptoras. Suelen actuar en procesos de interconversiones de azucares, de aminoácidos, etc. TransaldolasasTranscetolasasTransaminasas3. HidrolasasVerifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de monómeros a partir de polímeros. Suele ser de tipo digestivo, por lo que normalmente actúan en primer lugar.GlucosidasasLipasasPeptidasasEsterasasFosfatasas4. IsomerasasActúan sobre determinadas moléculas obteniendo de ellas sus isómeros de función o de posición. Suelen actuar en procesos de interconversion.Isomerasas de azúcarEpimerasasMutasas5. LiasasRealizan la degradación o síntesis (entonces se llaman sintetasas) de los enlaces denominados fuertes sin ir acoplados a sustancias de alto valor energético. AldolasasDecarboxilasas6. LigasasRealizan la degradación o síntesis de los enlaces fuertes mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energía como los nucleosidos del ATP.CarboxilasasPeptidosintetasas Estructura enzimática Por su estructura y composición química puede afirmarse que el origen de las enzimas esta vinculando al origen de las sustancias proteicas. Al hablar del origen de la vida se ha citado el éxito de los experimentos realizados en el laboratorio para la producción de aminoácidos; estos aminoácidos son los que precisamente constituyen la base del edificio proteico. También en el laboratorio se ha intentado la síntesis de proteínas a partir de aminoácidos. 15240139700La sede de las enzimas es el citoplasma. Los cloroplastos vegetales contienen una amplia gama enzimas encargadas de la función clorofílica, proceso que a través de reacciones químicas complejas y encadenadas transforman compuestos inorgánicos, como el agua, y el anhídrido carbónico, en sustancias complejas adecuadas para ser entre otras cosas el alimento fundamental de los animales. En las mitocondrias existe un sistema de transporte de electrones que determinan importantes fenómenos de oxidorreducción, durante los cuales se forman notables cantidades de ATP, que es un compuesto altamente energético del que depende la mayor parte de metabolismo, y, por tanto el trabajo de las células; en las mitocondrias se produce el metabolismo enzimático de los ácidos grasos, los cuales son en parte elaborados también en el citoplasma. En los ribosomas tiene lugar concretamente todas la síntesis de las sustancias proteicas, mientras que en los lisosomas se producen enzimas hidrolíticos cuya misión escindir, con la intervención del agua, moléculas grandes en otras menores, que pueden a su vez ser utilizadas por las células; en cambio, las enzimas glucolíticos están difundidos en el citoplasma. La localización de las sedes de las distintas operaciones enzimáticas antes mencionadas ha sido posible a través del sistema de ruptura de las células y de la separación de los distintos componentes mediante centrifugación diferencial del homogeneizado de estas la ruptura celular y la subdivisión de los componentes subcelulares se realizan actualmente utilizando los tejidos, por ejemplo con saltos bruscos desde temperaturas inferiores a 0 C hasta temperaturas más elevadas con cambios de presión osmótica o mediante ultrasonidos. Naturaleza química de las enzimas Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son proteinas. Las más importantes son las siguientes: El análisis de las enzimas obtenidas en forma más pura, criatalizada, demuestra que son proteínas. Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en geeral, la cinética de la desnaturalización térmica de las enzimas da resultados muy parecidos a los de la desnaturalización térmica de las proteínas; por ejemplo el Q10 de la mayoría de las reacciones químicas es de 2 a 3, y, en el casod e las C, la actividad netaenzimas, a temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 aumeta varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalización térmica de las proteínas. Las enzimas son activadas en una zona muy restringida de pH, y presenta un punto óptimo de ph donde su actividad es mayor. Las proteínas en su punto isoeléctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista de viscosidad, solubilidad, difución, etc., que resulta del todo similares a las propiedades de este tipo que muestran las enzimas. Todos los agentes que desnaturalizan a las proteínas también destruyen o inactivan a las enzimas, ya sea el calor, los ácidos fuertes, o los metales pesados que puedesn combinarse con ellas. Los problemas de solubilidad y de precipitación son comunes a las proteínas y las enzimas; en general, son solubles en agua o soluciones salinas, insolubles en alcohol, precipitan con determinadas concentraciones de sales neutras, etc. Composición química de las enzimas Los conocimientos sobre la composición química de las enzimas constituyeron materia de numerosas controversias hasta 1926, cuando J.B Sumner (1887-1955) consiguió cristalizar la ureasa, enzima que transforma la urea en anhídrido carbónico y amoniaco, y demostrar que era una sustancia proteica. A partir de entonces fueron aisladas otras enzimas en forma pura, cristalina, y el análisis demostraba siempre la presencia de una proteína, simple o conjugada. Cuando los análisis químicos demuestran que la enzima es una proteína conjugada, pueden distinguirse en los dos partes bien diferenciados: El grupo prosteico (Coenzima) La proteina (Apoenzima) En algunas enzimas oxidantes fue observada la presencia de la promoproteínas, en las cuales el grupo prostético está representado por un compuesto que contiene Fe y otro elemento, el cual desempeña un papel importante en la combinación de la proteína con el sustrato; otras veces este grupo prostético es derivada de vitaminas (como la vitamina B); en muchos casos resulta fácil de separar de la molécula proteica. No obstante una vez separadas, las dos unidades no muestran actividad enzimático; por tanto el grupo proteico (coenzima) y el grupo proteico (apoenzima) han de estar íntimamente ligados entre sí para ser operativos. Por consiguiente, de las enzimas pueden distinguirse los formados por: Solo proteínas, que difieren entre sí por la secuencia con que los aminoácidos están combinados, como la ureasa y las enzimas digestivas (la pepsina y la tripsina) Los conjugados, separados en dos entidades químicas bien definidas: la coenzima y la apoenzima. Después del descubrimiento de Sumner, el número de la enzimas y el estudio de sus actividades químicas proporcionaron un notable impulso en la enzimología, y la gran cantidad de las enzimas que rápidamente se acumulaban determinaron la necesidad de utilizar una clasificación o nomenclatura para evitar errores y facilitar la comprensión de futuros investigadores. Funciones de las enzimas Las enzimas son sustancias que sirven para acelerar las reacciones químicas, disminuyendo la energía de activación, esto es, la energía necesaria para que la reacción se pueda producir. Químicamente, las enzimas son de naturaleza proteica, hace falta una cantidad muy pequeña y son recuperables, después de producida la reacción. Liberan la energía acumulada en las sustancias para que el organismo la utilice a medida que la necesite. Descomponen grandes moléculas en sus constituyentes simples permitiendo así que por difusión puedan entrar o salir de la célula. Favorecen la digestión y absorción de los nutrientes a partir de los alimentos que ingerimos. Las enzimas descomponen las proteínas, hidratos de carbono y grasas en sustancias perfectamente asimilables: son las enzimas digestivas. La terminación -ASA indica sobre qué tipo de alimento actúa: Las Proteasas son enzimas que digieren proteínas; las Amilasas ayudan a digerir los hidratos de carbono; las Lipasas favorecen la digestión de las grasas; la Sacarasa actúa sobre el azúcar, etc. El ácido clorhídrico del estómago digiere los alimentos más duros como carnes o vegetales muy fibrosos, el calcio, hierro, etc. Su falta produce entre otras enfermedades, la anemia perniciosa. Las enzimas digestivas son muy útiles en casos de hinchazón abdominal, gases y digestiones, en general, muy pesadas. Efecto antiinflamatorio: las enzimas proteolíticas, como la Bromelina de la Piña, inhiben algunos procesos inflamatorios y favorecen a la vez la recuperación de golpes, reabsorción de hematomas o moratones y heridas. Puede ser útil en casos de artritis. Reducen el daño ocasionado por toxinas: las enzimas favorecen la eficacia de nuestro metabolismo ayudando a eliminar las toxinas y metales pesados. Tendrían un efecto desintoxificante o depurativo sobre nuestro organismo. Armonizan el sistema inmunitario o inmunológico: las enzimas ayudan a los glóbulos blancos a luchar contra virus y bacterias pero además al favorecer una correcta digestión o degradación de los alimentos también ayuda a que se produzcan menos alergias alimentarias. Otras funciones o propiedades de las enzimas son eliminar el dióxido de carbono de los pulmones, mejorar nuestra capacidad mental, regular nuestro peso corporal, favorecer la fertilidad, etc. Función de la energía de activación Las energías de activación son barreras energéticas para las reacciones químicas, estas barreras son cruciales para la propia vida. Sin tales barreras energéticas, las macromoléculas complejas revertirían espontáneamente a formas moleculares muchos más sencillas. No podrían existir ni las estructuras complejas y altamente ordenadas ni los procesos metabólicos que tienen lugar en cada célula. Proporcionar energía para comenzar una reacción química. Lograr que las enzimas aceleren reacciones, disminuyendo su energía. La energía de activación de una reacción es la energía necesaria para alinear los grupos químicos reactivos, desestabilizar brevemente sus cargas eléctricas y reordenar, formar y romper enlaces. La energía de activación impulsa a los sustratos hacia el estado de transición, en el cual la reacción puede proceder en forma espontanea hacia los productos o de nuevo hacia los sustratos. Energía libre de activación Este máximo de energía representa el estado de transición en el cual se forma el intermediario rico en energía durante la conversión de los reactivos en los productos. Debido a la gran energía de activación que separa a los reactivos de los productos, a menudo la misma reacción es más lenta si no es catalizada, que si la cataliza una enzima. Velocidad de reacción Las moléculas que reaccionarán en un evento químico, deben contener suficiente energía para sobrepasar la energía de activación del estado de transición en su camino para transformase en los productos. En ausencia de la enzima, solo una pequeña porción de la población de estas moléculas posee la energía suficiente para realizar la transición hacia los productos. La velocidad de la reacción estará determinada por el número de moléculas que se encuentren en ese estado energético particular. En general, al disminuir la energía de activación, la mayoría de las moléculas tienen energía suficiente para pasar sobre el estado de transición y por tanto aumenten la velocidad de la reacción. Definiciones Cofactores enzimáticos La actividad de algunas enzimas depende solamente de su estructura como proteína, mientras que otras necesitan, además, uno o más componentes no proteicos, llamados Cofactores. El cofactor puede ser un ion metálico o bien una molécula orgánica, llamada coenzima, aunque algunos enzimas necesitan de ambos. El cofactor puede estar fuertemente unido a la proteína (suele ser el ión metálico, aunque puede igualmente ser un coenzima) y recibe entonces el nombre de grupo prostético, o débilmente unido, por lo que en realidad actúa como un sustrato específico de la enzima (co-sustrato; suele ser una molécula orgánica, coenzima). El complejo enzima-cofactor catalíticamente activo recibe el nombre de holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la proteína restante, que por sí misma es inactiva catalíticamente, se designa con el nombre de apoenzima. Holoenzima = Apoenzima + Cofactor En las enzimas el cofactor puede actuar como centro catalítico primario, grupo puente para reunir el sustrato y la enzima ó agente estabilizante de la actividad enzimática (conformación). Por su parte cada uno de los coenzimas catalogados suele contener en su estructura, alguna vitamina (sustancias orgánicas que, en cantidades mínimas, son vitales para el funcionamiento de todas las células, y deben figurar en la dieta de algunas especies) o molécula derivada de ella. Las coenzimas actúan por lo general como transportadores intermedios de átomos específicos o de electrones. Coenzima Una coenzima es una molécula orgánica pequeña necesaria para la actividad de una enzima. Las coenzimas son cofactores de naturaleza orgánica. 15240139065Una coenzima es un cofactor de naturaleza orgánica. Las coenzimas son necesarias para la actividad de muchas enzimas. La tetrahidrobiopterina, el ATP, el GTP, el NAD, la coenzima A o la coenzima Q son algunos ejemplos de coenzimas. Muchas coenzimas son vitaminas o derivados de ellas especialmente de la vitamina B. Normalmente sufren reacciones de oxidación, reducción y transferencia de grupos químicos. Las coenzimas sufren las transformaciones químicas necesarias para la catálisis enzimática evitando que la enzima las sufra. De este modo la enzima queda intacta y puede llevar a cabo otro ciclo de reacciones simplemente cambiando la coenzima. Las coenzimas tienen un papel fundamental en el metabolismo y en la fisiología del organismo y, de hecho, hay muchas enfermedades producidas por defectos en coenzimas. Algunos ejemplos de este tipo de enfermedades son la fenilcetonuria en la que existe un defecto de tetrahidrobiopterina o la pelagra que se produce por un déficit de NAD (Nicotina mida Adenina Di nucleótido). Apoenzima La apoenzima es la parte proteica de una enzima, desprovista de los cofactores o coenzimas que puedan ser necesarios para que la enzima sea funcionalmente activa. La apoenzima es catalíticamente inactiva; cuando se le une la coenzima o cofactor adecuados, constituye la holoenzima, o enzima activa. Fracción proteica de las enzimas heteroproteínicas. Es la que da a la enzima su especificidad y determina la velocidad de la reacción catalítica. La otra parte de la enzima es la coenzima o grupo prostético Holoenzima Una holoenzima es una enzima que está formada por una proteína (apoenzima) y un cofactor, que puede ser un ion o una molécula orgánica compleja unida (grupo prostético) o no (una coenzima). En resumidas cuentas es una enzima completa y catalíticamente activa. Grupo prostético Un grupo prostético es el componente no aminoacídico que forma parte de la estructura de algunas proteínas y que se halla fuertemente unido al resto de la molécula. Las proteínas con grupo prostético reciben el nombre de heteroproteínas (o proteínas conjugadas). Hay enzimas que son proteínas conjugadas; se trata de enzimas que requieren algún cofactor (metálico u orgánico) y éste se halla ligado con fuerza de manera permanente en la estructura molecular. Si un cofactor enzimático (metálico u orgánico) sólo se une a la enzima durante la catálisis no debe ser considerado un grupo prostético. Control enzimático: Sitio competitivo 5334050800Los inhibidores reversibles se unen a las enzimas mediante interacciones no covalentes tales como los puentes de hidrógeno, las interacciones hidrofóbicas y los enlaces iónicos. Los enlaces débiles múltiples entre el inhibidor y el sitio activo se combinan para producir una unión fuerte y específica. Al contrario de lo que ocurre con el sustrato y los inhibidores irreversibles, los inhibidores reversibles generalmente no experimentan reacciones químicas cuando se unen a la enzima y pueden ser eliminados fácilmente por dilución o por diálisis. Existen tres tipos de inhibidores reversibles. Se clasifican en base al efecto producido por la variación de la concentración del sustrato de la enzima en el inhibidor. En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir a la misma enzima al mismo tiempo, como se muestra en la figura. Esto generalmente ocurre cuando el inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio activo de la enzima. Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficientemente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibidor. Los inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al sustrato verdadero. La inhibición competitiva ocurre en el sitio de unión del sustrato (catalitico). La estructura química de un inhibidor (I) análogo del substrato se semeja la estructura del mismo. Puede por lo tanto convertirse reversiblemente con la enzima formando un complejo enzima-inhibidor (EnzI) en lugar de un complejo enzima-substrato (EnzS). Cuando tanto el substrato como este tipo de inhibidor se encuentran, compiten por los mismos sitios de unión sobre la superficie de la enzima. Las enzimas pueden ser inhibidas por moléculas específicas. Los inhibidores pueden unirse reversible o irreversible a las enzimas. Los inhibidores irreversibles se unen covalentemente a residuos aminoacídicos con la enzima impidiendo su acción. Los inhibidores reversibles se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que se producen entre las enzimas y los sustratos que dentro de ellos se encuentran los inhibidores competitivos y no competitivos. El inhibidor competidor tiene una estructura similar a a del sustrato por lo que tiene la posibilidad de formar un complejo. El competidor que no permite formar el complejo no da producto y disminuye el número de moléculas de electrones libres en condiciones interaccionar con el, la unión de IC a la enzima es irreversible. Control enzimático: No competitivo o Alostérico Esta inhibición se caracteriza porque no se puede revertir el efecto del inhibidor, aumentando la concentración del substrato. Por ejemplo la inhibición de la deshidrogenasa del gliceraldehido-3-fosfato por la yodo-acetamida: Enzima-SH + I-CH2 CONH2 Enzima-SCH2 CONH2 + IH La deshidrogenasa del gliceraldehido-3 fosfato puede ser inhibida también por el ácido iodo-acético: Enzima-SH + ICH2 COOHEnzima-SCH2 COOH + IH 3177540229235La inhibición no competitiva (o alostérica) es un tipo de inhibición que reduce la tasa máxima de una reacción química (Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unión del catalizador por el sustrato (KmApp en el caso de una enzima de inhibición, véase cinética de Michaelis-Menten). La inhibición no competitiva normalmente se aplica a enzimas y difiere de la inhibición competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la enzima (este otro sitio se denomina sitio alostérico). Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por la enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima. Este cambio en la forma implica que la enzima deja de ser capaz de unirse correctamente al sustrato. Esto reduce la concentración de enzima \"
activa\"
resultando en una disminución de la Vmax. En este tipo de inhibición, no hay competición entre en inhibidor y el sustrato, así que incrementar la concentración del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimática. Cabe destacar que aunque la inhibición no competitiva generalmente implica que el inhibidor no se une al sitio activo de la enzima, el inverso no es cierto: la inhibición competitiva puede ser debida a una competición por el sitio activo, o por inhibición competitiva alostérica. Compárese ahora la Fig. 2.19 con la gráfica de la inhibición competitiva. ¿Cuál es la diferencia? Que en esta nueva grafica hay una curva de saturación, como en el otro caso, pero, por más que se aumente la concentración de agonista no puede llegarse al flujo que habría si no estuviera el antagonista en el medio. Esto se debe a que, en este caso. El antagonista tiene una afinidad por el sitio que es mucho mayor que la afinidad del agonista mismo flujo de glucosa es menor. No hay posibilidad de \"
competencia\"
ni que el agonista desplace al antagonista. Se habla, entonces, de la formación de una unión irreversible entre el antagonista y el transportador. Las enzimas, y por tanto el control metabólico, puede ser afectado por ciertos metabolitos reguladores (efectores, modificadores o moduladores). Estos metabolitos pueden inhibir o activar la actividad enzimática. Hay enzimas que no siguen la cinética de Michaelis-Menten. Cuando la velocidad de reacción V se grafica contra la concentración de sustrato, estas enzimas son complejos con múltiples componentes difíciles de aislar, se trata de enzimas reguladoras conocidas como enzimas alostéricas. De estas se pueden distinguir tres clases: 1) Homotrópicas: Aquí el sustrato puede actuar como efector sobre la rapidez de la reacción enzimática, por lo general, incrementándola. 2) Heterotrópicas: La inhibición o estimulación es causada por sustancias de origen natural que no sea el sustrato. 3) Mixtas: Algunas enzimas muestran ambas características. El la inhibición no competitiva el incremento de la concentración del sustrato no reduce el incremento el efecto inhibidor con grupos químicos diferentes de la enzima, sino a algún grupo químico situado en un lugar distinto de la molécula enzimática, esencial para su función. La fijación del inhibidor, por lo tanto bloquea la fijación del sustrato y viceversa. Sin embargo, la enzima se inactiva cuando se fija el inhibidor con dependencia de que también esté unido o no el sustrato. De esta manera ciertos reactivos químicos pueden combinarse de forma reversible con los grupos sulfhidrilo (SH), esenciales para la actividad catalítica de muchas enzimas y se localizan a cierta distancia del centro activo. Un ejemplo conocido es el ácido iodoacético, el cual inhibe la transformación de glucosa en acido láctico a nivel muscular. Este inhibidor reacciona con el grupo sulfhidrilo, esencial para que la enzima gliceraldehido-fosfato-deshidrogenasa sea activa catalíticamente. La adición de sustrato en exceso no va a provocar el desplazamiento del inhibidor unido a la enzima. Tipo de controles bioquímicos. Alteración de la actividad enzimática. Control por sustrato Control alostérico Control por retroalimentación Simple Secuencial Múltiple Concertado Acumilativo Control integral mediante la carga energética Modificación de la enzima a) Modificación irreversible b) Modificación reversible B. alteración en el número de moléculas de la enzima. Control transcripcional. Control traduccional. Degradación de la enzima. En esta sección nos centraremos en el control por retroalimentación Control por retroalimentación El método por el cual las enzimas reguladoras con comportamiento alostérico controlan varias vías en su forma más simple, el que se conoce como retroinhibición o inhibición por producto final. Se ha encontrado que estas enzimas alostéricas se localizan en o cerca del comienzo de una vía enzimática y que son inhibidas o estimuladas por el producto final de esa vía. Muchos de estos tipos de control han sido investigados en la síntesis de aminoácidos en E. coli y se pueden identificar en muchos sistemas. Control por retroalimentación simple Un ejemplo de este tipo de control se encuentra en la síntesis del aminoácido isoleucina en la E. coli. Aquí, si se permite que se forme la isoleucina inhibirá la actividad de la treonina desaminasa, la primera enzima en la cadena de la síntesis. Control por retroalimentación secuencial En ese caso, los productos de una ruta ramificada sólo afectan a la enzima que actúa desde el punto de ramificación, y el punto de ramificación intermedio afecta la vía común. Un ejemplo de esta forma de control es la síntesis de los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y triptófano en Bacillus subtilis. La formación de triptófano, fenilalanina y tirosina, inhibe las enzimas en el punto de ramificación, lo cual provoca la formación de ácido corísmico. El exceso de ácido corísmico, a su vez, inhibe las primeras enzimas de la secuencia que conduce a este ácido. En el presente caso las enzimas reguladoras en el punto de ramificación de una vía enzimática, tienen sitios múltiples para efectores alostéricos diferentes, de modo que la inhibición completa se puede lograr sólo cuando ambos efectores estén presentes. Un ejemplo es el efecto de la fenilalanina y la tirosina sobre la enzima que forma al ácido frénico a partir del ácido corísmico. Control enzimático múltiple La característica de este tipo de control es que la enzima en el comienzo de una ruta ramificada se presenta en más de una forma, cada una de las cuales es inhibida por uno de los productos finales. Un ejemplo es el control de la lisina, metionina y la isoleucina en la E. coli con la enzima controlante, asparto cinasa, que se presenta en tres formas, las cuales son afectadas en forma separada por la lisina, historina e isoleucina. Control por retroalimentación acumulativa Esto ocurre en algunas enzimas regulatorias donde los productos finales de la vía son muy diferentes. La enzima tiene múltiples sitios alostéricos en los que los efectores originan individualmente sólo la inhibición parcial. Se requieren cantidades saturantes de todos los efectores para completar la inhibición. Un ejemplo de esta case de control es la enzima glutamina sinteasa, la cual participa en las vías que conducen a varios compuestos como la histidina, el triptófano y la glucosamina-6-P. Sistemas procarióticos Los procariotas tienen cromosomas individuales en forma superior – arrollada. La expresión genética correcta en los procariotas depende de las secuencias de ADN que flanquean las secuencias de instrucciones. La transcripción de los genes requiere RNA polimerasas, que pueden tener asociados los factores polipeptídicos sigma y rho. El factor sigma promueve la unión de la RNA polimerasa al ADN en sitios específicos ubicados justo antes de las secuencias de instrucciones de la proteína, conocidos como región del promotor (figura 8.2.7). Algo importante en el sitio del promotor, son diez nucleótidos ubicados antes de su comienzo, conocidos como la caja de Pribnow y que contienen la secuencia TATAAT. El segundo sitio está aproximadamente de 23 a 25 nucleótidos cuesta arriba, con la secuencia TTGACA. En los genes cuya secuencia de bases de la región del promotor se ha analizado, se ha encontrado poca variación entre los promotores que puede tener algún efecto sobre la resistencia del promotor y la longitud de la copia. Alteración de la regulación por retroalimentación La regulación por retroalimentación es el control que utilizan los microorganismos para evitar la superproducción de aminoácidos y nucleótidos. Para eliminar este control se han empleado dos tipos de manipulaciones: alteración de la acumulación de productos finales y obtención de mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación. 1.- Alteración de la acumulación de productos finales A. Evitar la acumulación de productos finales. En una ruta metabólica sencilla (no ramificada) la limitación de la capacidad de la célula para acumular intracelularmente productos finales inhibidores o represores, se utiliza generalmente para la superproducción de algún intermediario de esta ruta metabólica. En el siguiente esquema se representa este principio: Si nosotros deseamos obtener una superproducción del producto intermediario C en una ruta metabólica sencilla donde el producto final E por retroalimentación inhibe al enzima a y reprime a los enzimas a y b, lo primero que se hace es obtener un mutante auxótrofo que le falte el enzima c. Al no poder sintetizar el producto E, este mutante requiere para su crecimiento que se añada en el medio E. Si se añaden bajos niveles de E, los necesarios para que el microorganismo crezca, éste microorganismo no podrá acumular concentraciones de E que inhiban o repriman a los enzimas a y b con lo que será posible obtener una gran acumulación de C. Mediante este tipo de manipulación se ha conseguido por ejemplo, que un mutante de Corynebacterium glutamicum auxótrofo en Arginina produzca 26 gramos/litro de L-Ornitina.B. Acumulación de productos finales Se utiliza en rutas metabólicas ramificadas. Consideremos una ruta metabólica ramificada que conduce a dos productos finales, A y B. Con frecuencia, si conseguimos disminuir la concentración de B, el producto A se acumularía. El ejemplo más importante, con interés comercial, de la utilización de esta estrategia es la superproducción de lisina. Este aminoácido se utiliza como aditivo nutritivo, puesto que la mayoría de las proteínas de cereales son deficientes en este aminoácido. Pertenece a la familia del aspartato y se produce en la mayoría de las bacterias en una ruta metabólica ramificada que produce además metionina, treonina e isoleucina. En Escherichia coli, el primer paso de esta ruta está regido por tres aspartato quinasas, cada una de las cuales está regulada por un producto final diferente y, además, cada producto final regula el primer enzima después de cada ramificación. Sin embargo, en los microorganismos utilizados en la fermentación para la producción de lisina (Corynebacterium glutamicum) existe una única aspartato quinasa regulada por un mecanismo concertado de retroalimentación por la treonina y lisina. Así mismo, tampoco poseen regulación en la ramificación. Mediante la eliminación genética del enzima homoserina deshidrogenasa, se obtiene un mutante que no puede crecer salvo que se añada en el medio metionina y treonina. Mientras que los niveles de treonina que se añadan sean bajos, pero suficientes para el crecimiento del microorganismo, no se producirá una inhibición por retroalimentación de la aspartato quinasa, con lo que estos microorganismos son capaces de producir 50 gramos de L-lisina por litro. 2.- Mutantes resistentes a la regulación por retroalimentación Una segunda vía para eliminar la regulación por retroalimentación y así obtener una superproducción de metabolitos primarios es alterando la estructura del enzima sujeto a la inhibición o modificando los genes reguladores de tal manera que el sistema no sea reprimible.El sistema más sencillo para aislar estos mutantes es seleccionar las cepas resistentes a los efectos tóxicos que produce un análogo del compuesto que nos interesa. Para ello se someten a mutación los microorganismos y, posteriormente se siembran en placa en presencia del análogo. Aquellas cepas que son capaces de crecer y formar colonias son las que se seleccionan. Algunos de estos mutantes resistentes serán superproductores del metabolito que nos interesa. D' A --------> B --------> C -------->D Si el análogo D' inhibe la síntesis de D, el microorganismo no puede producir este metabolito y muere. Por el contrario, si D' no inhibe la síntesis de D, el microorganismo seguirá produciendo D y sobrevivirá. En este caso puede haber ocurrido una alteración en la estructura del enzima, con lo que obtenemos mutantes resistentes a la inhibición por retroalimentación. O bien, puede haber ocurrido una alteración en el sistema de síntesis del enzima, con lo que obtenemos mutantes resistentes a la represión por retroalimentación. En cualquier caso y debido a la alteración de estos controles, el microorganismo superproduce D. La regulación por retroalimentación, un mecanismo por el cual se regula la secrección hormonal. Cuando existe un aumento en la concetración en sangre de una hormona, se provoca la disminución de la secreción de ésta por parte de la glándula correspondiente. El mecanimo es el siguiente: El hipotálamo al detectar la alta concentración de la hormona en sangre inhibe la secreción del factor liberador correspondiente. La hipófisis al no ser activada por éste, disminuye la liberación de la hormona trófica correspondiente y, por consiguiente, la glándula disminiuirá también la liberación de la hormona en sangre.

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